Name: in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

Ispanak Yapraklarından 1. Toplam Pigment Ekstraksiyon <ol><li> Öğütme soğuk tampon 100 ml ıspanak yaprağı (~ 20 g), homojen bir avuç 20 saniye boyunca bir karıştırıcı kullanılarak (Tablo 1 e bakınız). </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1500 x g&#39;de 20 um ve santrifüj filtre ürünü bir gözenek çapına sahip naylon kumaş iki katmanı boyunca solüsyonu filtre. </li><li> Yumuşak bir sanatçı ile kloroplast içeren topak soğutulmuş Yıkama Tamponu, 1 ml boya fırçası süspanse (Tablo 1 e bakınız). Topak tekrar askıda bırakılmıştır sonra, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj Yıkama Tamponu ve 50 ml solüsyon ilave edin. </li><li> Yıkama Tamponu 50 ml pelet (tilakoidler) tekrar süspansiyon yavaşça Süpernatantı ve (Tablo 1 e bakınız). </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj ve çözelti tamamen supernatant çıkarın. Bu noktada, boya oksidasyonu önlemek için karanlıkta aşağıdaki adımları gerçekleştirmek. </li&gt; <li> Na 2 CO 3 ile tamponlanmış% 80 aseton, 20 ml pigmentleri elde etmek için (Tablo 1 e bakınız) ~ ekleyin. Bazen vorteks, 10 dakika boyunca buz üzerinde çözeltisi bırakın. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ile hücresel bileşenlerini Pelet. Not: pigmentler tamamen ekstre değil ise, topak yeşil bir renge sahip olabilir ve 1,6 tekrar edilmelidir adım olacaktır. </li><li> Bir ayırma hunisi içine supernatant toplamak. Dietiletere 0.4 birimler eklemek şiddetle sarsmak ve gazın boşaltılması vanasını açın. </li><li> 0.33 M NaCl 0.8 hacimlerini ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. Fazların ayrılması için ~ 10 dakika bekleyin. Üst Eter fazı ekstre pigmentler içerir. Berrak bir alt faz çıkarın. Not: Ayırma açık değilse, dondurma ve faz ayrışmasını geliştirmek için bir çözüm eritin. </li><li> Uygun bir cam kap içine, ayırıcı bir huniye üstten dökülerek eter çıkarın. Gran bir kaşık ekleyerek Kurunitlerin susuz sodyum sülfat. Çözeltisi girdap ve eterden su absorbe kurutucu için ~ 5 dakika izin verir. NOT: sodyum sülfat tamamen kümeleştiler görünüyorsa bu adımı tekrarlayın; Eter yeterince kurutulur, bazı serbest yüzen kristaller olmalıdır. Bir su tabakası oluşması durumunda, ilave susuz sodyum sülfat ilave edilmeden önce bir yeniden süspanse ile çıkarın. </li><li> Arkasından, sodyum sülfat katı bırakarak yeni bir cam kaba eter süzün. </li><li> Döner bir speedvac ya da N2 akışı altında eter buharlaştırın. </li><li> % 100 aseton, 10 ml tamamen pigmentler çözülür. </li><li> % 80 aseton, 1 ml içine az miktarda (~ 3 ul) seyreltin ve soğurma spektrumunu ölçmek ve Porra ve arkadaşları tarafından tarif edilen yöntem ile Chl a / b oranı ve Chl konsantrasyonunu belirler. (1989) 15. </li><li> Aseton kadar kısım ve döner bir speedvac ya da N2 akışı altında kuru pigmentlertamamen buharlaştırıldı. -80 ° C de kurutuldu pigmentler saklayın. </li></ol> Ispanak gelen Karotenoidler 2. Ekstraksiyon <ol><li> Adımları 1,1-1,5 izleyin. Bu noktada, boya oksidasyonu önlemek için karanlıkta aşağıdaki adımları gerçekleştirmek. </li><li> Pigmentleri elde etmek için, Na 2 CO 3 (Tablo 1 e bakınız) ile tamponlanmış ~ 50 ml% 96 etanol içinde Tilakoid pelletini. 