Anjiyogenez tümör metastazı ve ilerlemesinde önemli rol oynar. Bu protokolde, meme kanserinin fare modelinde dinamik tümör progresyonunu ve anjiyogenezi izlemek için çift biyolüminesans görüntüleme yöntemini kullanacağız. Bu modelde, sırasıyla Firefly luciferase ve Renilla luciferase görüntüleme ile tek fare de tümör büyüme ve anjiyogeneziz eş zamanlı olarak izleyebilirsiniz.
Bu model antitümör ilaç tarama ve onkoloji araştırmalarında yaygın olarak uygulanabilir. Bu çift biyolüminesans modeli tümör progresyonu ve regresyon izlemek ve terapötik stratejilere yanıt olarak tümör ile ilgili moleküler süreçleri tespit etmek için kullanılabilir. Anjiyogenez tümörün ilerlemesinin önemli bir sürecidir.
Bu nedenle etkili tümör tedavilerini geliştirmek için tümör progresyonu ve anjiyogenezingörsel ve hassas bir şekilde izlenmesi gereklidir. Prosedürler Kaiyue Zhang, Chen Wang ve Shang Chen, bizim laboratuvar öğrencileri tarafından gösterilecek. Lentivirus paketleme ve üretim tohumu için bir kez 10 dmem iki mililitre 293T hücrelerinin altıncı için iyi bir geceleme için altı iyi bir plaka içine fetal sığır serum u tamamlanır 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi.
Ertesi sabah oda sıcaklığında beş dakikalık kuluçka için iki ayrı 1,5 mililitre tüpler minimal Esansiyet Orta 250 mikrolitre ile lipozom 7.5 mikrolitre karıştırın. DNA çözeltilerini hazırlamak için plazmid lentivirus RR vektörü ve yardımcı plazmidleri tabloda belirtildiği gibi tek tek 1,5 mililitrelik tüplerde 250 mikrolitre Minimal Essential Medium'a ekleyin. Kuluçka sonunda yavaşça bir damla akıllıca lipozom süspansiyonlar için DNA RR çözümleri ekleyin ve DNA oda sıcaklığında 20 dakika boyunca lipid membranlar bağ sağlar.
Karışım kuluçka yakarken, 293T hücre kültürünün süpernatantını bir mililitre taze kültür ortamıyla değiştirin ve her kuyuya uygun lipozom DNA karışımının 0,5 mililitresini nazikçe ekleyin. Antibiyotikler ile desteklenen taze kültür ortamı bir mililitre ile her kuyuda supernatant değiştirmeden önce 12 ila 16 saat hücre kültürü kuluçka için hücreleri iade edin. Ek bir kuluçka 36 saat sonra, santrifüj ile 293T hücreleri tortu lentivirus suşu başına bir konik tüp içine supernatants havuz.
Sonra eksi 80 santigrat derece depolama için bireysel 1.5 mililitrelik steril polipropilen depolama tüpleri içine lentivirus RR içeren supernatants aktarın. 4T1 meme tümörü hücrelerinde gen ekspresyonu için lentiviral transdüksiyon için, fetal sığır serumu ve bir mililitre lentiviral stok ile desteklenen taze RPMI tabanlı hücre kültürü orta bir mililitre ile altı iyi 4T1 hücre kültürü plaka her kuyuda supernatant değiştirin. Sonra her kuyuya mililitre başına sekiz mikrogram Polibrene ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez hafifçe pipet.
Transdüksiyon verimliliğini artırmak için plakayı santrifüj edin ve hücreleri 4 ila 12 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kuluçka sonunda, taze kültür orta serum ve antibiyotikler ile takviye taze kültür ortamı ile her kuyuda supernatant değiştirin herhangi bir lentiviral parçacıklar ve Polibren kaldırmak için. Lentivirus'un transize edilen hücreleri seçmek için, transduced 4T1 hücre kültürlerini seçim ortamıyla bire bir-dört oranında geçirin ve ortayı her iki ila üç günde bir değiştirin.
Seçim orta kültür yedi gün sonra, bir floresan ters faz kontrast mikroskop altında transduced hücre kültürleri görüntülemek ve kırmızı floresan protein-pozitif veya RFP-4T1 hücrelerinin sayısını saymak ve görüş üç alanda 4T1 hücrelerinin tüm RFP-pozitif oranını tahmin etmek. Tümör taşıyan bir fare modeli kurmak için, 60 milimetrelik kültür plakası başına iki mililitre tripsin-EDTA ile hücreleri ayırmadan önce PBS ile %80 eşzamanlı transdükse hücre kültürlerini yıkayın. Hücreler plaka diplerinden kaldırDığında plaka başına 5 ila 10 mililitre serum takviyesi ile reaksiyonu durdurur.
