This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

Ispanak Yapraklarından 1. Toplam Pigment Ekstraksiyon <ol><li> Öğütme soğuk tampon 100 ml ıspanak yaprağı (~ 20 g), homojen bir avuç 20 saniye boyunca bir karıştırıcı kullanılarak (Tablo 1 e bakınız). </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1500 x g&#39;de 20 um ve santrifüj filtre ürünü bir gözenek çapına sahip naylon kumaş iki katmanı boyunca solüsyonu filtre. </li><li> Yumuşak bir sanatçı ile kloroplast içeren topak soğutulmuş Yıkama Tamponu, 1 ml boya fırçası süspanse (Tablo 1 e bakınız). Topak tekrar askıda bırakılmıştır sonra, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj Yıkama Tamponu ve 50 ml solüsyon ilave edin. </li><li> Yıkama Tamponu 50 ml pelet (tilakoidler) tekrar süspansiyon yavaşça Süpernatantı ve (Tablo 1 e bakınız). </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj ve çözelti tamamen supernatant çıkarın. Bu noktada, boya oksidasyonu önlemek için karanlıkta aşağıdaki adımları gerçekleştirmek. </li&gt; <li> Na 2 CO 3 ile tamponlanmış% 80 aseton, 20 ml pigmentleri elde etmek için (Tablo 1 e bakınız) ~ ekleyin. Bazen vorteks, 10 dakika boyunca buz üzerinde çözeltisi bırakın. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ile hücresel bileşenlerini Pelet. Not: pigmentler tamamen ekstre değil ise, topak yeşil bir renge sahip olabilir ve 1,6 tekrar edilmelidir adım olacaktır. </li><li> Bir ayırma hunisi içine supernatant toplamak. Dietiletere 0.4 birimler eklemek şiddetle sarsmak ve gazın boşaltılması vanasını açın. </li><li> 0.33 M NaCl 0.8 hacimlerini ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. Fazların ayrılması için ~ 10 dakika bekleyin. Üst Eter fazı ekstre pigmentler içerir. Berrak bir alt faz çıkarın. Not: Ayırma açık değilse, dondurma ve faz ayrışmasını geliştirmek için bir çözüm eritin. </li><li> Uygun bir cam kap içine, ayırıcı bir huniye üstten dökülerek eter çıkarın. Gran bir kaşık ekleyerek Kurunitlerin susuz sodyum sülfat. Çözeltisi girdap ve eterden su absorbe kurutucu için ~ 5 dakika izin verir. NOT: sodyum sülfat tamamen kümeleştiler görünüyorsa bu adımı tekrarlayın; Eter yeterince kurutulur, bazı serbest yüzen kristaller olmalıdır. Bir su tabakası oluşması durumunda, ilave susuz sodyum sülfat ilave edilmeden önce bir yeniden süspanse ile çıkarın. </li><li> Arkasından, sodyum sülfat katı bırakarak yeni bir cam kaba eter süzün. </li><li> Döner bir speedvac ya da N2 akışı altında eter buharlaştırın. </li><li> % 100 aseton, 10 ml tamamen pigmentler çözülür. </li><li> % 80 aseton, 1 ml içine az miktarda (~ 3 ul) seyreltin ve soğurma spektrumunu ölçmek ve Porra ve arkadaşları tarafından tarif edilen yöntem ile Chl a / b oranı ve Chl konsantrasyonunu belirler. (1989) 15. </li><li> Aseton kadar kısım ve döner bir speedvac ya da N2 akışı altında kuru pigmentlertamamen buharlaştırıldı. -80 ° C de kurutuldu pigmentler saklayın. </li></ol> Ispanak gelen Karotenoidler 2. Ekstraksiyon <ol><li> Adımları 1,1-1,5 izleyin. Bu noktada, boya oksidasyonu önlemek için karanlıkta aşağıdaki adımları gerçekleştirmek. </li><li> Pigmentleri elde etmek için, Na 2 CO 3 (Tablo 1 e bakınız) ile tamponlanmış ~ 50 ml% 96 etanol içinde Tilakoid pelletini. 