5 dakika boyunca buz üzerinde çözeltisi bırakın. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ile hücresel bileşenlerini Pelet. Not: pigmentler tamamen ekstre değil ise, topak yeşil bir renge sahip olabilir ve 2,2 tekrar edilmelidir adım olacaktır. </li><li> Supernatant toplamak ve (w / v) sabunlaştırılmasını başlatmak için% 80 KOH ve 0.1 hacim ekleyin. </li><li> 4 ° CO / N de çözümü bırakın, sıkıca kapatılmış ve ışıktan korunmalıdır. </li><li> Bir ayırma hunisi içine çözeltisi toplayın. Dietil eter 1 hacim ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 0.8 vol Ekle0.33 M NaCl Umes ve hafifçe karıştırın. Fazların ayrılması için ~ 10 dakika bekleyin. Üstünde turuncu eter fazı sabunlaştırılmış karotenoidler içerir. Huninin vana içinden boşaltılmasını tarafından yeşil alt faz çıkarın. </li><li> 3 hacim su ilave edin ve potasyum hidroksit çıkarmak için yavaşça karıştırın. Katmanlar ayrılmaya bırakılır. Not: üst faz bulutlu görünürse, NaCI, az miktarda ilave (örneğin, 3 çözeltisi 200 ml NaCI g) ve yavaşça girdap eritin. </li><li> Huninin vana ile süzülmesiyle alt faz çıkarın. </li><li> Takip 1,10-1,13 adımları. </li><li> % 80 aseton, 1 ml içine az miktarda (~ 3 ul) seyreltin ve% 80 aseton içinde 440 nm&#39;deki absorpsiyon spektrumları ölçer. Konsantrasyonunu belirlemek için, karotenoidler için ortalama yok olma katsayısı kullanılan aşağıdaki formül 16 (440 ε = 255): Araba [mg / ml] = (Abs, 440 nm / 225) x 11 (optik yol) = 1 cm. </li><li> Kısım ve kuru carotenoibir speedvac veya tüm dietileter kadar N2 akışı altında buharlaştırılmıştır DS edilmiştir. -80 ° C de kurutuldu pigmentler saklayın. </li></ol> Chlamydomonas 3. Toplam Pigment ve Karotenoit Ekstraksiyon reinhardtiinin <ol><li> C büyütün yüzey üzerine sıvı kültür az miktarda yayılması ile bir petri çanağı içinde katı ortam TAP 17 reinhardtii. 20 ľmol fotoğraflar PSA m -2 sn sürekli aydınlatma akı altında büyümeye -1 hücre yeşil tabaka görünür oluncaya kadar. </li><li> Steril bir aşılama döngü kullanılarak C arasında bir miktar hasat Katı TAP ortamından reinhardtii bir 1 L şişe TAP ortamı 17 500 ml hücreleri koydu. 20 umol m-2 resimleri, PSA sn&#39;lik bir sürekli aydınlatma akışı altında 170 rpm&#39;de çalkalanarak 25 ° C&#39;de kültür büyütün -1. </li><li> 5-6 gün sonra, kültür logaritmik fazın sonuna ulaşmalıdır (6 x 10 6 hücre / mLya da 750 nm&#39;de optik yoğunluk 2-2.5). 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 4000 x g&#39;de santrifüje kültürü. </li><li> Toplam pigment çıkarımı için, adımları 1,6-1,15 izleyin. </li><li> C. tam büyüme kültürü 500 ml başlayarak toplam pigment ekstresinin verim reinhardtii + b / mL, 0.5 mg a CHL bir konsantrasyon ile çözelti yaklaşık 5 ml&#39;dir. </li><li> Karotenoidler çıkarımı için, adımları 2,2-2,12 izleyin. </li></ol> İçerme Kuruluşlarının 4. saflaştırılması <ol><li> Standart moleküler biyoloji prosedürleri kullanılarak bir kaynaşmış bir C-terminal His etiketi ile sonuçlanan bir ekspresyon vektörü içine ilgi LHC&#39;in proteininin kodlama dizisi klonu. E. içine bu yapı Dönüşümü örneğin, BL21 (DE3) gibi E.coli host suşu. </li><li> Hazırlama Liziz tamponu, deterjan tamponu, Triton tamponu TE (Tablo 1), 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile, uygun