Ve saymak için kültürleri 15 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın. Hücreleri serum konsantrasyonu olmadan 100 mikrolitre kültür ortamı başına 10 ila altıncı hücrelere kadar bir kez seyreltin. Ve subkutan bir şekilde 4T1-RR hücre hattının 100 mikrolitresini anestezik tümör taşıyan model farenin sol omzuna ve 4T1-RRT hücre hattının 100 mikrolitresini aynı farenin sağ omzuna enjekte edin.
Enjeksiyonlardan sonra, her fareyi tamamen iyileşene kadar termal destekle uygun bir kurtarma alanına yerleştirin. Farelerin tümör taşıdığını doğrulamak için yedi gün boyunca her gün tümör kitleleri palpate. Yedinci gün implantasyon sonrası, intraperitoneally her tümör taşıyan fare içine gansiclovir kilogram başına 50 mikrogram enjekte deney sonuna kadar günde iki kez.
Tümör büyümesi için, Yaşayan Görüntüleme Sistemi açın. Living Imaging yazılımını başlangıç ve sistemi başlatma. Sistem başbaşlarken, retrobulbar içine coelenterazine uygun hacmi ile görüntülenecek her fare enjekte etmek için bir insülin şırınga kullanın.
Enjekte edilen fareleri kamera odasına yerleştirin ve biyolüminesans sinyalleri kaybolana kadar 4T1 hücrelerinden Renilla luciferase sinyallerini elde etmek için fare nin birkaç fotoğrafını hemen alın. Renilla luciferase görüntüleme 10 dakika sonra, intraperitoneally her hayvaniçine D-luciferin uygun hacmi enjekte etmek için bir insülin şırınga kullanın. D-luciferin enjeksiyonundan 10 dakika sonra, fareleri kamera odasına yerleştirin ve anjiyogenezden Firefly luciferase sinyallerini elde etmek için fare dorsalının çeşitli görüntülerini elde edin.
Lentivirüs transdüksiyonundan sonra hücrelerin %99'dan fazlası RFP pozitiftir ve iki transdüktör hücre çizgisi arasında gözlenen hücre kültürü morfolojisinde farklılık yoktur. Daha sonra, transekten hücrelerin biyolüminesans görüntüleme her iki hücre hatları benzer bir güç güçlü biyolüminesans sinyalleri yontma ortaya koymaktadır. Transdükse hücre hatlarının transgenik tümör taşıyan fare modeline deri altı enjeksiyonundan sonra, anjiyogenez kaynaklı tümör büyümesi aynı hayvanda D-luciferin varlığında Firefly luciferase sinyalleri ile değerlendirilebilir.
Yedi gün sonra implantasyon, Ganciclovir yönetimi 4T1-RRT hücrelerinde ölüme neden olan bu hücreler tarafından kurulan tümörlerde Renilla luciferase sinyaldramatik bir azalma ile sonuçlanan. Firefly luciferase sinyalleri de Renilla luciferase ifade bir artış ile birlikte artış ve luciferase düşüş aşağıdaki azalma. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar tümör anjiyogenezve tümör büyümesi arasında doğrudan bir korelasyon olduğunu düşündürmektedir.
Gerçekten de, Gansiclovir kaynaklı tümör hücre ölümü tümör anjiyogenezinin inhibisyonuna yol açabilir. Ayrıca, anti-vasküler endotelsel büyüme faktörü reseptörü II için immünboyama, anjiyogenez bir belirteç olarak, 4T1-RR tümör dokusu bölümlerinde daha önemli bir mikrovasküler yapı ortaya 4T1-RRT tümörlerden bölümlerde daha, Ganciclovir uygulamadan sonra gözlenen Firefly luciferase sinyaldüşüş ile tutarlı. Protokolün en kritik adımı, hücrelerin ve anjiyogenezin eşzamanlı takibi için FLuc ve RLuc gibi iki tür luciferase kullanmaktır.
Bu teknoloji farklı yerlerde kanser hücrelerinin tedavisinde kullanılabilir, ve virüs kanseri modellerinde yaygın olarak kullanılabilir. Bu fare modeli, hsv-ttk/GCV takip sisteminin tümör büyümesine ve anti-tümör etkilerinin canlı bir hayvanda dinamik olarak görselleştirilmesine olanak sağlar. Bir biyogüvenlik seviyesi II tesis lentivirus transfeksiyon önlemek için gereklidir, medya insanlar için zararlı olabilir lentivirus parçacıkları içerir gibi.