5 dakika boyunca buz üzerinde çözeltisi bırakın. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüj ile hücresel bileşenlerini Pelet. Not: pigmentler tamamen ekstre değil ise, topak yeşil bir renge sahip olabilir ve 2,2 tekrar edilmelidir adım olacaktır. </li><li> Supernatant toplamak ve (w / v) sabunlaştırılmasını başlatmak için% 80 KOH ve 0.1 hacim ekleyin. </li><li> 4 ° CO / N de çözümü bırakın, sıkıca kapatılmış ve ışıktan korunmalıdır. </li><li> Bir ayırma hunisi içine çözeltisi toplayın. Dietil eter 1 hacim ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 0.8 vol Ekle0.33 M NaCl Umes ve hafifçe karıştırın. Fazların ayrılması için ~ 10 dakika bekleyin. Üstünde turuncu eter fazı sabunlaştırılmış karotenoidler içerir. Huninin vana içinden boşaltılmasını tarafından yeşil alt faz çıkarın. </li><li> 3 hacim su ilave edin ve potasyum hidroksit çıkarmak için yavaşça karıştırın. Katmanlar ayrılmaya bırakılır. Not: üst faz bulutlu görünürse, NaCI, az miktarda ilave (örneğin, 3 çözeltisi 200 ml NaCI g) ve yavaşça girdap eritin. </li><li> Huninin vana ile süzülmesiyle alt faz çıkarın. </li><li> Takip 1,10-1,13 adımları. </li><li> % 80 aseton, 1 ml içine az miktarda (~ 3 ul) seyreltin ve% 80 aseton içinde 440 nm&#39;deki absorpsiyon spektrumları ölçer. Konsantrasyonunu belirlemek için, karotenoidler için ortalama yok olma katsayısı kullanılan aşağıdaki formül 16 (440 ε = 255): Araba [mg / ml] = (Abs, 440 nm / 225) x 11 (optik yol) = 1 cm. </li><li> Kısım ve kuru carotenoibir speedvac veya tüm dietileter kadar N2 akışı altında buharlaştırılmıştır DS edilmiştir. -80 ° C de kurutuldu pigmentler saklayın. </li></ol> Chlamydomonas 3. Toplam Pigment ve Karotenoit Ekstraksiyon reinhardtiinin <ol><li> C büyütün yüzey üzerine sıvı kültür az miktarda yayılması ile bir petri çanağı içinde katı ortam TAP 17 reinhardtii. 20 ľmol fotoğraflar PSA m -2 sn sürekli aydınlatma akı altında büyümeye -1 hücre yeşil tabaka görünür oluncaya kadar. </li><li> Steril bir aşılama döngü kullanılarak C arasında bir miktar hasat Katı TAP ortamından reinhardtii bir 1 L şişe TAP ortamı 17 500 ml hücreleri koydu. 20 umol m-2 resimleri, PSA sn&#39;lik bir sürekli aydınlatma akışı altında 170 rpm&#39;de çalkalanarak 25 ° C&#39;de kültür büyütün -1. </li><li> 5-6 gün sonra, kültür logaritmik fazın sonuna ulaşmalıdır (6 x 10 6 hücre / mLya da 750 nm&#39;de optik yoğunluk 2-2.5). 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 4000 x g&#39;de santrifüje kültürü. </li><li> Toplam pigment çıkarımı için, adımları 1,6-1,15 izleyin. </li><li> C. tam büyüme kültürü 500 ml başlayarak toplam pigment ekstresinin verim reinhardtii + b / mL, 0.5 mg a CHL bir konsantrasyon ile çözelti yaklaşık 5 ml&#39;dir. </li><li> Karotenoidler çıkarımı için, adımları 2,2-2,12 izleyin. </li></ol> İçerme Kuruluşlarının 4. saflaştırılması <ol><li> Standart moleküler biyoloji prosedürleri kullanılarak bir kaynaşmış bir C-terminal His etiketi ile sonuçlanan bir ekspresyon vektörü içine ilgi LHC&#39;in proteininin kodlama dizisi klonu. E. içine bu yapı Dönüşümü örneğin, BL21 (DE3) gibi E.coli host suşu. </li><li> Hazırlama Liziz tamponu, deterjan tamponu, Triton tamponu TE (Tablo 1), 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile, uygun