Diese Arbeit wurde zum Teil von der PhRMA-Stiftung und einem Research and Scholar Award der University of Maryland, College Park, finanziert. Wir danken Prof. Darrell Irvine für die Unterstützung der ersten Arbeiten, die bei der Fertigstellung der"In-situ-Engineering des Lymphknoten-Mikroumgebung sperekten Durchdriniierung von adjuvant-releasing Polymerpartikeln" durchgeführt wurden. 5

Alle Tierstudien in diesem Protokoll wurden in Übereinstimmung mit den Bundes-, Landes- und lokalen Richtlinien abgeschlossen und unter Verwendung von Protokollen, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland überprüft und genehmigt wurden.
1. Synthese von lipidstabilisierten Mikro- und Nanopartikeln
<ol><li>In einer 7 ml Glasdurchstechflasche(en) DOPC,DSPE-PEG und DOTAP Lipide in einem Molarenverhältnis von 60:20:20 kombinieren, um eine Master-Lipidmischung vorzubereiten.<ol>
<li>Zur Synthese einer einzelnen Probe: Übertragen Sie 242,9 l, 287,4 l und 71,9 l von DOPC, DSPE-PEG bzw. DOTAP mit 2 ml serologischen Pipetten aus Glas in die Durchstechflasche.</li>
		<li>Um mehrere Proben zu synthetisieren: Multiplizieren Sie jedes Lipidvolumen oben mit der Anzahl der Proben und kombinieren Sie sie in einer einzigen Durchstechflasche, und übertragen Sie dann gleiche Aliquots dieser Lipidmischung in Fläschchen, die jeder zu bereitenden Probe entsprechen.</li>
		<li>Trocknen Sie Lipide unter einem sanften Strom von Stickstoffgas für 10 min, oder über Nacht in den Vakuumofen stellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In einer einzigen, leeren 20 ml Glasdurchstechflasche 80 mg PLGA in 5 ml Dichlormethan für jede Partikelprobe auflösen, um eine 16 mg/ml Polymerstofflösung zu erzeugen.</li>
	<li>5 ml Polymerlösung in die Durchstechflasche geben, die die getrockneten Lipide, Kappe und Wirbel für 30 Sek. enthält.</li>
	<li>So synthetisieren Sie Mikropartikel:<ol>
<li>Beginnen Sie mit der Beschallung der organischen Phase, die das Polymer, Lipid und andere wasserunlösliche Ladung auf Eis bei 12 W mit einem Beschallungsgerät enthält.</li>
		<li>Erstellen Sie die Wasser-in-Öl-Emulsion (w/o) mit einer Pipette, um 500 l destilliertehupteH2O oderH2O mit 1 mg Peptid, Protein oder anderer wasserlöslicher Ladung hinzuzufügen.</li>
		<li>30 Sek. bei 12 W auf Eis weiter beschallen, die Durchstechflasche sanft nach oben und unten schaukeln und seitlich um die Beschallungsspitze kreisen, um eine vollständige Emulgierung zu gewährleisten.</li>
		<li>Erstellen Sie die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion (w/o/w) durch Gießen der w/o-Emulsion in 40 mlH2O in einem 150 ml Becherglas.</li>
		<li>Mit einem digitalen Homogenisator 3 min bei 16.000 Umdrehungen pro Minute homogenisieren.</li>
		<li>Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu, übertragen Sie den Becher auf eine Rührplatte und lassen Sie die w/o/w-Emulsion über Nacht rühren, um das überschüssige Lösungsmittel zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>So synthetisieren Sie Nanopartikel:<ol>
<li>Beginnen Sie mit der Beschallung der organischen Phase, die die Polymer-, Lipid- und andere wasserunlösliche Ladung auf Eis bei 14 W enthält.</li>
		<li>Erstellen Sie die w/o-Emulsion, indem Sie eine Pipette verwenden, um 500 l destilliertehupH2O oderH2O mit 1 mg Peptid, Protein oder anderer wasserlöslicher Ladung hinzuzufügen.</li>
		<li>30 Sek. bei 14 W auf Eis weiter beschallen.</li>
		<li>Erstellen Sie die w/o/w-Emulsion, indem Sie die w/o-Emulsion auf 40 mlH2O in ein 150 ml Becherglas gießen und 5 min bei 16 W auf Eis beschallen. Schaukeln Sie die Durchstechflasche vorsichtig nach oben und unten und seitlich um die Beschallungsspitze, um eine vollständige Emulgierung zu gewährleisten.</li>
		<li>Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu, übertragen Sie den Kolben auf eine Rührplatte und lassen Sie die w/o/w-Emulsion über Nacht rühren, um das überschüssige Lösungsmittel zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am nächsten Morgen, waschen und sammeln Partikel:<ol>
<li>Gießen Sie Emulsion durch 40 'm Nylon-Netzzellensieb in ein 50 ml konisches Rohr.</li>
		<li>Zentrifugenpartikel für 5 min bei 5.000 x g für Mikropartikel oder 5 min bei 24.000 x g für Nanopartikel.</li>
		<li>Dekantieren überstand und waschen Partikel durch Wiederaufsetzen in 1 mlH2O.</li>
		<li>Schwebeteilchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.</li>
		<li>Zentrifuge für 5 min bei 5.000 x g für Mikropartikel oder 5 min bei 24.500 x g für Nanopartikel.</li>
		<li>Waschen Sie die Partikel zweimal, indem Sie überstand, in 1 mlH2O wieder aufhängen und zentrifugieren wie in Schritt 1.6.5. Nach dem Waschen Partikel in 1 mlH2O zur sofortigen Verwendung aussetzen oder Lyophilize für eine längere Lagerung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Messung der Syntheseausbeute
<ol><li>Eine leere 20 ml Glasflasche vorwiegen. Fügen Sie der vorgewogenen Durchstechflasche 100 l Partikelsuspension hinzu, nachdem Sie mit einer Mikropipette nach oben und unten gepfnet haben.</li>
	<li>Lyophilisieren Sie die Partikel oder trocknen Sie unter einem sanften Stickstoffstrom.</li>
	<li>Wiegen Sie die Durchstechflasche, die das getrocknete Polymer enthält. Bestimmen Sie die Partikelausbeute in der Durchstechflasche, indem Sie das ursprüngliche Gewicht der Durchstechflasche von der Masse der Durchstechflasche subtrahieren, die die getrockneten Partikel enthält.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Gesamtpartikelausbeute, indem Sie die Partikelmasse in der Durchstechflasche mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren. Um die prozentuale Ausbeute zu bestimmen, dividieren Sie die Partikelmasse durch die maximale theoretische Eingangsmasse und multiplizieren Sie sie mit 100 %.</li>
</ol>3. Bestimmung der Partikelgröße
<ol><li>Reinigen Sie die mitgelieferte Glasfraktionszelle im Küvetten-Stil, indem Sie sie mit entionisiertem Wasser füllen und mit wattestäblichem Tupfer abwischen. Übertragen Sie 10 ml destilliertesH2O in die gereinigte Fraktionszelle, fügen Sie einen magnetischen Mikrorührstab hinzu und laden Sie die Bruchzelle in die Zellhalterung des Partikelgrößenanalysators.</li>
