Bu yöntemler biyomalzemeler alanında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Özellikle kemik yenilenmesi için. Biyomalzemelerin etkinliğini ve potansiyel bağışıklık tepkilerini değerlendirmek için kullanılırlar.
Bu multidisipliner platformun en büyük avantajı, kemik onarımı için kullanılan biyomalzemelerin biyouyumluluğunu tahmin etmek için bir dizi parametre sağlamasıdır. Bu in vitro ve in vivo kemik tekniklerinin etkileri diğer kemik bozukluklarına kadar uzanır. Yeni ortopedik biyomalzemelerin preklinik tarama ihtiyacı nedeniyle.
Dermatolojik metodoloji kemik iyileşmesi için biyomalzemeler hakkında bilgi sağlayabilir, aynı zamanda başka bir klinik endikasyon için biyomalzeme değerlendirmelerine de uygulanabilir. Primer osteoblastlardan aspire kültür ortamı osteojenik mineralizasyon ortamının eklenmesinden 14 gün sonra. 0,5 mililitre 1X PBS ile iki kez durula.
Daha sonra %10 tamponlu formalin çözeltisi 0,5 mililitre ekleyerek ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka yada bırakarak hücreleri düzeltin. 10 dakika sonra, tek kullanımlık pipet ile %10 tamponlu formalin aspire ve ultrasaf su 0,5 mililitre ile iki kez yıkayın. Daha sonra sabit osteoblastlara 250 mikrolitre 40 milimolar Alizarin Red S boyama çözeltisi ekleyin.
Ve oda sıcaklığında tabağı dakikada 100 sallayarak bir çalkalayıcıda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Boyama çözeltisi ile kuluçka dan sonra, tek kullanımlık pipet ve ultrasaf su bir mililitre ile durulayın boyama çözeltisi aspire. Durulama çözeltisi spesifik olmayan lekeleri gidermek için temiz çıkana kadar bu adımı 5-10 kez tekrarlayın.
Son yıkama azarlama sonra, soğuk PBS bir mililitre ekleyin. Ve tabağı oda sıcaklığında 10 dakika daha önce olduğu gibi bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Daha sonra, lekeli beta trikalsiyum fosfat diskleri yeni bir kuyuya aktarın ve mineralizasyonu kaydetmek için düz yataklı bir tarayıcı ile plakaları tarayın.
Görüntü yakalama sonra,% 10 cetylpyridinium klorür çözeltisi 250 mikrolitre ekleyin ve Alizarin Red S boya ayıklamak için 15 dakika sallayın. Daha sonra çözeltiyi kuyulardan 1,5 mililitrelik tüplere ve santrifüje 17,000 x g'da oda sıcaklığında beş dakika aktarın. 1,5 mililitrelik bir tüpte 1:10 ila 1:20'lik bir seyreltme rasyonda ekstraktı %10 cetilpyridinium klorür çözeltisi ile seyreltin.
Daha sonra seyreltilmiş her numunenin 300 mikrolitresini 96 kuyulu plakanın kuyularına aktarın. Sadece% 10 cetylpyridinium klorür içeren iki boş kuyular içerir. Daha sonra, standart bir eğri oluşturmak için 40 milimetre Alizarin Red S boyama çözeltisini %10 cetylpyridinium klorür çözeltisi ile seyrelterek 4 400 mikromolar arasında değişen yedi Alizarin Red S referans standardı hazırlayın.
Her standarttan 300 mikrolitreyi plakaya yükleyin. Son olarak, 520 nanometre de örnekler, boşluklar ve referans standartları emiciler okuyun. Kalça ekleminde bacaklar kaldırmak için steril makas kullanarak femurlar ve bir ötenazi fare tibiae kemik iliği osteoplast öncüleri izole.
Diz ve ayak bileği eklemlerinde bacaklar kesin ve steril neşter ve forceps ile yumuşak doku kaldırın. Epifizleri kesin. Lümen içine kemik büyüme ortamı bir mililitre ile dolu bir şırınga bağlı bir 27 gauge iğne takın ve altı santimetre steril Petri çanak içine iliği dışarı floş.
Tüm femurlar ve tibiae için bu tekrarladıktan sonra, 50 mililitrekonik tüp hücre süspansiyon aktarın. Altı santimetrelik Petri kabını beş mililitre kemik büyüme ortamıyla yıkayın ve aynı 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Santrifüj 350 x g dört santigrat derecede beş dakika.
Santrifüj ün ardından osteoklast farklılaşma ortamının her bir mililitresinde hücreleri yeniden askıya alın. Bir BALB/c fare, 24 kuyulu bir kültür plakası için yeterli sayıda osteoklast öncüsü sağlar. Biyomateryale kemik büyüme ortamında asılı olan primer osteoblastları ve santimetre kare başına 8.8*10^4 hücredeki kontrolleri ekleyin.