antibiyotik ile LB ortamı 18. </li><li> Bir SINGL seçinE E. Standart prosedürler kullanılarak, uygun 6 antibiyotiklerle LB ortamının ~ 5 ml yeni boyanmış bir plakaya ekspresyon klonu içeren E. coli kolonisi. En az 16 saat boyunca 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> O 2.5 ml /, uygun antibiyotik ile takviye edilmiş LB 250 ml bir 1 L&#39;lik Erlenmeyen şişesi içine K kültürü. </li><li> 2-3 saat boyunca hücrelerin büyümesine 220 ​​rpm&#39;de 37 ° C&#39;de (ya da O.D. oluşana kadar 600 ~ 0.6). </li><li> 1 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ilave edin. 220 rpm&#39;de 3-4 saat 37 ° C&#39;de hücreler büyümeye devam etmektedir. </li><li> Önceden tartılmış bir santrifüj tüpüne 4 ° C&#39;de 5000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj kültür. Iyice Süpernatantı atın ve yeniden tartma ve santrifüj tüpü ağırlığı çıkarılarak ağırlık pelet belirler. </li><li> E. süspanse 0.8 ml / güçlü döndürülerek liziz tamponu g E. coli hücre topağı. Not: Alternatif olarak, hücre topağı -80 ° C&#39;de dondurulabilirDaha sonra kullanılmak üzere ° C. Dondurulmuş bir pelet ile başlanırsa, liziz tamponu ilave edilmeden önce tam olarak çözünmesine izin. </li><li> Hücrelerin gramı başına 2 mg lisozim ekleyin ve 30 dakika boyunca arada sırada burgaç gibi ıslak buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 20 ug / ml DNAz, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCI, 20 ug / ml RNAse ekleyin. Karıştırın ve 30 dakika için buz üzerine yerleştirilmiştir. </li><li> Hücre gramı başına soğuk Deterjan tampon maddesinin 2 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve 5 dakika boyunca oda tutun. </li><li> 2 ml santrifüj tüplerine transfer (gerekirse iki tüp içine bölünmüş). 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüje cisimciği: pelet. </li><li> Tampon soğuk Triton 1 ml ekleyin ve tamamen sonification tarafından pelet (20 sn aralıklarla 3 bakliyat x 5 sn x% 50 güç) tekrar süspansiyon. NOT: sonification sırasında soğuk tutmak için buzlu su ile çevrili küçük bir beher tüp var. Birden fazla tüp durumunda, yeniden süspansiyon haline getirilmesi sonra bir tüp içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş cisimciği birleştirir. </li><li> 12,000 10 dakika boyunca santrifüj4 ° C&#39;de xg cisimciği: pelet. </li><li> Adımı tekrarlayın 4.13 ve 4.14 iki kez. </li><li> Triton tampon kaldırmak için bir yıkama için sonifikasyon soğuk TE 1 ml cisimciği yeniden süspanse edin. 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüje cisimciği: pelet. </li><li> Sonifikasyon soğuk TE 1 ml pelletini. </li><li> Bu Bradford tahlili 19 gibi standart yöntemler ile protein konsantrasyonu değerlendirin. -20 ° C&#39;de saklayın inklüzyon cisimleri alikotları. </li></ol> 5. Sulandırma Absorbans Qy bölgesine (600-750 nm) olarak ölçülür, bu protokol, genellikle 4 OD&#39;ye ile yeniden protein 1-2 ml verir. Bakım işlemi sırasında uygun oranlarının muhafaza edilmesi için gereken miktarı, ancak, istendiği gibi ayarlanabilir. <ol><li> 2x Sulandırma Tamponu,% 20 RG, 2M KCI, TE, Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Aşağıdaki s gerçekleştirinloş ışıkta Teps&#39;in. </li><li> 2 ml mikrofuge&#39;de tüp 400 ul TE toplam LHC Eklenmesi Organları 800 mikrogram süspanse. 