	<li>Passen Sie die magnetische Rührgeschwindigkeit im Partikelanalysator an, um eine vollständige Durchmischung in der Bruchzelle zu erreichen und schließen Sie die Fachtür.</li>
	<li>Richten Sie die Laser über die Instrumentensoftware-Schnittstelle an der Bruchzelle aus.</li>
	<li>Verwenden Sie die Instrumentensoftware-Schnittstelle, um einen Basiswert mit der Bruchzelle aufzuzeichnen, die nur destilliertes H2O enthält.</li>
	<li>Pipette die ursprüngliche Partikelsuspension nach oben und unten mit einer Mikropipette zu mischen.</li>
	<li>Pipette 10 l Partikelsuspension (in der Regel ca. 0,5 mg) in die Bruchzelle. Stellen Sie sicher, dass das Volumen der Partikelprobe, die der Zelle zugesetzt wird, ausreicht, um eine Signalstärke im entsprechenden Bereich zu erzeugen, wie auf der Gerätesoftware-Schnittstelle angegeben. Die tatsächliche Masse der benötigten Partikel hängt von der prozentualen Ausbeute und den optischen Eigenschaften der Partikelprobe ab.</li>
	<li>Schließen Sie die Partikelgrößenanalysatorfachtür und messen Sie die Partikelgröße mit einem Brechungsindex von 1,60 für PLGA.</li>
	<li>Verwenden Sie die Software-Schnittstelle, um den Partikeldurchmesser anhand einer Zahlenbasis zu berechnen.</li>
</ol>4. Visualisierung von Partikeln
<ol><li>Pipette Partikel Suspension nach oben und unten mit Mikropipette zu mischen. Partikelsuspension in entionisiertem Wasser auf 1 mg/ml verdünnen.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Mikroskopschlitten vor, indem Sie 3 l verdünnte Partikelsuspension hinzufügen und einen Abdeckschlupf in einem 45°-Winkel montieren, um Blasenbildung zu vermeiden. Platzieren Sie das Dia auf der Mikroskopbühne und das Bild mit den entsprechenden Filtersätzen für jede fluoreszierende Ladung.</li>
</ol>5. Vorbereitung von Mäusen für i.LN. Injektion
<ol><li>Tracer-Farbstofflösung vorbereiten:<ol>
<li>Bereiten Sie eine 0,1% (w/v) Lösung des Tracerfarbstoffs vor, indem Sie 10 mg Farbstoffpulver mit 10 ml destilliertem H2O auflösen.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Farbstofflösung in eine Glasdurchstechflasche mit einem 0,2 m Spritzenfilter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einen Tag vor der Injektion beanmaßen Sie die Maus mit Isofluran gemäß einem von der IACUC zugelassenen Tierprotokoll. Um die Tiefe der Anästhesie zu bewerten, führen Sie einen Zehenkneifenreflextest durch und überwachen Sie die Atemfrequenz, um eine Atemfrequenz von etwa 100-140 Atemzügen pro Minute zu gewährleisten.</li>
	<li>Rasieren Sie Haare an der Basis des Schwanzes und Hinterviertel mit Clippers, während die Maus beästhestisiert wird. Entfernen Sie das Haar von der ventralen Seite des Tieres und seitlich um die dorsale Seite knapp über dem Gelenk des Hinterbeins (Hüfte).</li>
	<li>Tracerfarbstoff injizieren.<ol>
<li>Verwenden Sie für jede Farbstoffinjektion eine Mikropipette, um 10 l Farbstofflösung in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen, und saugen Sie die gesamte 10 l in eine 31G-Nadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist.</li>
		<li>Injizieren Sie 10 l Farbstofflösung subkutan auf jeder Seite der Schwanzbasis, wo das Haar abgeschnitten wurde, nachladen zwischen den Injektionen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie das restliche Haar, indem Sie eine milde Enthaarungscreme über Wattestäbchen auftragen. Achten Sie darauf, den Bereich zwischen hinteren Oberschenkel und Bauch zu beschichten.</li>
	<li>Enthaarungscreme 3 min auf der Haut brüten lassen. Nach der Inkubation die nasse Hand mit warmem H2O und die Enthaarungscreme vorsichtig in die Haut reiben.</li>
	<li>Entfernen Sie sofort Enthaarungscreme durch Benetzung der Hand mit warmer H2O und reiben den Schwanzboden und das Hinterviertel. Wiederholen Sie dies, bis die überschüssige Enthaarung entfernt ist, und achten Sie darauf, die Hand nass zu halten, um Reizungen zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Restenthaarung von der Maus, indem Sie ein weiches Tuch oder Papiertuch mit warmemH2O und in einer einzigen Bewegung benetzen, wobei der untere Teil der Maus abwischt wird. Vermeiden Sie eine Reibbewegung, um Abrieb oder Hautschäden an der Maus zu verhindern.</li>
	<li>Lassen Sie die Maus unter einer Wärmelampe erholen und zum Halten zurückkehren.</li>
</ol>6. i.LN. Injektion von Partikeln
<ol><li>Am folgenden Tag beanmaßen Sie die Maus mit Isofluran gemäß einem von der IACUC zugelassenen Tierprotokoll.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Maus, um die Drainage des Tracerfarbstoffs in jeden Leistenlymphknoten zu bestätigen. Der Lymphknoten sollte als dunkler Fleck in der Nähe von Hinterschenkf und Bauch sichtbar sein.</li>
	<li>Bereiten Sie Partikelinjektionslösung vor:<ol>
<li>Partikel in destilliertemH2O bei gewünschter Injektionskonzentration wieder aufsetzen. Verwenden Sie für jede Injektion eine Mikropipette, um 10 l Partikellösung in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen.</li>
		<li>Die gesamte 10 l in eine 31G Insulinnadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist, ansaugen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injektion der Partikeldosis:<ol>
<li>Nach der Visualisierung von LN, straffen Sie die Haut um LN mit Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger, um die Haut zu verspotten und eine kontrollierte Platzierung des Injektionsvolumens zu ermöglichen.</li>
		<li>Nähern Sie sich dem LN mit der Nadel in einem 90°-Winkel zur Haut und durchdringen Sie die Haut über den gefärbten LN bis zu einer Tiefe von 1 mm.</li>
		<li>Injizieren Sie langsam das gesamte Volumen. Während der Injektion, beobachten Sie das LN-Volumen durch die Haut, um die Injektion durch sichtbare LN-Vergrößerung zu bestätigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie die Maus unter einer Wärmelampe erholen und kehren Sie zum Halten zurück oder führen Sie zusätzliche Tests durch.</li>
</ol>Für relevante Analysetechniken(z.B. Histologie, Durchflusszytometrie) siehe JoVE Artikel 265, 1743 und 3054 und aktuelle Protokolle in der Immunologie,Kapitel 5 und 2115-22.

