Bu çalışma Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi ve (FW) Hibe UL1TR000124 aracılığıyla Translational Sciences, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Advancing Ulusal Merkezi tarafından desteklenen; Felix &amp; Mildred Yip donatılmış Profesörlük ve (DTWW için) Barnes Aile Fonu, (MT) Ödül Numarası T90DE022734 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Diş &amp; Kranyofasiyal Research Ulusal Enstitüsü. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Manyetik Boncuk-tabanlı Exosome Ekstraksiyon <ol><li> Boncuklar yeniden askıya almak için bir mikrosantrifüj tüpü içinde, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), tampon 495 ul içinde Streptavidin-kaplı manyetik mikro 5 ul iyi karıştırılmış solüsyonu pipetle. Manyetik bir raf kullanarak üç kez yıkanır ve 500 ul PBS ile yeniden süspanse boncuklar. raf örnek mikrosantrifüj tüpleri tutabilecek bir konut ünitesi tarafında mıknatıs bir dizidir. <ol><li> Her yıkamadan için, ilk tüpler 1 dakika rafa oturup, ve daha sonra dikkatlice boncuk bozmadan süpernatant tampon kaldırmak için bir pipet kullanın izin. </li><li> Tarafında mıknatıslar olmadan düzenli bir rafa tüpleri yerleştirin. Tüplerin içine PBS 500 ul ekleyin ve birlikte çözüm ve boncuk karıştırmak için pipet kullanın. Sonra tekrar solüsyon gelen boncuk ayırmak için manyetik rafa geri tüpleri koymak. </li><li> PBS a mıknatıslanma ve tabanda yoluyla tampon bu kaldırma gerçekleştirinüç kez toplam. Bu manyetik parçacıkların bir ilk yıkama yapar. </li></ol></li><li> Manyetik rafın olmayan manyetize edilmiş bölümü üzerine yerleştirilen bir tüp ile, PBS tamponu 490 ul içine boncuk yeniden süspanse edin. Pipet boncuk karışımı içine 1.0 mg / ml stok konsantrasyonunda biyotinile fare anti-insan CD63 antikoru 5 ul. Çözelti içinde, boncuk ve antikor karışımı pipet kullanın. </li><li> Örnek karıştırıcı üzerine boncuk ve biyotinile antikor karışımı ile mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. 90 ° 5 saniye eğerek ve 1 saniye 5 ° titreşimli de karşılıklı dönüş için örnek rotator için rotator parametrelerini ayarlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika için bu parametrelerin numune boncuk karışımı tüpleri döndürün. </li><li> Konjugasyon sonra bağlanmamış antikor çıkarın. <ol><li> Oda sıcaklığında dönme, 30 dakika sonra, 5 dakika boyunca geri manyetik rafa tüpleri. </li><li> Bir mikropipet kullanılarak sıvı faz kaldırarak boncuk üç yıkar gerçekleştirin ve 500 μ ile yıkayın; PBS l. Üçlü yıkamadan sonra, raf manyetize kısmına 490 kazein-PBS ul ve yerine boncuk tekrar süspansiyon. </li></ol></li><li> Antikor kaplı boncuklar kullanılarak exosome çıkarma. <ol><li> Hedeflenen örnek kimliği ile her tüp etiketleyin. Mikrosantrifüj tüpe serum veya tükürük 10 ul örnek Pipet. Birkaç kez pipet kullanılarak örneğini ve manyetik boncuk karışımı pipet kullanın. </li><li> Döndürücü üzerine numune ve anti-insan CD63 antikoru boncuk tüpleri ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca döner. Aşama 1.2 &#39;de tarif edildiği gibi aynı döndürücü parametreleri kullanın. </li><li> Döner örnek 2 saat sonra, çözelti ayrı tanelerine mıknatıslanma mikropipet ile sıvı faz ayrılması ve Tris-HCI tampon maddesinin 500 ul boncuk resuspending üçlü yıkama yapar. Elde edilen boncuklar artık eksozom bağlı ve elektrik alan serbest bırakılması ve ölçüm için hazırız. </li></ol></li></ol> 2. Elektrik Alan Bağlı Çıkış birnd Exosomal İçerik Ölçümü <ol><li> GADPH Astar ile Elektrot