2x Sulandırma Tampon ve vorteks kısaca 400 ul ekleyin. </li><li> 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyon için β-merkaptoetanol (14.8 M stok), 0.6 ul ekleyin. 98 ° C&#39;de 1 dakika boyunca proteini ısıtın. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında Vortex kısa ve yer. </li><li> 1-2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde bir banyo sonikatörü içinde 1 dakika ya da bir yer girdaplanarak 30 ul% 100 EtOH toplam kurutulmuş klorofil pigmentlerin 500 ug ve 80 ug karotenoid pigmentler yeniden süspanse edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15,800 xg ~ 30 sn pigment karışımı Spin ve hiçbir pelet olduğunu onaylayın. Pelet varsa, vorteksleme ve / veya sonifikasyon tekrarlayın. ÖNEMLİ: yeniden süspansiyon ve spin sonra, hemen proteine ​​pigment eklemek veya toparlayıp tekrar yeniden süspanse gerekecektir. </li><li> Vorteks edilirken yavaşça soğutuldu proteine ​​pigment karışımı ekleyin. Girdabına 5-10 s DevamIslak buz üzerinde ec ve yer tüpü. Protein tüpün üst taşabilir de dinç bir şekilde vorteks için dikkatli olun. </li><li> % 20 Octyl β-D-glukopiranozide (OG) (son konsantrasyon% 2), vorteks kısaca 94 ul ekleyin ve buz 10 dakika devam. </li><li> Kısaca M KCI 2 (nihai konsantrasyon 150-200 mM) girdap 90 ul ilave edin ve 20 dakika buz üzerinde tutun. NOT: kolon hazırlama (Bölüm 6) şu anda başlatılabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15,800 x g&#39;de 10 dakika boyunca spin. 10 ml tüp (LDS çöktürülmüş) pelet bozmadan süpernatantı. Soğuk ve ışıktan korumalı tutun. </li></ol> 6. Nikel Kolonu Saflaştırması <ol><li> RG tamponu, RG durulama tamponu Ayrıştırma Tamponu: Tablo 1 de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın. </li><li> Bu aşama hava ve aşağıdaki aşamaları esnasında, kolonun iç alır sağlayan bir peristaltik pompa, bir Ni-Sefaroz sütunu (1 mi) ya da eşdeğer bağlayın. </li><li> T hızını ayarlamaO, 1 ml / dak pompa ve depolama çözeltinin çıkarılması için su ile 5-10 ml sütunu yıkayın. </li><li> OG tamponu 3-4 ml sütun dengelenmesi. </li><li> Kolona protein örnek ve yük OG tampon 3-4 ml ilave edilir. Not: protein LDS çıkarılmasından sonra daha uzun bir süre 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka süresi edilmiş ise 1 dakika ilave LDS çökelmesini kaldırmak için, 4 ° C&#39;de 15,800 x g hızında tekrar dönerler. </li><li> OG tamponu, 5 ml ile sütun durulayın. </li><li> RG durulama tamponu 2 ml ile sütun durulayın. </li><li> 3 mi tampon maddesi ile bağlanmış proteininin elüt edilmesi. Yeniden oluşturulmuş protein içeren yeşil eluteye toplayın. NOT: Bu genellikle toplam olarak yaklaşık 1 ml olmuştur. </li></ol> 7. Sükroz Gradyan Santrifüjü Geri <ol><li> Sakroz çözeltisi,% 0.06 β-DM 0.01 M HEPES, pH 7.6: Tablo 1 de tarif edildiği gibi aşağıdaki çözümleri hazırlayın. </li><li> -20 ° CO / N o da sukroz çözeltisi ve dondurulması ile ultrasantrifüjdeki tüpleri doldurmakR, -80 ° C&#39;de en az 1 saat. </li><li> Dondurucudan tüp çıkarın ve 4 ° C&#39;de dokunulmadan çözülme sağlar. Not: donma / çözülme işlemi 0.1 ila 1 M sukroz ile bir gradyan oluşturur. Bir 15 ml tüp, tipik olarak yaklaşık 3 saat