<ol>
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Produktionskosten und Zugangsgebühren für diese Artikel wurden teilweise von HORIBA, Ltd. gesponsert.

Die in diesem Protokoll beschriebene Technik ermöglicht die kontrollierte Abgabe von Impfstoffen an LNs und an LN-residente Antigen-präsentierende Zellen. Biomaterial verkapselte Ladung kann innerhalb der LN lokalisiert werden, so dass die Dosen einer oder mehrerer Arten von Fracht, die an die LN-Mikroumgebung geliefert werden, manipuliert werden können. Die Lokalisierung und kontrollierte Freisetzung von Polymerpartikeln hat gezeigt, dass eine starke zelluläre und humorale Immunantwort bei deutlich niedrigeren Dosen als herkömmliche Ansätze erzeugt wird. Darüber hinaus kann durch die Manipulation der Biomaterialträgergröße die primäre Art der zellulären Verarbeitung zwischen der direkten Aufnahme von Nanopartikeln oder der extrazellulären Ladungsfreisetzung aus größeren Mikropartikelnmoduliertwerden 5 . Diese Ergebnisse belegen die Machbarkeit der i.LN. Biomaterial-Lieferung als Plattform für die therapeutische Impfstoffabgabe.
Die Synthese von PLGA-Partikeln durch Emulsion/Lösungsmittelverdampfung wurde in Anwendungen zur Arzneimittelabgabe weit verbreitet23,24. Potenzielle Herausforderungen im Zusammenhang mit dieser Technik betreffen daher vor allem die erfolgreiche Identifizierung und Ablagerung von Impfstoffen am LN-Zielstandort. Obwohl die Verwendung von Tracerfarbstoff die Visualisierung der gezielten Leisten-LNs erleichtert, sind die Zielgröße und -tiefe unter der Haut klein. Daher empfehlen die Autoren, Zeit und Mäuse für die Zubereitung und Injektion von Mäusen zu zuteilen. Während der Tiervorbereitung(d.h. Rasur und Anwendung der Enthaarung) sollte darauf geachtet werden, die Mäuse nicht auf der ventralen Seite des Tieres zu schneiden, wo der Winkel des Beins mit dem Bauch die Haut anfälliger für Verletzungen durch Clippers macht. Darüber hinaus sollte alle Enthaarungsmittel mit warmem Wasser entfernt werden, um zu verhindern, dass Tiere die Creme während des normalen Pflegeverhaltens vernehmen. Um LN-Injektionen zu praktizieren, kann eine höhere Tracer-Farbstoff-Konzentration verabreicht und Praxistiere eingeschläfert und dann mehrmals injiziert werden. Nach der Injektion können Mäuse nekroropiniert werden und die Größe von LNs von injizierten Tieren kann mit einer nicht injizierten Kontrolle LN verglichen werden. Eine Einschränkung dieser Technik ist die physikalische Grenze des Injektionsvolumens, die in die LN-Struktur geladen werden kann. Unser Protokoll schlägt ein Injektionsvolumen von 10 l bei Mäusen vor, obwohl andere Studien größere Injektionsvolumina von mindestens 20 l berichtet haben.13 Die direkte Lieferung von Impfstoffen über i.LN. Die Injektion ermöglicht jedoch eine dramatische Dosisersparnis, so dass die Funktion dieser Impfstoffe in der Regel nicht durch Volumenbeschränkungen eingeschränkt werden sollte.
Wie bereits erwähnt, ist die Änderung der physikalischen Eigenschaft der Partikel(d. h. Größe) ein effektiver Mechanismus, um den Durchweg oder die Ergebnisse zu verändern, die durch Biomaterialien und verkapselte Ladungen im LN-Gewebe induziert werden. Das Emulsions-/Lösungsmittelverdampfungsprotokoll kann leicht geändert werden, um physikalische oder chemische Eigenschaften wie Oberflächenladung oder Funktionalität und die Rate der biologischen Abbau-/Ladungsfreisetzung23,24zu verändern. Beispielsweise kann die Freisetzungskinetik durch alternative Polymerzusammensetzungen abgestimmt werden, und die Oberflächenfunktion kann mit modifizierten Lipidzusammensetzungen oder Poly(Vinylalkohol) verändert werden. Die in Partikel verladene Ladung kann leicht manipuliert werden, um verschiedene Antigene oder Hilfsstoffe für Zielerreger zu enthalten. Der Vorteil dieses Ansatzes wird durch die Kombination von i.LN. Lieferung mit lokaler, kontrollierter Freisetzung von Ladung aus Biomaterialien erreicht. Diese Synergie schafft eine Plattform, die genutzt werden kann, um effiziente adaptive Immunantworten mit winzigen Dosen und mit reduzierten unspezifischen/systemischen Nebenwirkungen zu generieren.