antibiyotik ile LB ortamı 18. </li><li> Bir SINGL seçinE E. Standart prosedürler kullanılarak, uygun 6 antibiyotiklerle LB ortamının ~ 5 ml yeni boyanmış bir plakaya ekspresyon klonu içeren E. coli kolonisi. En az 16 saat boyunca 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> O 2.5 ml /, uygun antibiyotik ile takviye edilmiş LB 250 ml bir 1 L&#39;lik Erlenmeyen şişesi içine K kültürü. </li><li> 2-3 saat boyunca hücrelerin büyümesine 220 ​​rpm&#39;de 37 ° C&#39;de (ya da O.D. oluşana kadar 600 ~ 0.6). </li><li> 1 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ilave edin. 220 rpm&#39;de 3-4 saat 37 ° C&#39;de hücreler büyümeye devam etmektedir. </li><li> Önceden tartılmış bir santrifüj tüpüne 4 ° C&#39;de 5000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj kültür. Iyice Süpernatantı atın ve yeniden tartma ve santrifüj tüpü ağırlığı çıkarılarak ağırlık pelet belirler. </li><li> E. süspanse 0.8 ml / güçlü döndürülerek liziz tamponu g E. coli hücre topağı. Not: Alternatif olarak, hücre topağı -80 ° C&#39;de dondurulabilirDaha sonra kullanılmak üzere ° C. Dondurulmuş bir pelet ile başlanırsa, liziz tamponu ilave edilmeden önce tam olarak çözünmesine izin. </li><li> Hücrelerin gramı başına 2 mg lisozim ekleyin ve 30 dakika boyunca arada sırada burgaç gibi ıslak buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 20 ug / ml DNAz, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCI, 20 ug / ml RNAse ekleyin. Karıştırın ve 30 dakika için buz üzerine yerleştirilmiştir. </li><li> Hücre gramı başına soğuk Deterjan tampon maddesinin 2 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve 5 dakika boyunca oda tutun. </li><li> 2 ml santrifüj tüplerine transfer (gerekirse iki tüp içine bölünmüş). 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüje cisimciği: pelet. </li><li> Tampon soğuk Triton 1 ml ekleyin ve tamamen sonification tarafından pelet (20 sn aralıklarla 3 bakliyat x 5 sn x% 50 güç) tekrar süspansiyon. NOT: sonification sırasında soğuk tutmak için buzlu su ile çevrili küçük bir beher tüp var. Birden fazla tüp durumunda, yeniden süspansiyon haline getirilmesi sonra bir tüp içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş cisimciği birleştirir. </li><li> 12,000 10 dakika boyunca santrifüj4 ° C&#39;de xg cisimciği: pelet. </li><li> Adımı tekrarlayın 4.13 ve 4.14 iki kez. </li><li> Triton tampon kaldırmak için bir yıkama için sonifikasyon soğuk TE 1 ml cisimciği yeniden süspanse edin. 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüje cisimciği: pelet. </li><li> Sonifikasyon soğuk TE 1 ml pelletini. </li><li> Bu Bradford tahlili 19 gibi standart yöntemler ile protein konsantrasyonu değerlendirin. -20 ° C&#39;de saklayın inklüzyon cisimleri alikotları. </li></ol> 5. Sulandırma Absorbans Qy bölgesine (600-750 nm) olarak ölçülür, bu protokol, genellikle 4 OD&#39;ye ile yeniden protein 1-2 ml verir. Bakım işlemi sırasında uygun oranlarının muhafaza edilmesi için gereken miktarı, ancak, istendiği gibi ayarlanabilir. <ol><li> 2x Sulandırma Tamponu,% 20 RG, 2M KCI, TE, Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Aşağıdaki s gerçekleştirinloş ışıkta Teps&#39;in. </li><li> 2 ml mikrofuge&#39;de tüp 400 ul TE toplam LHC Eklenmesi Organları 800 mikrogram süspanse. 