içinde çözülür. </li><li> Dikkatli bir şekilde üst aşama 6.8 &#39;de nikel Sefaroz sütunundan elüt yeşil fraksiyon olarak aynı hacimde çıkarın. Daha sonra gradyanı rahatsız etmemek için yavaş yavaş üstüne yeniden örnek yüklemek. </li><li> Hızlanma ve fren olmayan durdurma yavaşlaması, 18 saat boyunca, SW-41 ya da SW-60 sallanan kepçeli rotor kullanılarak bir ultrasantrifüjdeki Tüpleri dengeleyin, ve 4 ° C sıcaklıkta 200,000 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Dikkatlice forseps ile tüp sahibinden degrade çıkar. Üst kısmını toplamak için bir kör deliğe sahiptir uzun bir iğne ile bir şırınga kullanın. Not: Alternatif olarak, bir iğne ile delme ve tüp damla toplayarak alttan fraksiyonlarım toplamak. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

Membran proteinleri çalışmak çok kolay değil. Doğal zar proteinlerinin izolasyonu protein zarar verebilir ve temel kofaktör kaldırmak deterjanlarla lipid çift katmanından çözündürülmesi için ihtiyacı karmaşık hale gelir. Bu proteinler ayrıca biyolojik zarların düşük seviyelerde mevcut olabilir, ya da zor tek komplekslerinin saflaştırılması kılan hafif hasat kompleks durumunda olduğu gibi, yakın ilişkili proteinler ile karıştırılabilir. E. coli &#39;de heterolog protein ekspresyonu E. coli ve in vitro yeniden yapımında Bu sorunları önlemek için imkanı sunar. in vitro homojenliğe 24 saflaştırılarak edilemez kompleksleri incelemek için kullanılabilir doğal kompleksleri 20,21,23 ve dolayısıyla çok benzer özelliklere sahip kompleksleri sulandırılması ve katlanmış proteinler, sonuç saflaştırılması - 27. Bu yöntem attainab kolaylıkla, ıspanak, kullanırtoplam pigment ve karotenoid hazırlıkları için bir kaynak olarak le yıl boyunca,. Yosunlar için nativ proteinlerin bazı reconstitutions, yosunlar saflaştırılmış pigmentlerin kullanılması nedeniyle farklı pigment bileşimler tercih edilir. Chl a / b oranı ve Chl / otomobil oranı ne olursa olsun, pigment kaynağı aynı kalır. Bu sulandırma verimliliği genellikle% 35 civarındadır 28 olduğunu fark etmek önemlidir. Bu nedenle, yeniden oluşumun ardından çözeltiden Bağlı olmayan pigmentler ve katlanmamış apoprotein kaldırmak için gereklidir. Iki aşamalı bir saflaştırma protokolü (ayrıca sonuçları bakınız), bu protokolde sunulmuştur. Bununla birlikte, sukroz gradyanlı adım APO ve sanal-proteinin tam olarak ayrılmasına izin vermez unutulmamalıdır. Apoprotein fonksiyonel ölçülerde müdahale etmeyen, böylece pigmentler ihtiva etmez ve en gibi analizler için bu bir sorun değildir. Bununla birlikte, bu durumda, tamamen fr apoprotein kaldırmak için gereklidiryeniden kompleksi (örneğin protein stoikiometriye pigment hesaplamak için) ihtiva eden işlem, bir anyonik değiştirme sütunu (bakınız Passarini ve ark. detayları için 29, 2009) kullanılabilir. Kapasite in vitro izole edilmiş yeniden birleştirici pigmentler ile ışık toplayıcı proteinlerin yeniden kapatmak için, böylece elde edilen kompleksin özelliklerini değiştirmeden, çeşitli şekillerde yeniden oluşturma &quot;çevre&quot; değiştirerek kompleksleri &quot;ayarlamak&quot; için bir fırsat sağlar. Örneğin, sulandırma sırasında pigment bileşimi değişen değiştirilmiş bir pigment bileşimi ile bir kompleks neden olabilir. Bu özellik, çeşitli pigmentler kompleksinin yapısı ve kararlılığı üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir. 1 ve 2.9 arasında bir Chl / araç oranı l: süresi ıspanak elde edilen pigment preparasyonu 3 bir Chl a / b oranı 1. Bu oran, tipik olarak n ile aynı özelliklere sahip olan bir sulandırma proteini üretirbirini Ative. 