Die Lymphknoten (LNs) sind die Kommandozentralen des Immunsystems. An dieser immunologischen Stelle, Antigen präsentieren den Zellen Primieren naiver Lymphozyten gegen bestimmte fremde Antigene, um zelluläre und humorale Immunantworten zu aktivieren. LNs sind damit zu einem attraktiven Ziel für die Lieferung von Impfstoffen und Immuntherapien geworden. Leider führen die meisten Impfstoffstrategien zu einer ineffizienten, vorübergehenden Abgabe von Antigenen und Hilfsstoffen an das Lymphgewebe1. Ansätze, die die Ausrichtung und Retention von Impfstoffkomponenten in LNs verbessern, könnten daher erhebliche Auswirkungen auf die Wirksamkeit und Effizienz neuer Impfstoffe haben.
Eine Strategie zur Umgehung der Herausforderung des LN-Targetings, die großes Interesse an neuen klinischen Studien gezeigt hat, ist die direkte, intra-LN (i.LN.) Injektion2-4. Diese Studien verwendeten Ultraschall-Leitlinien, um Impfstoffe an LNs als einfaches ambulantes Verfahren zu liefern. Im Vergleich zu herkömmlichen peripheren Injektionsrouten führte dieser Ansatz zu einer signifikanten dosissparenden und verbesserten Wirksamkeit in therapeutischen Kontexten, einschließlich Allergien und Krebs2-4. In diesen Studien wurden i.LN.-Injektionen von löslichen Impfstoffen(d.h. biomaterialfrei) eingesetzt, die durch Lymphdrainage schnell gerodet wurden. Daher wurden mehrere Injektionen - oder Zyklen von Mehrfachinjektionen - verabreicht, um diese beeindruckenden therapeutischen Effekte zu erzielen. Verbesserte Retention in der LN könnte die Interaktion zwischen Antigen und /oder adjuvanten und Immunzellen verbessern, weiter verbesserung der Wirksamkeit der Immunzellgrundierung. Dieses Potenzial wird durch aktuelle Studien unterstützt, die zeigen, dass die Kinetik der Antigen- und Adjuvans-Entbindung eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der spezifischen Immunantwort spielt, die5-7erzeugt wird. Darüber hinaus könnte die Lokalisierung und Minimierung von Medikamenten- und Impfstoffdosen systemische Effekte wie chronische Entzündungen reduzieren oder eliminieren.
Biomaterialien wurden ausgiebig untersucht, um die Wirksamkeit und Effizienz von Impfstoffen zu verbessern1,8,9. Die Verkapselung oder Adsorption auf Biomaterialträgern kann Fracht physisch vor Demintizugung schützen und Löslichkeitsbeschränkungen überwinden. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal von Biomaterialträgern, wie z. B. polymeren Mikro- oder Nanopartikeln, ist die Fähigkeit, mehrere Ladungsklassen zu beladen und anschließend diese Ladungen in kontrollierten Intervallen freizugeben. Eine signifikante Einschränkung, die Biomaterial-Impfstoffe und Immuntherapien in vivo weiterhin behindert, ist jedoch eine ineffiziente Ausrichtung auf Immunzellen und der eingeschränkte Handel mit Lymphknoten. Beispielsweise weist die periphere Injektion von Biomaterialimpfstoffen über konventionelle Wege(z. B. intradermale, intramuskuläre) in der Regel eine schlechte LN-Ausrichtung auf, wobei bis zu 99 % des injizierten Materials an der Injektionsstelleverbleiben 4,10. In jüngerer Zeit wurde die Größe der Träger von Biomaterial-Impfstoffen darauf abgestimmt, den präferenziellen Handel oder die Entwässerung dieser Impfstoffe an LNs durch interstitielle Strömungenden 8,10zu verbessern. Diese Fortschritte haben zu verbesserten zellulären und humoralen Immunreaktionen geführt und die Bedeutung der Ausrichtung und Entwicklung der LN-Umgebung für neue Impfstoffe unterstrichen.
Dieses Papier stellt ein Impfprotokoll vor, das lipidstabilisierte Polymerpartikel und i.LN. Lieferung kombiniert, um kontrollierte Freisetzungsimpfstoffdepots zu erzeugen5,11. Aufbauend auf neueren Studien mit chirurgischen Techniken für i.LN. bei Mäusen6,7,12,13haben wir eine schnelle, nicht-chirurgische Strategie zur Injektion von Biomaterial-Impfstoffen bei Kleintieren entwickelt5. Kombination der i.LN-Lieferung mit Biomaterial-Impfstoffträgern verbesserte die CD8-T-Zellreaktion innerhalb von 7 Tagen nach einer einmaligen Injektion von kontrollierten Freisetzungsimpfstoffdepots5. Es wurde auch eine starke humoristische Reaktion(d.h. Antikörpertiter) erzeugt; Beide Verbesserungen waren mit einer erhöhten Retention von Impfstoffkomponenten in Lymphknoten verbunden, die durch kontrollierte Freisetzung aus den Biomaterialträgern vermittelt wurde. Interessanterweise veränderte die Größe der Impfstoffpartikel das Schicksal dieser Materialien einmal in den LNs: Nanopartikel zeigten eine erhöhte direkte Aufnahme durch Zellen, während größere Mikropartikel in der extrazellulären LN-Umgebung blieben und freigesetzte Ladung(z. B. Adjuvans) freigesetzt wurde, die von LN-residenten Antigen-Darstellungszellen5aufgenommen wurde. Diese Daten deuten auf zwei Wege hin, die durch die Kontrolle der Größe der i.LN injizierten Biomaterialien für neue Impfstoffe genutzt werden könnten.
In diesem Artikel werden biologisch abbaubare lipidstabilisierte Polymerpartikel (mikro- und nanoskal) mit einer modifizierten Doppelemulsionsstrategie synthetisiert5,11. Die Partikeleigenschaften zeichnen sich durch Laserbeugung und Mikroskopie aus. Diese Partikel werden dann direkt in die Leisten-LNs injiziert, die nichtchirurgisch mit einem gemeinsamen, ungiftigen Tracerfarbstoff14identifiziert wurden. Die Nachinjektionsanalyse von LNs durch Histologie oder Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um die Verteilung von Partikeln innerhalb der LN-Umgebung zu überprüfen sowie die zelluläre Aufnahme und Retention von Partikeln im Laufe der Zeit zu überwachen. Für Protokolle, die die histologische Verarbeitung und die Durchflusszytometrie beschreiben, werden die Leser auf aktuelle JoVE-Artikel und Journalberichte15-22verwiesen. Typische Ergebnisse zeigen lokale LN-Targeting dieser Depots, die genutzt werden könnten, um potente, effiziente Immunantworten zu erreichen oder die Immunität für Zielerreger anzupassen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850375</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">880128</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP)</td>
			<td style="width:71px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td style="width:167px;">10 mg/ml stock in chloroform</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Polylactic-co-glycolic acid (PLGA)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2191</td>
			<td style="width:167px;">Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dichloromethane (DCM)</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BDH1113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:71px;">Vetone</td>
			<td style="width:119px;">502017</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nair</td>
			<td style="width:71px;">Nair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Evans blue tracer dye</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">AAA16774-09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD328418</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD305167</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">BD309628</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-949</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vybrant DiD Cell-Labeling Solution</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">V-22887</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17149</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 &#181;m</td>
			<td style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17156</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ovalbumin, Purified</td>
			<td style="width:71px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:119px;">LS003056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125</td>
			<td style="width:71px;">Qsonica</td>
			<td style="width:119px;">Q125</td>
			<td style="width:167px;">1/8 in diameter microtip probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">YO-04739-22</td>
			<td style="width:167px;">10 G dispersing element</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX-83</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer</td>
			<td style="width:71px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">LA-950</td>
			<td style="width:167px;">Including provided cuvette-style glass fraction cell</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Professional 8685 Peanut Classic Clippers</td>
			<td style="width:71px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-lymph node injection of biodegradable polymer particles