Beta trikalsiyum fosfat diskleri, kontrollü büyükbaş kemiği ve doku kültürü plastikleri burada kullanılmaktadır. 24 saat boyunca %5 karbondioksitte 37 derecede kuluçkaya yat. 24 saat sonra, kültürlü primer osteoblastlar için taze izole kemik iliği osteoklast öncüleri ve osteoklast farklılaşma ortamı ekleyin ve kültür beş gün boyunca kuvöze dönmek 37 santigrat yüzde beş karbondioksit santigrat.
Her gün taze hazırlanmış osteoklast farklılaşma ortamı ile orta değiştirin. Daha sonra farklılaşmayı değerlendirmek için tartarat dirençli asit fosfataz için osteoklastları lekeleyin. Anestezisekiz haftalık BALB/c farenin kafa derisini tıraş edin ve yüzeyi %7,5 povione iyot çözeltisi ve %70 etanol ile temizleyin.
İşlem sırasında kurumasını önlemek için gözleri oftalmik merhemle kaplayın. Bir parmak ve kuyruk kıskaç bir reaksiyon eksikliği ile anestezi uygun bir düzeyde emin olun. Sonra bir orta hat sagittal kesi yaptıktan sonra bir neşter ile kazıyarak sağ parietal kemik üzerinde paracranium bağ dokuları kaldırmak.
Sonra sağ parietal kemik kritik boyutlu bir kusur oluşturmak için dakikada 2000 rotasyonları dört milimetre çapında steril bir diş trefin kullanın. Sağ parietal kemiği çentiklerken ve ektokortext ve bazı endokorteksten keserken bölgeyi sürekli olarak steril tuzlu solüsyonla sulayın. Dera Mater'in zarar görmesini önlemek için, kalan endokorteksi kırmak için küçük bir periosteal asansör kullanın.
Sonra dikkatle calvarial kemik kaldırmak ve kaldırmak için forseps kullanın. Ortaya çıkan kusur dairesel ve çapı yaklaşık 3,5 milimetre olmalıdır. Daha sonra, beta trikalsiyum fosfat kollajen köpük ile kalvariyal defekt doldurun, steril PBS presoaked.
Biyomalzemeyi yerinde tutmak için, defektin sonunda ki 0,5 mikrolitre doku yapıştırıcısını iki zıt noktaya uygulayın. Sonra emilir olmayan bir dikiş ile cildi kapatın. Sırtına anestezili bir fare yerleştirin, karın kürktıraş ve% 7.5 povidon iyot çözeltisi ve% 70 etanol ile tıraş yüzeyi temizleyin.
Karın linea alba boyunca deri ile sekiz milimetre uzunluğunda orta hat kesi yaptıktan sonra, implant PBS deri altında biyomalzeme ıslatılmış. Sonra emilemez bir dikiş ile cilt dikiş. Sekiz hafta sonra implantasyon, ötenazi fareden çevre doku ile implantasyon bölgesini boşaltın.
Bu resim, açık çubuklarda gösterilen beta trikalsiyum fosfat disklerinde büyümenin, yedi ve 14 günlük kültür de doku kültürü plastiğindeki büyümeye kıyasla osteoblast canlılığını etkilemediğini göstermektedir. Kültürlü osteoblastlar 14 gün sonra Alizarin Kırmızı S ile boyandı. Mineralizasyon orta kontrollerde, sadece orta alanda kültürlenmiş osteoblastlara göre daha yüksekti.
Ve süspansiyon kültür kuyularında beta trikalsiyum fosfat diskleri üzerinde. Cerrahi kaynaklı kritik boyutlu kalvarial defekt boş bırakıldığında, tüm defekti kaplayan ince bir tabaka gözlendi, ancak operasyon sonrası 12 hafta içinde anlamlı bir kemik oluşumu mevcut değildi. Buna karşılık, defekt beta trikalsiyum fosfat kollajen köpük içerdiğinde, bazı kan damarları ve inflamatuar hücreler de dahil olmak üzere yoğun fibröz doku ile çevrili köpük kalıntıları kemik oluşumu kanıt olmadan defekt alanı köprü.
Deri altı beta trikalsiyum fosfat kollajen köpük implantasyonusonrasında hematokninve Eozin lekeli kesitlerde yabancı cisim devi hücrelere inflamatuar yanıt sekiz hafta içinde Masson'un trikrom lekeli kesitlerinde fibrozis kanıtı olarak gözlendi. Buna karşılık, sham kontrollerin implantasyon bölgesi minimal inflamasyon ve fibrozis vardı. Bu prosedürü denerken hayvanzarar vermeden kalvaryum kesin ve tekrarlanabilir çentik yapmak önemlidir.
Osteoklast farklılaştırmaları tahlilleri ve periton immün modelleri içine yüksek iş lenme gibi bu prosedürün diğer yöntemleri takip biyomalzemeler ve bağışıklık yanıtı türü osteoklast yanıtı gibi ek sorulara cevap vermek için önceden bilgilendirilebilir.