33 - Bununla birlikte, arıtılmış, Chl a veya b eklenmesiyle Chl a / b oranı ayarlanması bağlanma yerleri 30 seçiciliği değişken bağlı olarak farklı pigmentlerin bağlayıcı etkileyebilir. Pigment bağlama sitelerinin çoğu Chl a ya da b Chl tamamen selektif değildir, ama her ikisi için uygun olabilir, çünkü bu, mümkün olmasına rağmen, farklı afinite ile 10,30,34. 38 - Benzer şekilde, karotenoid bağlanma yerleri, ayrıca birden Ksantofil tür 8,35 karşılamak mümkün olduğu gösterilmiştir. CP26, çeşitli pigment bileşimleri kullanılarak yüksek bitkiler, diğer pigment-protein kompleksinin farklı reconstitutions Tablo 2&#39;de 39 olarak gösterilmiştir. Bu reconstitutions, özellikle pigmentler 39 için bağlanma afinitesini belirlemek için kullanıldı. Bu aynı pigment c ile bir kompleks elde etmek için dikkat çekicidir1: doğal olarak omposition pigment karışımı Chl a / b oranı 3 olmalıdır. Bu, daha yüksek bitki 20,40 her BHÇ kompleksleri için geçerli görünmektedir. Yeniden oluşturma tekniği ile, moleküler biyoloji kombinasyonu, Chl bağlayıcı kompleksinin özellikleri daha ayrıntılı olarak incelenecektir sağlar. 44 - kompleksleri, ya da protein-protein etkileşimleri katılımları kararlılığı ve katlanma farklı bir protein alanlarının önemi, apoprotein kesilmesi ya da rastgele mutagenez 8,41 yapılarak belirlenmiştir. 52 - Farklı pigmentlerin koordinasyonu için önemli bir tek amino asit kalıntıları tek tek pigmentlerin özelliklerini analiz ya da kompleks 10,28,29,45 bir fonksiyon ve stabilite etkilerinin değerlendirilmesi için, yer yönlendirmeli mutagenez ile değiştirilebilir. Şekil 6 ile Lhcb4 (CP29) yeniden53, 216 konumunda bir mutasyonu histidin. vahşi tip ve mutant komplekslerinin pigment bileşimin bir karşılaştırması mutasyon hedef sitesi WT kompleksi içinde Chl a barındırır gösteren bir molekül, bir Chl kaybını uyardığını göstermektedir. WT ve mutant absorpsiyon spektrumları arasındaki farklar, pigment içeriğine normalleşmeyi üzerine de kayıp pigmentin emme özelliklerini gösterir. Bu durumda, fark Chl His216 tarafından koordine edilen bu dalga boyunda absorbe eder (bu, mutant ile ilgili daha fazla bilgi için ve spektroskopik özellikleri Mozzo ve ark. 2008 53) gösteren, 680 nm &#39;de, ana zirve görülebilir. Mutasyon analizi, aynı zamanda pigmentlerin 54 spektroskopik özellikleri üzerindeki çevre etkisini belirlemek için de kullanılabilir. Sonuç olarak, ışık hasat proteinlerini pigment Protei sonuçlanan in vitro yeniden oluşturulabiliryerli kompleksleri çok benzer özelliklere sahip n kompleksleri. Ayrıca, ileri çalışmalar için yüksek verim ve saflıkta olan bir protein preparasyonunu elde ederlerken, bu şekilde, doğal proteinlerin izole zorlukları ortadan kaldırılır. 3 önemi: otantik bir kompleks oluşturan 1 Chl a / b oranı vurgulanmıştır ve yeniden vahşi tip ve mutant LHCs örnekleri tekniğin kullanımlarını daha fazla açıklamak için verilmiştir.

