Araştırmamızın kapsamı, model organizma olarak Mytilus galloprovincialis'in hemosit motilitesinin değerlendirilmesine dayalı olarak kirleticilerin toksisite ve ekotoksisitesinin hızlı ve hassas bir şekilde değerlendirilmesi için yeni bir in vitro yöntem geliştirmektir. İn vitro ve in vivo biyo tahliller gibi etkiye dayalı yöntemler, çevresel kimyasal kirleticilerin canlı organizmalar üzerindeki etkilerini tespit etmek için yenilikçi araçları temsil eder. Bu yöntemler, çevresel biyoizleme ve risk değerlendirmesinde araç olarak hizmet edebilir.
Bu araştırma, kirleticilerin midyeler üzerindeki etkisini değerlendirmek için hemosit motilitesini yeni son nokta olarak kullanmaya odaklanarak toksikolojideki önemli bir boşluğu ele almaktadır. Hemosit motilitesi immün yanıtlar için çok önemli olmasına rağmen, kirletici maruziyetine duyarlılığı çift kabuklularda yeterince çalışılmamıştır. Toksikoloji ve ekotoksikolojide çeşitli şekillerde ileri araştırmalar bulmamız.
Toksisite taraması için yeni bir son nokta sunarak, omurgalı testlerini en aza indirerek etik araştırmaları destekleyerek ve ekotoksikolojide uygulanabilirliği geliştirerek. Bu yaklaşım, çevresel biyoizlemede geniş bir uygulamaya sahip olabilir ve ekotoksikolojideki diğer bağışıklık hücreleri için uyarlanabilir. Başlamak için, bir şırıngayı 15 santigrat dereceye temperlenmiş 0,5 mililitre standart fizyolojik tuzlu su ile önceden doldurun.
İklimlendirilmiş yetişkin midye örneğini hemolenf toplanması için konumlandırın. Bir neşter kullanarak, ventral yüzey boyunca valfleri hafifçe ve dikkatlice ayırın. Neşteri yerinde tutun veya alanı açık tutmak için bir pipet ucu kullanın.
Ardından, hipodermik bir şırınganın iğnesini valfler arasındaki boşluğa yerleştirin. Önceden doldurulmuş şırıngayı kullanarak posterior adduktor kasından yavaşça 0,5 mililitre hemolenf toplayın. Şimdi, iğneyi şırıngadan çıkarın ve şırınganın içeriğini bir mikrotüpe aktarın.
Üç ila dört midyeden toplanan numuneleri, 15 santigrat derece sıcaklıkta bir tüpte bir araya getirin. Hemosit canlılığını değerlendirdikten sonra, bunları kültürlemek için, 96 oyuklu, düz tabanlı, polistiren, TC ile muamele edilmiş bir mikroplakanın kuyucuklarına 50 mikrolitre seyreltilmiş hemolenf ekleyin ve plakayı kapağıyla kapatın. Tek tabaka oluşturmak için hemositlerin 15 santigrat derecede 30 dakika boyunca kuyucukların dibine yapışmasına izin verin.
Daha sonra, bir mikropipet kullanarak, kuyucuklardan fazla hemolenfleri nazikçe aspire edin. Bir ila dört saat içinde kısa süreli tahliller yapmak için, hemen 100 mikrolitre fizyolojik tuzlu su içinde çözülmüş ilgilenilen maddeyi ekleyin. 24 ila 48 saatlik uzun süreli maruziyetler için, kültürlenmiş yapışkan hücreleri, 15 santigrat derecede takviye edilmiş kültür ortamında çözülen test maddesi ile inkübe edin.
Başlamak için, ilgilenilen madde ile tedavi edilen kültürlenmiş hemositleri elde edin. Hemositlerin daha iyi görselleştirilmesi için, inkübasyon ortamını her bir oyuktan çıkarın ve hızlandırılmış mikroskopiden önce hücreleri 100 mikrolitre nötr kırmızı hayati boya boyama solüsyonu ile boyayın. Hücreleri 15 santigrat derecede bir iklim odasında 15 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, fazla boyayı yıkayın ve standart fizyolojik tuzlu su içinde çözülmüş 100 mikrolitre ilgilenilen maddeyi ekleyin. İşlem görmüş hücreleri içeren çok kuyulu plakayı çok modlu bir okuyucuya yerleştirin. 20X büyütme ve parlak alan görselleştirme altında hızlandırılmış mikroskopi ile plaka üzerinde gerçek zamanlı görüntüleme gerçekleştirin.
Hücre izleme ve velosimetrik parametreleri hesaplamak için, Gen5 yazılımını kullanarak tek tek kareleri elde edin ve görüntüleri, adında boşluk olmayan bir klasöre kaydedin. ImageJ'de Dosya'ya, ardından İçe Aktar ve Görüntü Sırası'na gidin. Manuel izleme eklentisini kullanarak tek hücrelerde hücre takibi gerçekleştirin.
Veri kümelerini ImageJ manuel izleme eklentisinden Chemotaxis ve Migration Tool yazılımına aktarın. İzleme için istediğiniz dilim sayısını seçin. Yazılımı X/Y piksel boyutu ve zaman aralığı ayarlarıyla kalibre edin.
Parametreleri ayarladıktan sonra, Ayarları uygula'ya tıklayın. Yörüngeleri çizin ve görüntü olarak dışa aktarın. Sonuçları görüntülemek için Ölçülen değerler düğmesine tıklayın ve verileri kaydedin.
Ardından, İstatistikler düğmesine tıklayın ve parça serisi için hız ve doğrusallık verilerini kaydedin. Kontrol hücrelerinin hesaplanan velosimetrik parametrelerini, değişen konsantrasyonlarda test maddesine maruz kalan hemositlerinkilerle karşılaştırın. Hemosit motilitesi, sıfır, beş ve 10 dakikalık üç zaman noktasında numaralandırılmış hücrelerin tutarlı bir şekilde izlenmesiyle, 10 dakika boyunca bireysel hücre hareketlerini gösteren hızlandırılmış görüntüleme kullanılarak değerlendirildi.
Yayılan hücreler ve daha küçük yuvarlak yıldız şeklindeki hücreler olmak üzere iki hemosit morfotipi gözlendi. Her iki tip de lamellipodia ve psödopodia aktivitesi nedeniyle sürekli şekil değişiklikleri gösterdi. Hız ve doğrudanlık grafikleri, bazal fizyolojik koşullar altında, yayılmış hücrelerin daha küçük hücrelere kıyasla daha hızlı hareket ettiğini gösterdi.
Parasetamol maruziyeti, 24 saat sonra yayılmış hücrelerin hareketliliğini önemli ölçüde azaltırken, küçük hücreler böyle bir azalma göstermedi. Küçük hücrelerin doğrudanlığı, 24 saatlik parasetamol maruziyetinden sonra önemli ölçüde artarken, yayılmış hücreler sadece bir saat sonra doğrudanlığın azaldığını gösterdi.