İlk ön kaplamaya tabi tutulması <ol><li> Bir plastik de bireysel elektrotların çapraz bulaşmayı önlemek için bir elektrot dizisi uygulayın. Bu deney için, çıplak altından yapılmış bir çalışma, sayaç ve referans elektrot oluşan dizideki her birim elektrot ile 16 sensör elektrot dizisi kullanın. </li><li> Ultra saf damıtılmış su ile bir tüp içine hazır reaktifleri pipetleyerek, 100 nM DNA probu, 0.3 M KCI ve 10 mM pirol bir stok karışım hazırlayın. Vorteks ile iyice karıştırın. NOT: Bu çalışma için seçilen DNA probu eksozom içinde mevcut olduğu bilinmektedir GAPDH referans genine karşılık gelir. kullanılan prob dizisi &#39;-Biyotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 5&#39;. Tüm elektrotlar üzerinde bu karışımı kullanın. </li><li> Pipet her altın elektrod yüzeyi üzerine monomer DNA probu karışımı 60 ul. Çalışma, c yeterli kapsama olmasını sağlamak için elektrotları inceleyinSıvı karışım ile Sayaç ve referans elektrotlar. </li><li> Electropolymerize monomer prob karışımı elektrot yüzeyine döngüsel bir kare dalga (CSW) elektrik alanı profili uygulayarak elektrot yüzeyinde bir iletken polimer katmanı oluşturmak için. Bu elektrik alanı 9 saniye +350 mV uygulayarak ve hemen 1 saniye için 950 mV geçiş oluşur. Uygulanan bir elektrik alanı, 100 saniye, toplam 10 çevrim için elektroda bu siklik kare dalga profil uygulanır. </li><li> Elektrotun yüzeyinden sıvının çıkması için sensör yüzeyine damıtılmış su ve azot gazı ile kuru ile 3 kez yıkayın. Bu sıvı düzgün elektrot kaldırılır emin olun. </li></ol></li><li> Exosome Kargo Boşaltma <ol><li> Yük 5 boncuk eksozom kompleks karışımı 495 ul bir detektör probu 1 mcM ul ve karıştırmak için bir pipet kullanın. Not: detektör probu 3 &#39;ucunda bir floresein molekülüne konjuge edilmiş bir DNA primer sekansıdır. Dedektör probBu çalışma için kullanılan e dizisi eksozom içinde bulunan, GAPDH mRNA karşılık gelir. floresein konjuge detektör probu sekansıdır: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Floresein-3 &#39;. </li><li> Pipet altında bir mıknatıs dizi ile bir altın elektrot yüzeyine prob ve boncuk eksozom kompleks karışımı 60 ul. Bu mıknatıs dizisi sensörünün çalışma elektrotlara karşılık hizalanmış onaltı 2.54 mm çaplı mıknatıslar oluşur. Şekil 2A mıknatıslar ve boncuk eksozom çözümün yerleşimini gösterir. </li><li> Örnek elektrot yüzeyinde yüklendikten sonra, -300 mV 9 saniye ve 200 mV (200 sn toplam) 1 saniye ile CSW elektrik alanın 20 döngüleri uygulayın. serbest exosomal yük elektrodun sathı üzerinde primerler hibridize olur. Exosome yüzey belirteçleri soruşturma konusu ise,. Deney bu bölümünü atlamak 2B bu süreci göstermektedir Şekil. </li> &lt;li&gt; Yıkama-off üçlü damıtılmış su ile elektrot yüzeyini durulayarak elektrot yüzeyinde ilişkisiz analitler. Azot gazı ile elektrot kurutun. </li></ol></li><li> Raportör Antikor ve saati <ol><li> (: 1000 seyreltme, 1 içinde HRP) kazein / PBS içinde seyreltilmiş yaban turpu peroksidazına konjüge edilmiş 150 ünite / ml anti-floresin antikor 60 ul ekle. </li><li> Prob sandviç karmaşık bir anti-floresein HRP bir elektrik alan tahrik konjugasyon kullanın. 1 saniye ve elektrot yüzeyine 5 çevrim için 1 saniye için 500 mV -200 mV uygulanır. Şekil 2A, bir protein ve nükleik asit sisteminde hem de yakalama ve dedektör sistemi kompleksleri gösterir. </li><li> Distile su ve azot gazı ile kuru kullanılarak üçlü yıkama sensör yüzeyi. </li><li> Bağlanmamış fazla bir anti-floresin antikorun yıkama ayrılmasının ardından, 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidin (TMB), alt-tabakanın 60 ul ekle. Bir çok kanallı pipet kullanarak her bir sensör yüzeyine bu alt tabakayı yükleyin. </li><li> . 