Bitki ve alglerin fotosentez cihazı integral membran (chl a) klorofil a bağlayan proteinleri b (chl b) ve karotenoidler (araba) bulunmaktadır. Bu pigment-protein kompleksleri hasat ışık enerjisi ve şarj ayırma 2 teşvik etmek için kullanılan reaksiyon merkezleri, bu uyarım enerji aktarmak aktiftir. Bunlar ayrıca, yüksek ışık hasarına 3,4 &#39;den fotosentetik düzenek korumak düzenleyici geri besleme mekanizmalarının katılmaktadırlar. Işık hasat kompleksi (LHCs) bitkiler ve yosun 5 ilişkili proteinlerin büyük bir ailenin oluşmaktadır. Ailenin her bir üyesinin öznel homojen saflaştırma komplekslerinin çok benzer kimyasal ve fiziksel özellikleri daha karmaşık hale gelmiştir. Buna ek olarak, saflaştırma işlemleri çoğu zaman, lipidler, pigment ya da başka yardımcı faktörler potansiyel kaybı ile sonuçlanabilir. In vitro yeniden oluşum Represents güçlü bir yöntem bu sorunların üstesinden gelmek için. Fotositem II&#39;nin (BHÇ-II) ile bağlantılı LHC ilk araştırmacılar bitki kloroplast ayrı delipide protein ve pigment ekstre edilmiştir. 1987 1 Plumley ve Schmidt in vitro yeniden ve daha sonra lityum mevcudiyetinde pigmentler ile ısıyla denatüre proteini birleştirildi dondurma ve eritme 1 üç döngü izledi dodesil sülfat (LDS). Bunlar, yeniden oluşturulmuş LHC komplekslerinin spektral özellikleri bitkilerden arıtıldı kompleksleri çok benzer olduğunu gösterdi. Organizmalardan saflaştırılmış komplekslerini izole edilmesindeki güçlük, birlikte, bağlı bazı içsel kendi kendine bağlanma özelliği BHÇ pigment protein kompleksleri, muhtemelen yeniden yapılandırma kolaylığı, başka araştırmacılar tarafından, yöntemin pratik kabul edilmesine yol açmıştır. Escherichia coli (E. coli) aşın fotosentetik proteinlerin yeniden oluşturma 6 Paulsen 1990 ve meslektaşları tarafından elde edilmiştir. E&#39;deE. coli, aşın zar proteinleri, genellikle, inklüzyon cisimcikleri içinde yer alır tesisleri için saflaştırma. Sulandırma, protein katlanmasını başlatır pigmentlerin ilave edildi LDS varlığında yeniden birleştirici protein içeren inklüzyon gövdelerinin yalıtılması, ısıl denatürasyonu ile elde edilir. LHCII kompleksinin katlanması, iki aşamalı bir işlemdir: ilk olarak, klorofil a 1 dakikadan daha az olarak bağlanmıştır; ikinci, klorofil b birkaç dakika 7 üzerine bağlanmış ve stabilize edilir. Katlama dinamikleri ilişkin bilgi temin edilmesine ilave olarak, yer yönelimli mutagenez ile kombine tüpte yeniden spesifik amino asitlerin stabilitesi için önemlidir (örneğin, 8,9) ya da pigment koordinasyon tanımlanmasını sağladı (örneğin, 10). Böyle pigment kompozisyon ya da deterjan gibi parametreleri ayarlayarak tekrar katlama koşulları Manipülasyon da unsurları Critica belirledikBöyle LHCII kompleksi için Ksantofiller gereği olarak doğru katlanması, l (örneğin, 1,11). Buna ek olarak, komplekslerine bağlanmış bireysel pigmentlerin özelliklerinin incelenmesi, in vivo olarak yeniden kompleksleri kullanılarak mümkün olmuştur (örneğin, 