2x Sulandırma Tampon ve vorteks kısaca 400 ul ekleyin. </li><li> 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyon için β-merkaptoetanol (14.8 M stok), 0.6 ul ekleyin. 98 ° C&#39;de 1 dakika boyunca proteini ısıtın. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında Vortex kısa ve yer. </li><li> 1-2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde bir banyo sonikatörü içinde 1 dakika ya da bir yer girdaplanarak 30 ul% 100 EtOH toplam kurutulmuş klorofil pigmentlerin 500 ug ve 80 ug karotenoid pigmentler yeniden süspanse edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15,800 xg ~ 30 sn pigment karışımı Spin ve hiçbir pelet olduğunu onaylayın. Pelet varsa, vorteksleme ve / veya sonifikasyon tekrarlayın. ÖNEMLİ: yeniden süspansiyon ve spin sonra, hemen proteine ​​pigment eklemek veya toparlayıp tekrar yeniden süspanse gerekecektir. </li><li> Vorteks edilirken yavaşça soğutuldu proteine ​​pigment karışımı ekleyin. Girdabına 5-10 s DevamIslak buz üzerinde ec ve yer tüpü. Protein tüpün üst taşabilir de dinç bir şekilde vorteks için dikkatli olun. </li><li> % 20 Octyl β-D-glukopiranozide (OG) (son konsantrasyon% 2), vorteks kısaca 94 ul ekleyin ve buz 10 dakika devam. </li><li> Kısaca M KCI 2 (nihai konsantrasyon 150-200 mM) girdap 90 ul ilave edin ve 20 dakika buz üzerinde tutun. NOT: kolon hazırlama (Bölüm 6) şu anda başlatılabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15,800 x g&#39;de 10 dakika boyunca spin. 10 ml tüp (LDS çöktürülmüş) pelet bozmadan süpernatantı. Soğuk ve ışıktan korumalı tutun. </li></ol> 6. Nikel Kolonu Saflaştırması <ol><li> RG tamponu, RG durulama tamponu Ayrıştırma Tamponu: Tablo 1 de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın. </li><li> Bu aşama hava ve aşağıdaki aşamaları esnasında, kolonun iç alır sağlayan bir peristaltik pompa, bir Ni-Sefaroz sütunu (1 mi) ya da eşdeğer bağlayın. </li><li> T hızını ayarlamaO, 1 ml / dak pompa ve depolama çözeltinin çıkarılması için su ile 5-10 ml sütunu yıkayın. </li><li> OG tamponu 3-4 ml sütun dengelenmesi. </li><li> Kolona protein örnek ve yük OG tampon 3-4 ml ilave edilir. Not: protein LDS çıkarılmasından sonra daha uzun bir süre 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka süresi edilmiş ise 1 dakika ilave LDS çökelmesini kaldırmak için, 4 ° C&#39;de 15,800 x g hızında tekrar dönerler. </li><li> OG tamponu, 5 ml ile sütun durulayın. </li><li> RG durulama tamponu 2 ml ile sütun durulayın. </li><li> 3 mi tampon maddesi ile bağlanmış proteininin elüt edilmesi. Yeniden oluşturulmuş protein içeren yeşil eluteye toplayın. NOT: Bu genellikle toplam olarak yaklaşık 1 ml olmuştur. </li></ol> 7. Sükroz Gradyan Santrifüjü Geri <ol><li> Sakroz çözeltisi,% 0.06 β-DM 0.01 M HEPES, pH 7.6: Tablo 1 de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın. </li><li> -20 ° CO / N o da sukroz çözeltisi ve dondurulması ile ultrasantrifüjdeki tüpleri doldurmakR, -80 ° C&#39;de en az 1 saat. </li><li> Dondurucudan tüp çıkarın ve 4 ° C&#39;de dokunulmadan çözülme sağlar. Not: donma / çözülme işlemi 0.1 ila 1 M sukroz ile bir gradyan oluşturur. Bir 15 ml tüp, tipik olarak yaklaşık 3 saat