Die Generierung der adaptiven Immunantwort beruht auf einer effizienten Drainage oder dem Handel mit Antigen-Lymphknoten zur Verarbeitung und Darstellung dieser fremden Moleküle in T- und B-Lymphozyten. Lymphknoten sind somit zu kritischen Zielen für neue Impfstoffe und Immuntherapien geworden. Eine neue Strategie zur Gezielten Ausrichtung auf diese Gewebe ist die direkte Lymphknoteninjektion von löslichen Impfstoffkomponenten, und klinische Studien mit dieser Technik waren vielversprechend. Mehrere Biomaterialstrategien wurden ebenfalls untersucht, um das Lymphknotenziel zu verbessern, z. B. die Partikelgröße für eine optimale Drainage von biomaterial-Impfstoffpartikeln. In diesem Beitrag stellen wir eine neue Methode vor, die die direkte Lymphknoteninjektion mit biologisch abbaubaren Polymerpartikeln kombiniert, die mit Antigen-, Adjuvans- oder anderen Impfstoffkomponenten beladen werden können. Bei diesem Verfahren werden polymere Mikropartikel oder Nanopartikel durch ein modifiziertes Doppelemulsionsprotokoll mit Lipidstabilisatoren synthetisiert. Partikeleigenschaften(z.B. Größe, Ladungsbelastung) werden durch Laserbeugung bzw. Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Maus-Lymphknoten werden dann durch periphere Injektion eines ungiftigen Tracerfarbstoffs identifiziert, der die Visualisierung der Zielinjektionsstelle und die anschließende Ablagerung von Polymerpartikeln in Lymphknoten ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine direkte Kontrolle der Dosen und Kombinationen von Biomaterialien und Impfstoffkomponenten, die an Lymphknoten geliefert werden, und könnte bei der Entwicklung neuer biomaterialbasierter Impfstoffe genutzt werden.