10). Burada açıklanan yöntem pigmentler izolasyonu (klorofil ve karotenoid) ıspanaktan ve yeşil deniz yosunu Chlamydomonas reinhardtii ile başlar. E. LHC proteinin ifadesi ve saflaştırılması inklüzyon cisimcikleri formunda Coli sonra Ni afinite kolonu ile LHC&#39;in yeniden oluşturulması ve daha sonra, ardından arıtma için, ayrıntılı olarak verilmiştir. Son aşamada, yeniden oluşturulmuş kompleksleri ayrıca serbest pigmentler ve katlanmamış apoprotein kaldırmak için sukroz gradyanlı santrifüjleme vasıtasıyla saflandırılır. Bu protokol üzerinde farklı laboratuvarlar tarafından tanıtıldı çeşitli değişiklikler içeren bir optimize prosedürünü temsilzaman 1,6,10,12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

Bitkiler ve yeşil algler, ışık, ışık hasat kompleksleri (LHCs), klorofiller ve karotenoidler koordinat bütün zar proteinlerinin, bir ailesi tarafından yakalanır. In vivo olarak, bu proteinler Tilakoid zarının eklenir kompleksler oluşturmak üzere pigmentler içeren katlanır kloroplastın. Birlikte kolayca izolasyonu sırasında pigmentler kaybedebilir gerçeği ile ailenin üyeleri, kimyasal ve fiziksel özellikleri, yüksek benzerlik, bir doğal halde saflaştırılması zor hale getirir. LHCs arasında homojen terkiplerinin elde edilmesi için alternatif bir yaklaşım, bu natif çok benzer özelliklere sahip kompleksler sonuçlanan saflaştırılmış pigmentler ve katlanmamış, apolar başlayarak bu in vitro kompleksleri tekrar oluşturmak için mümkün olduğunu gösterdi, 1987 1 Plumley ve Schmidt geliştirilmiştir kompleksleri. Bu in vitro bakteriyel eksprese edilen rekombinant proteinlerin kullanımına yol açtı </em&gt; sulandırma. Yeniden oluşturma yöntemi, çeşitli nedenlerle güçlüdür: (1) tek tek komplekslerinin saf müstahzarları ile elde edilebilir, (2) bir pigment bileşimi yapı ve fonksiyon etkilerinin değerlendirilmesi için kontrol edilebilir, (3) bir araya getiren proteinler fonksiyonel incelemek için mutasyona uğratılabilir tek tek kalıntılarında (örneğin, pigment bağlama bölgeleri) veya protein domaini (örneğin protein-protein etkileşimi, katlama) rolü. Bu yöntem, çeşitli laboratuvarlarda optimize edilmiş ve ışık hasat kompleksi en uygulanmıştır. Burada açıklanan protokol, şu anda laboratuvarda kullanılan in vitro ışık hasat kompleksleri yeniden yapılandırma yöntemi ayrıntıları ve yöntem uygulamaları açıklayan örnekler verilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.1K Görüntüleme.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Video: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Biyoloji

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

PDZ bağımlı CFTR makromoleküler Sinyal Kompleksleri İn Vitro Analizi

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca<sup&gt; 2+</supArabidopsis Bitkilerde&gt; Sinyalleri

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

Tek hücreli alg Conjugating klonal bir kültür kurulması

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...