içinde çözülür. </li><li> Dikkatli bir şekilde üst aşama 6.8 &#39;de nikel Sefaroz sütunundan elüt yeşil fraksiyon olarak aynı hacimde çıkarın. Daha sonra gradyanı rahatsız etmemek için yavaş yavaş üstüne yeniden örnek yüklemek. </li><li> Hızlanma ve fren olmayan durdurma yavaşlaması, 18 saat boyunca, SW-41 ya da SW-60 sallanan kepçeli rotor kullanılarak bir ultrasantrifüjdeki Tüpleri dengeleyin, ve 4 ° C sıcaklıkta 200,000 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Dikkatlice forseps ile tüp sahibinden degrade çıkar. Üst kısmını toplamak için bir kör deliğe sahiptir uzun bir iğne ile bir şırınga kullanın. Not: Alternatif olarak, bir iğne ile delme ve tüp damla toplayarak alttan fraksiyonlarım toplamak. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

Membran proteinleri çalışmak çok kolay değil. Doğal zar proteinlerinin izolasyonu protein zarar verebilir ve temel kofaktör kaldırmak deterjanlarla lipid çift katmanından çözündürülmesi için ihtiyacı karmaşık hale gelir. Bu proteinler ayrıca biyolojik zarların düşük seviyelerde mevcut olabilir, ya da zor tek komplekslerinin saflaştırılması kılan hafif hasat kompleks durumunda olduğu gibi, yakın ilişkili proteinler ile karıştırılabilir. E. coli &#39;de heterolog protein ekspresyonu E. coli ve in vitro yeniden yapımında Bu sorunları önlemek için imkanı sunar. in vitro homojenliğe 24 saflaştırılarak edilemez kompleksleri incelemek için kullanılabilir doğal kompleksleri 20,21,23 ve dolayısıyla çok benzer özelliklere sahip kompleksleri sulandırılması ve katlanmış proteinler, sonuç saflaştırılması - 27. Bu yöntem attainab kolaylıkla, ıspanak, kullanırtoplam pigment ve karotenoid hazırlıkları için bir kaynak olarak le yıl boyunca,. Yosunlar için nativ proteinlerin bazı reconstitutions, yosunlar saflaştırılmış pigmentlerin kullanılması nedeniyle farklı pigment bileşimler tercih edilir. Chl a / b oranı ve Chl / otomobil oranı ne olursa olsun, pigment kaynağı aynı kalır. Bu sulandırma verimliliği genellikle% 35 civarındadır 28 olduğunu fark etmek önemlidir. Bu nedenle, yeniden oluşumun ardından çözeltiden Bağlı olmayan pigmentler ve katlanmamış apoprotein kaldırmak için gereklidir. Iki aşamalı bir saflaştırma protokolü (ayrıca sonuçları bakınız), bu protokolde sunulmuştur. Bununla birlikte, sukroz gradyanlı adım APO ve sanal-proteinin tam olarak ayrılmasına izin vermez unutulmamalıdır. Apoprotein fonksiyonel ölçülerde müdahale etmeyen, böylece pigmentler ihtiva etmez ve en gibi analizler için bu bir sorun değildir. Bununla birlikte, bu durumda, tamamen fr apoprotein kaldırmak için gereklidiryeniden kompleksi (örneğin protein stoikiometriye pigment hesaplamak için) ihtiva eden işlem, bir anyonik değiştirme sütunu (bakınız Passarini ve ark. detayları için 29, 2009) kullanılabilir. Kapasite in vitro izole edilmiş yeniden birleştirici pigmentler ile ışık toplayıcı proteinlerin yeniden kapatmak için, böylece elde edilen kompleksin özelliklerini değiştirmeden, çeşitli şekillerde yeniden oluşturma &quot;çevre&quot; değiştirerek kompleksleri &quot;ayarlamak&quot; için bir fırsat sağlar. Örneğin, sulandırma sırasında pigment bileşimi değişen değiştirilmiş bir pigment bileşimi ile bir kompleks neden olabilir. Bu özellik, çeşitli pigmentler kompleksinin yapısı ve kararlılığı üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir. 1 ve 2.9 arasında bir Chl / araç oranı l: süresi ıspanak elde edilen pigment preparasyonu 3 bir Chl a / b oranı 1. Bu oran, tipik olarak n ile aynı özelliklere sahip olan bir sulandırma proteini üretirbirini Ative. 