16 kanal eş zamanlı olarak ölçüm kapasitesine sahip bir elektrokimyasal potansiyostat kullanılarak 60 sn için -200 mV&#39;de elektrot akımının ölçülmesi ile akım amperometrik olarak okunmasını yapın 2C okuma sırasında akım profilinin bir örneği Şekil. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> EFIRM Yöntem Şekil 2. Bileşenleri. (A), anti-insan CD63 kaplı manyetik mikropartiküller kullanarak biyo-sıvı gelen eksozomlar ayıklanması ve daha sonra parçacık-eksozom kompleksi uygulanan halkalı kare dalgaları kullanarak eksozom kargo boşaltma yöntemi. Serbest eksozom RNA / DNA / protein hedefleri tespit etmek için kullanılan elektrot biyosensör (B) Şema. Daha büyük akım büyüklüğü t karşılık (C) EFIRM metodolojisi, gelen amperometik okuma Temsilcisi örneğiBir biyomolekülün yüksek seviyelerde o. Bu rakam Wei ve ark değil. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Rabinowits, G., Ger&#231;el-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+MicroRNA:+A+Diagnostic+Marker+for+Lung+Cancer.">Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li><li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+DNA+in+exosomes:+a+novel+biomarker+in+cancer+detection.">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li><li>Lau, C. S., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+Exosome-like+Microvesicles+and+Salivary+Gland+Cells+Interplay+Alters+Salivary+Gland+Cell-Derived+Exosome-like+Microvesicles+In.">Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In.</a> Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).</li><li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic,+drug-induced,+and+inflammatory+liver+diseases.">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li><li>Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+exosomes:+A+reservoir+for+biomarker+discovery+and+potential+mediators+of+intrarenal+signalling.">Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).</li><li>L&#228;sser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).</li><li>Palanisamy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).</li><li>Camussi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li><li>Lau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pancreatic+cancer-derived+exosomes+in+salivary+biomarker+development.">Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Exosomes+from+Cell+Culture+Supernatants+and+Biological+Fluids.">Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).</li><li>Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RNA+in+Saliva.">Characterization of RNA in Saliva.</a> Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).</li><li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio/Abiotic+Interface+Constructed+from+Nanoscale+DNA+Dendrimer+and+Conducting+Polymer+for+Ultrasensitive+Biomolecular+Diagnosis.">Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis.</a> Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).</li><li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Sensor+for+Multiplex+Biomarkers+Detection.">Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection.</a> Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).</li><li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+(EFIRM).">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li></ol>