Die erwarteten Ergebnisse für die in diesem Manuskript vorgestellten Protokolle lassen sich in drei Kategorien unterteilen: Partikelsynthese, Tieraufbereitung und Partikelinjektion.
Abbildung 1 zeigt die Synthese und Charakterisierung biologisch abbaubarer Polymerpartikel, die durch amphiphile Lipide stabilisiert werden. Die Ergebnisse des Emulsions-/Lösungsmittelverdampfungssyntheseprotokolls (Abbildung 1A) können durch visuelle Inspektion der erzeugten Endemulsionen qualitativ bewertet werden; Partikelchargen sollten homogene, stabile Emulsionen mit undurchsichtigem Aussehen sein. Komplikationen sind Emulsionen, die Creme oder Flocculate, oft aufgrund unsachgemäßer Lagerung von Lipidstabilisatoren. Um diese Instabilität zu vermeiden, sollten Lipide bei -80 °C in einem dehydrierten Zustand oder in einer versiegelten Durchstechflasche mit Stickstoff gereinigt gelagert werden. Quantitative Bewertung der Partikelsynthese kann mit Laserbeugung oder dynamischer Lichtstreuung durchgeführt werden, um die Größenverteilung zu analysieren (Abbildung 1B). Zu den erwarteten Ergebnissen gehören eng verteilte, monomodale Partikelgrößen, die auf eine gleichmäßige Partikelpopulation hinweisen. Die in diesem Manuskript beschriebenen Syntheseparameter erzeugen zahlengemittelte Verteilungen, die bei etwa 100 nm bzw. 3 m für Nanopartikel bzw. Mikropartikel zentriert sind. Eine weitere qualitative Bewertung der Partikelsynthese kann durch eine Änderung des obigen Protokolls erreicht werden, um mehrere Klassen von fluoreszierender Ladung zu integrieren. In Abbildung 1Cbestätigen Mikroskopiebilder von Mikropartikeln, die mit einem fluoreszierenden Peptid (FITC, grün), einem lipophilen Farbstoff (DiD, rot) und einem Overlay-Bild (gelb) beladen sind, die Bildung von Partikeln innerhalb des gewünschten Größenbereichs und die Verkapselung von Peptid innerhalb des Volumens des Partikels.
Die ersten beiden Panels von Abbildung 2 fassen die erwarteten Ergebnisse der Tiervorbereitung für die in diesem Papier beschriebene i.LN.-Injektionsstrategie zusammen. Die Methode beinhaltet die Kennzeichnung von Leisten-LNs durch periphere Injektion eines ungiftigen Tracers, um den Ort für die nachfolgende i.LN.-Injektion von Partikeln zu identifizieren (Abbildung 2A)5. Wie bereits erwähnt, ermöglicht die Drainage des Tracerfarbstoffs nach subkutaner Injektion an der Schwanzbasis die Visualisierung der leistenförmigen LNs (Abbildung 2B)5. Die Einnahme von zugelassenen Enthaarungscremes kann eine Gefahr für die Mäuse darstellen. Daher sollte darauf geachtet werden, alle aufgetragene Creme gründlich zu entfernen, wobei besonders auf die Pfoten und die ventrale Seite der Mäuse zu achten ist. Enthaart sollte mit einem nassen, weichen Tuch oder einem nassen Papiertuch in einer einzigen, glatten Bewegung entfernt werden. Vermeiden Sie Reiben, um Creme zu entfernen, da dies zu Abschürfungen auf der exponierten Haut der Mäuse führen kann.
Bestätigung der lokalen Lieferung an die Leisten-LN kann durch Beobachtung oder Histologie bewertet werden. Das LN-Volumen kann während der Injektion visuell als Indikator für eine erfolgreiche Injektion überwacht werden. Zu den erwarteten Ergebnissen gehört eine effiziente Frachtverteilung in der LN-Struktur, ohne dass angrenzende Gewebe oder Zellen signifikant austreten. Da die injizierte Flüssigkeit den Tracer in der LN verdrängt/verdünnt, sollte die Farbstoffkonzentration/Färbung nach der Injektion weniger intensiv werden. Die Beobachtung des Gewebes sollte eine intakte, aber vergrößerte LN durch Flüssigkeitsinjektion offenbaren. Mögliche Herausforderungen sind die zu schnelle Injektion oder das Fehlen der LN, die beide zu einer Elution des Volumens in das umgebende Subkutangewebe führen können. Diese unerwünschten Ergebnisse können durch Nekropsie oder Histologie bestätigt werden, wo die Partikelsuspension beobachtet wird, die sich auf Zellen und Gewebe ausbreitet, die von Knoten entfernt sind, die zur Injektion bestimmt sind. Ein erwartetes Ergebnis wäre dagegen die Identifizierung einer vergrößerten Leisten-LN aufgrund der Eindämmung von Partikeln innerhalb der LN-Struktur. Die histologische Verarbeitung verbrauchsteuerrwerdener LNs kann die Lieferung von Fracht an das Lymphgewebe endgültig bestätigen, wie in den Abbildungen 2C und 2Ddargestellt. Beachten Sie, dass die Partikel in Abbildung 2 fluoreszierende Ladung enthalten, um die Visualisierung der Ladung während der Injektion sowie während der histologischen Verarbeitung und fluoreszierenden Mikroskopie zu ermöglichen.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig1.jpg" width="600px"> Abbildung 1. Synthese und Charakterisierung von Lipid stabilisierten Partikeln. A) Schematische Darstellung der Synthese von lipidstabilisierten Partikeln, die durch Emulsion/Lösungsmittelverdampfung hergestellt werden. B) Größenverteilungen von Mikropartikeln (feste Linie, Durchmesser = 2,8 m) und Nanopartikeln (gestrichelte Linie, Durchmesser = 113 nm). C) Fluoreszierende Mikroskopiebilder von Partikeln, die mit fluoreszierend markiertem Peptid und einem fluoreszierenden Partikelfarbstoff beladen sind. Etiketten: Peptid (grün) und Partikel (rot). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50984/50984fig2.jpg" width="600px"> Abbildung 2. i.LN. Injektion und Verteilung biologisch abbaubarer Partikel innerhalb von LN. A) Methodik für i.LN.-Injektion. B) Visualisierung von LNs in einer Maus durch die Haut (oberes Bild) und die folgende Nekropsie (unteres Bild)5. C) Histologische Färbung eines LN, das die Ablagerung und Verteilung fluoreszierend markierter Polymermikropartikel (Partikel, grün; T-Zellen, rot; B-Zellen, blau). D) Fluoreszierend markierte Nanopartikel (50 nm, linkes Bild) und Mikropartikel (6 m, rechtes Bild) in LNs 24 Stunden nach der Injektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50984/50984fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

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Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Lymphknoten sind die immunologischen Gewebe, die die Immunantwort orchestrieren und ein kritisches Ziel für Impfstoffe sind. Biomaterialien wurden eingesetzt, um Lymphknoten besser anzusprechen und die Abgabe von Antigenen oder Hilfsstoffen zu kontrollieren. Dieser Artikel beschreibt eine Technik, die diese Ideen kombiniert, um biokompatible Polymerpartikel in Lymphknoten zu injizieren.

Intra-Lymphknoten-Injektion von biologisch abbaubaren Polymerpartikeln

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

intra-lymph-node-injection-of-biodegradable-polymer-particles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.3K Aufrufe.  University of Maryland, College Park. Lymphknoten sind die immunologischen Gewebe, die die Immunantwort orchestrieren und ein kritisches Ziel für Impfstoffe sind. Biomaterialien wurden eingesetzt, um Lymphknoten besser anzusprechen und die Abgabe von Antigenen oder Hilfsstoffen zu kontrollieren. Dieser Artikel beschreibt eine Technik, die diese Ideen kombiniert, um biokompatible Polymerpartikel in Lymphknoten zu injizieren.

Serie: Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Einem mikrofluidischen-basierte Hydrodynamische Trap für einzelne Teilchen

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Forschung

Biotechnik

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive, 'SurgiLux': Preparation and Demonstration

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures can act as a nidus for infection and in many procedures are unable to effect wound repair or interfere with functional tissue regeneration.1 Surgical glues and adhesives, such as those based on fibrin and cyanoacrylates, have been developed as alternatives to sutures for the repair of such wounds. However, current commercial adhesives also have significant disadvantages, ranging from viral and prion transfer and a lack of repair strength as with the fibrin glues, to tissue toxicity and a lack of biocompatibility for the cyanoacrylate based adhesives. Furthermore, currently available surgical adhesives tend to be gel-based and can have extended curing times which limit their application.2 Similarly, the use of UV lasers to facilitate cross-linking mechanisms in protein-based or albumin 'solders' can lead to DNA damage while laser tissue welding (LTW) predisposes thermal damage to tissues.3 Despite their disadvantages, adhesives and LTW have captured approximately 30% of the wound closure market reported to be in excess of US $5 billion per annum, a significant testament to the need for sutureless technology.4
In the pursuit of sutureless technology we have utilized chitosan as a biomaterial for the development of a flexible, thin film, laser-activated surgical adhesive termed 'SurgiLux'. This novel bioadhesive uses a unique combination of biomaterials and photonics that are FDA approved and successfully used in a variety of biomedical applications and products. SurgiLux overcomes all the disadvantages associated with sutures and current surgical adhesives (see Table 1).
In this presentation we report the relatively simple protocol for the fabrication of SurgiLux and demonstrate its laser activation and tissue weld strength. SurgiLux films adhere to collagenous tissue without chemical modification such as cross-linking and through irradiation using a comparatively low-powered (120 mW) infrared laser instead of UV light. Chitosan films have a natural but weak adhesive attraction to collagen (~3 KPa), laser activation of the chitosan based SurgiLux films emphasizes the strength of this adhesion through polymer chain interactions as a consequence of transient thermal expansion.5 Without this 'activation' process, SurgiLux films are readily removed.6-9 SurgiLux has been tested both in vitro and in vivo on a variety of tissues including nerve, intestine, dura mater and cornea. In all cases it demonstrated good biocompatibility and negligible thermal damage as a consequence of irradiation.6-10

The fabrication of a novel, flexible thin film surgical adhesive from FDA approved ingredients, chitosan and indocyanine green is described. Bonding of this adhesive to collagenous tissue through a simple activation process with a low-powered infra-red laser is demonstrated.

A Chitosan Based, Laser Activated Thin Film Surgical Adhesive &quot;SurgiLux &#39;: Vorbereitung und Demonstration

Sutures are a 4,000 year old technology that remain the 'gold-standard' for wound closure by virtue of their repair strength (~100 KPa). However, sutures ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protokoll für Relative Hydrodynamische Beurteilung der Tri-Polymer Merkblatt Ventile

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Programmierung Stammzellen für therapeutische Angiogenese mit biologisch abbaubaren Polymernanopartikel

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Manufacturing Of Robust Natural Fiber Preforms Utilizing Bacterial Cellulose as Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose and short sisal fibers are dispersed into a water suspension containing bacterial cellulose. The fiber and nanocellulose suspension is then filtered (using vacuum or gravity) and the wet filter cake pressed to squeeze out any excess water, followed by a drying step. This will result in the hornification of the bacterial cellulose network, holding the loose natural fibers together.
Our method is specially suited for the manufacturing of rigid and robust preforms of hydrophilic fibers. The porous and hydrophilic nature of such fibers results in significant water uptake, drawing in the bacterial cellulose dispersed in the suspension. The bacterial cellulose will then be filtered against the surface of these fibers, forming a bacterial cellulose coating. When the loose fiber-bacterial cellulose suspension is filtered and dried, the adjacent bacterial cellulose forms a network and hornified to hold the otherwise loose fibers together.
The introduction of bacterial cellulose into the preform resulted in a significant increase of the mechanical properties of the fiber preforms. This can be attributed to the high stiffness and strength of the bacterial cellulose network. With this preform, renewable high performance hierarchical composites can also be manufactured by using conventional composite production methods, such as resin film infusion (RFI) or resin transfer molding (RTM). Here, we also describe the manufacturing of renewable hierarchical composites using double bag vacuum assisted resin infusion.

We present a novel method of manufacturing rigid and robust short natural fiber preforms using a papermaking process. Bacterial cellulose acts simultaneously as the binder for the loose fibers and provides rigidity to the fiber preforms. These preforms can be infused with a resin to produce truly green hierarchical composites.

Herstellung von robusten Naturfaser-Preforms Verwendung Bakteriencellulose als Binder

A novel method of manufacturing rigid and robust natural fiber preforms is presented here. This method is based on a papermaking process, whereby loose ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant adhesion strength than commercial tissue adhesives. Medical adhesives have attracted great attention as potential alternative tools to sutures and staples due to their convenience in usage with minimal invasiveness. Although there are several protocols for developing tissue adhesives including those commercially available such as fibrin glues and cyanoacrylate-based materials, mostly they require a series of chemical syntheses of organic molecules, or complicated protein-purification methods, in the case of bio-driven materials (i.e., fibrin glue). Also, the development of surgical glues exhibiting high adhesive properties while maintaining biodegradability is still a challenge due to difficulties in achieving good performance in the wet environment of the body. We illustrate a new method to prepare a medical glue, known as TAPE, by the weight-based separation of a water-immiscible supramolecular aggregate formed after a physical mixing of a plant-derived, wet-resistant adhesive molecule,&#160;Tannic Acid (TA), and a well-known biopolymer, Poly(Ethylene) glycol (PEG). With our approach, TAPE shows high adhesion strength, which is 2.5-fold more than commercial fibrin glue in the presence of water. Furthermore, TAPE is biodegradable in physiological conditions and can be used as a potent hemostatic glue against tissue bleeding. We expect the widespread use of TAPE in a variety of medical settings and drug delivery applications, such as polymers for muco-adhesion, drug depots, and others.

We describe the simplest protocol to prepare biodegradable medical glue that has an effective hemostatic ability. TAPE is a water-immiscible supramolecular aggregate prepared by mixing of tannic acid, a ubiquitous compound found in plants, and poly(ethylene) glycol, yielding a 2.5 times greater water-resistant adhesion compared with commercial fibrin glue.

TAPE: ein biologisch abbaubares hämostatische Kleber Inspiriert von einer Ubiquitous Verbindung in Pflanzen für chirurgische Anwendung

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a high-protein crambe meal that has limited value, as it is not fit for food or feed use. However, it contains proteins that could potentially make it a suitable raw material for higher-value products. The purpose of this study was to find methods of making this side stream into extruded films, showing that products with a higher value can be produced. The study mainly considered the development of material compositions and methods of preparing and extruding the material. Wheat gluten was added as a supportive protein matrix material, together with glycerol as a plasticizer and urea as a denaturant. The extrudate was evaluated with respect to mechanical (tensile testing) and oxygen barrier properties, and the extrudate structure was revealed visually and by scanning electron microscopy. A denser, more homogeneous material had a lower oxygen transmission rate, higher strength, and higher extensibility. The most homogeneous films were made at an extruder die temperature of 125-130 &#176;C. It is shown here that a film can be extruded with promising mechanical and oxygen barrier properties, the latter especially after a final compression molding step.

Film Extrusion of Crambe abyssinica/Wheat Gluten Blends

The side stream from plant oil production of Crambe abyssinica has limited value. The purpose of this study was to find methods for extruding materials based on this side stream, demonstrating that products with a higher value can be produced. The extrudates were found to have promising properties.

Folienextrusion von<em&gt; Krambe</em&gt; / Weizen-Gluten-Mischungen

Crambe abyssinica is a plant with potential for use in industrial (non-food) plant oil production. The side stream from this oil production is a ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...