33 - Bununla birlikte, arıtılmış, Chl a veya b eklenmesiyle Chl a / b oranı ayarlanması bağlanma yerleri 30 seçiciliği değişken bağlı olarak farklı pigmentlerin bağlayıcı etkileyebilir. Pigment bağlama sitelerinin çoğu Chl a ya da b Chl tamamen selektif değildir, ama her ikisi için uygun olabilir, çünkü bu, mümkün olmasına rağmen, farklı afinite ile 10,30,34. 38 - Benzer şekilde, karotenoid bağlanma yerleri, ayrıca birden Ksantofil tür 8,35 karşılamak mümkün olduğu gösterilmiştir. CP26, çeşitli pigment bileşimleri kullanılarak yüksek bitkiler, diğer pigment-protein kompleksinin farklı reconstitutions Tablo 2&#39;de 39 olarak gösterilmiştir. Bu reconstitutions, özellikle pigmentler 39 için bağlanma afinitesini belirlemek için kullanıldı. Bu aynı pigment c ile bir kompleks elde etmek için dikkat çekicidir1: doğal olarak omposition pigment karışımı Chl a / b oranı 3 olmalıdır. Bu, daha yüksek bitki 20,40 her BHÇ kompleksleri için geçerli görünmektedir. Yeniden oluşturma tekniği ile, moleküler biyoloji kombinasyonu, Chl bağlayıcı kompleksinin özellikleri daha ayrıntılı olarak incelenecektir sağlar. 44 - kompleksleri, ya da protein-protein etkileşimleri katılımları kararlılığı ve katlanma farklı bir protein alanlarının önemi, apoprotein kesilmesi ya da rastgele mutagenez 8,41 yapılarak belirlenmiştir. 52 - Farklı pigmentlerin koordinasyonu için önemli bir tek amino asit kalıntıları tek tek pigmentlerin özelliklerini analiz ya da kompleks 10,28,29,45 bir fonksiyon ve stabilite etkilerinin değerlendirilmesi için, yer yönlendirmeli mutagenez ile değiştirilebilir. Şekil 6 ile Lhcb4 (CP29) yeniden53, 216 konumunda bir mutasyonu histidin. vahşi tip ve mutant komplekslerinin pigment bileşimin bir karşılaştırması mutasyon hedef sitesi WT kompleksi içinde Chl a barındırır gösteren bir molekül, bir Chl kaybını uyardığını göstermektedir. WT ve mutant absorpsiyon spektrumları arasındaki farklar, pigment içeriğine normalleşmeyi üzerine de kayıp pigmentin emme özelliklerini gösterir. Bu durumda, fark Chl His216 tarafından koordine edilen bu dalga boyunda absorbe eder (bu, mutant ile ilgili daha fazla bilgi için ve spektroskopik özellikleri Mozzo ve ark. 2008 53) gösteren, 680 nm &#39;de, ana zirve görülebilir. Mutasyon analizi, aynı zamanda pigmentlerin 54 spektroskopik özellikleri üzerindeki çevre etkisini belirlemek için de kullanılabilir. Sonuç olarak, ışık hasat proteinlerini pigment Protei sonuçlanan in vitro yeniden oluşturulabiliryerli kompleksleri çok benzer özelliklere sahip n kompleksleri. Ayrıca, ileri çalışmalar için yüksek verim ve saflıkta olan bir protein preparasyonunu elde ederlerken, bu şekilde, doğal proteinlerin izole zorlukları ortadan kaldırılır. 3 önemi: otantik bir kompleks oluşturan 1 Chl a / b oranı vurgulanmıştır ve yeniden vahşi tip ve mutant LHCs örnekleri tekniğin kullanımlarını daha fazla açıklamak için verilmiştir.