David Wong RNAmeTRIX Inc., moleküler tanı şirketin kurucularından. PeriRx LLC RNAmeTRIX moleküler tanı ile ilgili fikri mülkiyet alt lisansı. David Wong PeriRx bir danışmandır.

Sonuçlar gösterdiği gibi, anti-insan CD63 kaplı manyetik nanopartikülleri, özellikle 70-100 nm arasında değişen bir boyuta sahiptir, küçük parçacıkları yakalamak mümkündür. Çekilecek parçacık eksozom daha önce gözlenen profili ile tutarlıdır. Bundan başka, parçacıklar yakalanmasından sonra düşük voltajlı CSW kullanım boncuğun yüzeyine kaldırmak ve kargo serbest bırakılması için geleneksel bir liziz tamponu göre yöntem ile benzer DNA parçalanma profilleri neden olduğu da göst...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosome araştırma RNA 1, DNA 2, ve protein 3 kargo taşıyan lipit microvesicles inceleyen bir araştırma ortaya çıkan bir alandır. Eksozom biyoloji Önceki araştırmalar, kan 4, idrar 5, anne sütü 6 ve tükürük 7 gibi Biofluids içinde eksozom belirlenmesine yol açmıştır. Çalışmalar uzaktan gövdenin 8 farklı sistemler arasında iletişimi meditating, eksozomlar farklı hücresel yolların bir rol oynadığını göstermiştir. Rolü eksozomlar hücrelerarası iletişimi oynamak için, onlar hastalık durumları ile ilişkili biyomolekülün hedefleri (protein, RNA ve DNA) paket olabileceği düşünülebilir. In vitro 3 ve hayvan modeli 9 çalışmalar bu hipotezi doğrular görünmektedir. Biyomarkır keşif için exosomal içerik araştıran, bu Biofluids seçici eksozom izolasyonu için bir metodoloji geliştirmek için gerekli olan, uyarılan expulsieksozom gelen kargo ve eksozom biyomoleküllerin miktarının on. Bu çalışmanın kapsamında, eksozomlar bir yapı yaklaşık 70-100 nm arasında bir çapa sahip olan ve yüzey işaretleyici CD63 sahip olarak tarif edilecektir. Araştırmacılar genellikle ilk Ultrasantrifügasyon 10 ile eksozomlar arındırmak ve daha sonra lizis tamponu kitleri kullanımı yoluyla exosomal içeriğini işlemek. Liziz tamponu yöntemlerin kullanımı dakika saat arasında değişen bir bekleme süresi gerektirir. Bu süreç, potansiyel eksozom kargo zarar ve bozulmasını örnek yol açabilir. Örnek olarak, çevreleyen hücre dışı ortama liziz tamponu üzerinden serbest tükürük eksozom RNA exosomal RNA sonrası liziz ölçümü stabilizasyon tepkin 11 eklenmeden özellikle zor bir görev tampon hale 1 dakika altında bir yarı ömre sahip bulunmaktadır. lizis ve istikrar için çeşitli reaktifler ekleyerek bileşik etkisi komplike ajanları tanıtmak ve analı müdahale edebilirexosomal içeriğinin sis. Alternatif bir yaklaşım, hızlı bir şekilde exosomal içeriği boşaltma ve güvenli bir şekilde tanımlanması için yük korunması için yararlı olabilir. Bu çalışmada, exosomal içeriğin salınımı için bir tek biçimli olmayan elektrik alanının kullanımını önermektedir. Elektrikli alanları polarize ve hücre zarlarını oluşturan lipid çift bozma yeteneği taşımak için bilinmektedir. Bizim deneysel çalışmalar eksozomlann microvesicle yapısının bozulması ve taşınan kargo serbest bırakılması için düzgün olmayan siklik kare dalgalar (CSW) kullanımını araştırıyor. Bu yöntem en biyomoleküllerin kesintiye olmayacak anlamına birkaç yüz milivolt aralığında gerilimleri kullanır. Bir siklik kare dalga kullanımı çevreleyen akışkan ortama tükürük eksozom mRNA içeriği serbest harekete geçirmek için mümkün olduğunu göstermektedir. Exosomal içeriğin Bu sürüm, sorunsuz bir şekilde biyomarker ekspresyon seviyelerini ölçmek için kullanılabilecek bir elektrot sistemi ile entegre 12,13.. Önerilen bu yöntem, eksozom içeriğinin hızlı, hassas ve parçalama tamponu ücretsiz analiz sağlar. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> EFIRM İş Akışı 1. Genel Bakış Şekil.. EFIRM yöntemi geniş arındırıcı ve analiz eksozom için gerekli olan üç ana evreye ayrılır. Bu SSG göre exosomal içeriği serbest bırakılması ve analiz yöntemi eksozom izolasyonu için CD63 spesifik manyetik mikro ile bağlantılı olarak kullanılır. Bu CD63-afinite taneleri tükürük örnekleri (ve diğer Biofluids) için eksozom seçici izolasyonu için izin verir. İnkübasyon ve manyetize boncuklar kullanarak eksozom çıkarılması ardından, boncuk Şekil 1. Içerik salınımını ve deney analizi bölümünü tabanlı CSW için elektrokimyasal sensör sistemi göç işin bir bakış verir edilirEFIRM yöntemi akar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:132px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td style="width:132px;">&#160;RS-1000-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips</td>
			<td style="width:157px;">Genefluidics, USA</td>
			<td>SC1000-16X-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Biotinylated anti-human CD63 Antibody</td>
			<td style="width:157px;">Ancell, USA</td>
			<td style="width:132px;">215-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Neodynium Magnetics ( 1/10&#34; dia. x 1/32&#34; thick)</td>
			<td style="width:157px;">K&#38;J Magnetics, USA</td>
			<td>DH101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Ultrapure Distilled Water</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td>10977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Mettler Toldeo 3M KcL Solution</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>1911512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Pyrrole</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:132px;">W338605-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td>
			<td style="width:157px;">Roche, Germany</td>
			<td>11426346910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:347px;">3, 3&#8242;, 5, 5&#8242; tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Neogen, Usa</td>
			<td style="width:132px;">330175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Phosphate Buffered Saline Solution</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies, USA</td>
			<td align="right" style="width:132px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Casein/PBS</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific, USA</td>
			<td>37532</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (efirm)

Eksozomlar arası iletişimde bir aracı rolü mikroveziküler yapılardır. Onlar hastalık ayrımcı biyomarkerlar taşımak olmadığını belirlemek için eksozom iç kargo incelemek için ilgi olduğunu. Exosomal analizinin yapılması için, ayıklanması ve iç içeriği zarar vermeden hedef Biofluids gelen eksozomlar analiz etmek için bir yöntem geliştirilmesi gerekmektedir. Elektrik alan ile indüklenen salma ve ölçüm (EFIRM) özel olarak, Biofluids gelen eksozomlar açılan kendi yük boşaltma ve iç RNA / protein içeriği test etmek için bir yöntemdir. Bir anti-insan CD63 özgü antikor manyetik mikropartikül kullanarak, eksozomlar ilk Biofluids çökeltilir. Aşağıdaki çıkarma, düşük voltajlı elektrik siklik kare dalgalar (CSW) veziküler membran bozabilir ve kargo boşaltma neden uygulanır. eksozom içeriği nereye için bir elektrot yüzeyi üzerinde hareketsiz DNA primerleri veya antikorlar hibridize edilirMoleküler içeriğin ntification. EFIRM yöntemi liziz tamponu olmayan analizi için eksozom ekstre ve boşaltılması için avantajlıdır. Bu yöntem, eksozom hem RNA ve protein biyomarker hedeflerin belirli bir algılama gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Boyut-tabanlı teknikler aksine EFIRM özellikle yüzey belirteçleri dayalı eksozomlar ayıklar. Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile tahlil eksozom yakalama ve analiz için bir yöntem işlevselliğini gösterir. EFIRM yöntem, insan akciğer kanseri H640 hücreleri enjekte 9 farelerin analizi tuzlu kontrolleri alan 11 fareden karşı eksozom profili test etmek için (eksozom işaretleyici insan CD63, GFP ifade eden transfekte edilmiş bir hücre hattı) exosomal uygulandı. Exosomal biyobelirteçlerinin Artmış düzeyleri (referans gen GAPDH ve protein yüzey işaretleyici insan CD63-GFP) H640 hem serum ve tükürük örneklerinde fareler enjekte bulunamadı. Ayrıca Saliva ve serum numuneleri doğrusallık (R, = 0.79) sahip olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar uzak hastalıkların tespiti için tükürük eksozom biyobelirteçlerinin canlılığı düşündürür.

TEM kullanarak Boncuk Exosome Yakalama Doğrulama Anti-insan CD63 manyetik boncukları kullanılarak tükürük eksozomlann izole transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri kullanarak ekstraksiyon protokolü takip edilerek doğrulanmıştır. TEM eksozom bilinen profili ile uyumlu hemen bitişik (Şekil 3A, bkz ve 3B), 70-100 nm granüller, manyetik boncuklar gösterir. Resim 70-100 nm taneler daha önceden bunların konjüge anti-...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM at JoVE.com

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

18.3K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves. 

Video: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Akustik Membran mikropartikül Teknoloji Geliştirme Özel Çin Hamsteri Yumurtalık-host Hücre Proteini Tahliller

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Biyomühendislik

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Doku Yüzey tensiometresi Agrega Uyum ölçümü

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is subject to chemical and mechanical signals, and the mechanisms by which it senses and responds to mechanical signals are poorly understood. Elucidating the role of forces in cell maturation will enable the design of scaffolds that can promote cell adhesion and cytoskeletal coupling to the substrate, and therefore improve the capacity of different neuronal types to regenerate after injury.
Here, we describe a method to apply simultaneous force spectroscopy measurements during laser induced cell lesion. We measure tension release in the partially lesioned axon by simultaneous interferometric tracking of an optically trapped probe adhered to the membrane of the axon. Our experimental protocol detects the tension release with piconewton sensitivity, and the dynamic of the tension release at millisecond time resolution. Therefore, it offers a high-resolution method to study how the mechanical coupling between cells and substrates can be modulated by pharmacological treatment and/or by distinct mechanical properties of the substrate.

We measured the tension release in an axon that was partially lesioned with a laser dissector by simultaneous force spectroscopy measurement performed on an optically-trapped probe adhered to the membrane of the axon. The developed experimental protocol evaluates the axon adhesion to the culture substrate.

Lazer Bağlı Akson Lezyon sırasında Gerilim Film ölçümü Piconewton ve Milisaniye Çözünürlük de Yüzey için aksonal yapışma değerlendir

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Permeabilize İskelet Kası Fibers tarafından oluşturulan Maksimum İzometrik Kuvvet Ölçümü

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell culture system that was used for a long-term cell differentiation study using microscopy. The microfluidic system consists of the following major components: an optically transparent electrotactic chip, a transparent indium-tin-oxide (ITO) heater, a culture media-filling pump, an electrical power supply, a high-frequency power amplifier, an EF multiplexer, a programmable X-Y-Z motorized stage, and an inverted phase-contrast microscope equipped with a digital camera. The microfluidic system is beneficial in simplifying the overall experimental setup and, in turn, the reagent and sample consumption. This work involves the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) induced by direct current (DC) pulse stimulation. In the stem cell maintenance medium, the mouse NPCs (mNPCs) differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes after the DC pulse stimulation. The results suggest that simple DC pulse treatment could control the fate of mNPCs and could be used to develop therapeutic strategies for nervous system disorders. The system can be used for cell culture in multiple channels, for long-term EF stimulation, for cell morphological observation, and for automatic time-lapse image acquisition. This microfluidic system not only shortens the required experimental time, but also increases the accuracy of control on the microenvironment.

In this study, we present a protocol for the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) solely induced by direct current (DC) pulse stimulation in a microfluidic system.

Mikroakışkan Cihazlarda Elektrik Alan Kaynaklı SinirSel Öncül Farklılaşma

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Hücresel Elektrik Mikroçevriminin Sonlu Eleman Modellemesi

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Biyolojik Dokuların Uyarılması için Elektrikli ve Manyetik Alan Cihazları

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.