Bitki ve alglerin fotosentez cihazı integral membran (chl a) klorofil a bağlayan proteinleri b (chl b) ve karotenoidler (araba) bulunmaktadır. Bu pigment-protein kompleksleri hasat ışık enerjisi ve şarj ayırma 2 teşvik etmek için kullanılan reaksiyon merkezleri, bu uyarım enerji aktarmak aktiftir. Bunlar ayrıca, yüksek ışık hasarına 3,4 &#39;den fotosentetik düzenek korumak düzenleyici geri besleme mekanizmalarının katılmaktadırlar. Işık hasat kompleksi (LHCs) bitkiler ve yosun 5 ilişkili proteinlerin büyük bir ailenin oluşmaktadır. Ailenin her bir üyesinin öznel homojen saflaştırma komplekslerinin çok benzer kimyasal ve fiziksel özellikleri daha karmaşık hale gelmiştir. Buna ek olarak, saflaştırma işlemleri çoğu zaman, lipidler, pigment ya da başka yardımcı faktörler potansiyel kaybı ile sonuçlanabilir. In vitro yeniden oluşum Represents güçlü bir yöntem bu sorunların üstesinden gelmek için. Fotositem II&#39;nin (BHÇ-II) ile bağlantılı LHC ilk araştırmacılar bitki kloroplast ayrı delipide protein ve pigment ekstre edilmiştir. 1987 1 Plumley ve Schmidt in vitro yeniden ve daha sonra lityum mevcudiyetinde pigmentler ile ısıyla denatüre proteini birleştirildi dondurma ve eritme 1 üç döngü izledi dodesil sülfat (LDS). Bunlar, yeniden oluşturulmuş LHC komplekslerinin spektral özellikleri bitkilerden arıtıldı kompleksleri çok benzer olduğunu gösterdi. Organizmalardan saflaştırılmış komplekslerini izole edilmesindeki güçlük, birlikte, bağlı bazı içsel kendi kendine bağlanma özelliği BHÇ pigment protein kompleksleri, muhtemelen yeniden yapılandırma kolaylığı, başka araştırmacılar tarafından, yöntemin pratik kabul edilmesine yol açmıştır. Escherichia coli (E. coli) aşın fotosentetik proteinlerin yeniden oluşturma 6 Paulsen 1990 ve meslektaşları tarafından elde edilmiştir. E&#39;deE. coli, aşın zar proteinleri, genellikle, inklüzyon cisimcikleri içinde yer alır tesisleri için saflaştırma. Sulandırma, protein katlanmasını başlatır pigmentlerin ilave edildi LDS varlığında yeniden birleştirici protein içeren inklüzyon gövdelerinin yalıtılması, ısıl denatürasyonu ile elde edilir. LHCII kompleksinin katlanması, iki aşamalı bir işlemdir: ilk olarak, klorofil a 1 dakikadan daha az olarak bağlanmıştır; ikinci, klorofil b birkaç dakika 7 üzerine bağlanmış ve stabilize edilir. Katlama dinamikleri ilişkin bilgi temin edilmesine ilave olarak, yer yönelimli mutagenez ile kombine tüpte yeniden spesifik amino asitlerin stabilitesi için önemlidir (örneğin, 8,9) ya da pigment koordinasyon tanımlanmasını sağladı (örneğin, 10). Böyle pigment kompozisyon ya da deterjan gibi parametreleri ayarlayarak tekrar katlama koşulları Manipülasyon da unsurları Critica belirledikBöyle LHCII kompleksi için Ksantofiller gereği olarak doğru katlanması, l (örneğin, 1,11). Buna ek olarak, komplekslerine bağlanmış bireysel pigmentlerin özelliklerinin incelenmesi, in vivo olarak yeniden kompleksleri kullanılarak mümkün olmuştur (örneğin, 10). Burada açıklanan yöntem pigmentler izolasyonu (klorofil ve karotenoid) ıspanaktan ve yeşil deniz yosunu Chlamydomonas reinhardtii ile başlar. E. LHC proteinin ifadesi ve saflaştırılması inklüzyon cisimcikleri formunda Coli sonra Ni afinite kolonu ile LHC&#39;in yeniden oluşturulması ve daha sonra, ardından arıtma için, ayrıntılı olarak verilmiştir. Son aşamada, yeniden oluşturulmuş kompleksleri ayrıca serbest pigmentler ve katlanmamış apoprotein kaldırmak için sukroz gradyanlı santrifüjleme vasıtasıyla saflandırılır. Bu protokol üzerinde farklı laboratuvarlar tarafından tanıtıldı çeşitli değişiklikler içeren bir optimize prosedürünü temsilzaman 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Nylon cloth&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>Soft artists paint brush&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>O8001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP medium</td><td></td><td></td><td>see reference 17</td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td>see reference 19</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

Bitkiler ve yeşil algler, ışık, ışık hasat kompleksleri (LHCs), klorofiller ve karotenoidler koordinat bütün zar proteinlerinin, bir ailesi tarafından yakalanır. In vivo olarak, bu proteinler Tilakoid zarının eklenir kompleksler oluşturmak üzere pigmentler içeren katlanır kloroplastın. Birlikte kolayca izolasyonu sırasında pigmentler kaybedebilir gerçeği ile ailenin üyeleri, kimyasal ve fiziksel özellikleri, yüksek benzerlik, bir doğal halde saflaştırılması zor hale getirir. LHCs arasında homojen terkiplerinin elde edilmesi için alternatif bir yaklaşım, bu natif çok benzer özelliklere sahip kompleksler sonuçlanan saflaştırılmış pigmentler ve katlanmamış, apolar başlayarak bu in vitro kompleksleri tekrar oluşturmak için mümkün olduğunu gösterdi, 1987 1 Plumley ve Schmidt geliştirilmiştir kompleksleri. Bu in vitro bakteriyel eksprese edilen rekombinant proteinlerin kullanımına yol açtı </em&gt; sulandırma. Yeniden oluşturma yöntemi, çeşitli nedenlerle güçlüdür: (1) tek tek komplekslerinin saf müstahzarları ile elde edilebilir, (2) bir pigment bileşimi yapı ve fonksiyon etkilerinin değerlendirilmesi için kontrol edilebilir, (3) bir araya getiren proteinler fonksiyonel incelemek için mutasyona uğratılabilir tek tek kalıntılarında (örneğin, pigment bağlama bölgeleri) veya protein domaini (örneğin protein-protein etkileşimi, katlama) rolü. Bu yöntem, çeşitli laboratuvarlarda optimize edilmiş ve ışık hasat kompleksi en uygulanmıştır. Burada açıklanan protokol, şu anda laboratuvarda kullanılan in vitro ışık hasat kompleksleri yeniden yapılandırma yöntemi ayrıntıları ve yöntem uygulamaları açıklayan örnekler verilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.1K Görüntüleme.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Video: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Kimya

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Biyokimya

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and organization of these complexes is highly dynamic on both long and short time scales due to processes that adapt photosynthesis to changing environmental conditions (i.e., non-photochemical quenching, state transitions, and the long-term response). Historically, these processes have been described spectroscopically in terms of changes in chlorophyll fluorescence, and spectroscopy remains a vital method for monitoring photosynthetic parameters. There are a limited number of ways in which the underlying protein complex dynamics can be visualized. Here we describe a fast and simple method for the high-resolution separation and visualization of thylakoid complexes, native green gel electrophoresis. This method is coupled with time-correlated single photon counting for detailed characterization of the chlorophyll fluorescence properties of bands separated on the green gel.

Here we present a protocol to separate solubilized thylakoid complexes by Native Green Gel electrophoresis. Green gel bands are subsequently characterized by Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) and basic steps for data analysis are provided.

Ispanak Thylakoid Protein kompleksleri yerli yeşil Jel Elektroforez ve grup Time-Correlated tek foton sayma kullanarak karakterizasyonu tarafından ayrılması

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Çevre

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biyoloji

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Arabidopsis Fidesinde Klorofil Biyosentezinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis is triggered during the shift from the dark to the light in flowering plants. At the moment when etiolated seedlings are exposed to the first traces of sunlight, rapid (in order of seconds) conversion of protochlorophyllide into chlorophyllide is mediated by unique light-accepting protein complexes, leading via subsequent metabolic steps to the production of fully functional chlorophyll. Standard techniques for chlorophyll content analysis include pigment extraction from detached plant tissues, which does not apply to studying such fast processes. To investigate chlorophyll kinetics in vivo with high accuracy and spatiotemporal resolution in the first hours after light-induced de-etiolation, an instrument and protocol were developed. Here, we present a detailed procedure designed for statistically robust quantification of chlorophyll in the early stages of Arabidopsis de-etiolation.

Yazar Spotlight: De-etiolasyon sırasında klorofil sentezinin non-invaziv yüksek çözünürlüklü ölçümü

Here, we describe an advanced tool designed for chlorophyll biosynthesis monitoring during the early stages of Arabidopsis seedling de-etiolation. The novel methodology provides non-invasive real-time chlorophyll fluorescence imaging at high spatial and temporal resolution.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly ...

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler