Bu eser Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. Mikroüretim McGill Üniversitesi&#39;nde McGill nanoTools MICROFAB imkan ve Carleton Üniversitesi Elektronik Bölümü desteğiyle gerçekleştirildi.

Kan Ottawa Üniversitesi (H11-13-06) etik kurul onayı ile sağlıklı bireylerden tahsil edilir. 1. Microchannel Fabrikasyon Mikrokanallar standart fotolitografi yöntemleri 18 dayalı üretilmektedir. <ol><li> Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak mikrokanal geometrisi Tasarım ve şeffaflık foto maske yapılandırmayı yazdırın. Onlar fabrikasyon sürecinde ışık yolu dikte beri bu maskeler çok önemlidir. Bu durumda, mikrokanal boyutları derinlemesine kalınlığı 120 um, 60 um ve uzunluğu 7 mm. </li><li> Bir temiz oda, sıkma kaplama epoksi negatif göre arzu edilen mikro derinliği (60 um) elde etmek için 30 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de bir silikon foto-karşı dirençlidir. </li><li> Gofret ve 650 mJ / 70 sn cm 2 bir UV lamba altında fotoğraf maskesi Açığa. Sadece saydam alanlar açığa olunUV-ışık fotoğraf maskesi. saydam alanların maruz bir sertleşmesiyle elde edilen zincirleri polimerizasyonu için bir foto-karşı dirençlidir. Fazlalığını ortadan kaldırmak için bir geliştirici içine silikon parçası daldırın fotoğrafın-direnmek. </li><li> Poli-dimetil-siloksan (PDMS) ihtiva eden bir çözelti oluşturmak için 1: kalıp imal edildikten sonra, 10 arasında bir oranda bir silikon bazlı elastomer ve bir sertleştirme ajanı karıştırılır. Gaz çıkışına bir vakum odasına PDMS çözeltisi koyun. Kalıp içine dökün ve 90 dakika mikrokanallar oluşturmak için, 60 ° C&#39;de ısıtın. Daha sonra 90 saniye boyunca oksijen plazma bağlaması kullanılarak cam bir slayta, bireysel kanallar bağ. NOT: PDMS gazını proses karıştırma işlemi yol açtığı hava kabarcıklarını yok etmek için yapılmıştır. </li><li> Mikrokanal boyutları başarılı test için izin emin olun. Bu protokol, mikrokanallar 120 x 60 mm, dikdörtgen bir enine kesite sahiptir. Buna karşılık, bir ortalama eritrosit 8 um bir çapa ve 2 um arasında bir kalınlığa sahiptir.refore, mikrokanal genişliği uygun toplanmasını gözlemlemek ve doğru bir hız profillerinin belirlenmesi için yeterlidir. </li></ol> 2. Kan hazırlanması <ol><li> Bir etik kurul onayından sonra, sağlıklı gönüllü vericilerden kan toplayın. Toplama tüpleri içinde mevcut etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile kan (kanın 4 ml 7.2 mg EDTA) tedavi edin. NOT: EDTA kan pıhtılaşma önlemek için kullanılır. </li><li> Kan bileşenleri ayırmak üzere 1,400 xg (3,000 rpm) kan örnekleri 10 dakika boyunca üç kez santrifüjleyin. Santrifüj sonucu olarak, üç farklı tabaka dikkate alınmalıdır. Not: üç kat (borunun alt kısmında bulunur) RBC tabaka (RBC tabakanın üstünde yer alan, beyaz kan hücreleri ve trombositler oluşan) ince beyaz tabaka ve plazma tabakası (diğer üst kısmında bulunan bileşenler). <ol><li> İlk Santrifüj işleminden sonra, kan bir pipet kullanarak kan plazması toplanır. Herhangi c kaçınınBuffy ceket ile ontact. </li><li> Toplayın ve% 10 sulandırılmış çamaşır suyu ile bir kapta buffy coat atmayın. </li><li> Kalan RBC tabakası ile tüplerin her PBS pH 7.4 içinde 3 ml ilave edilir ve santrifüjün uygun bir dengenin sağlanması. Yavaşça 10 dakika boyunca 1.400 xg (3000 rpm) yine tüpleri ve santrifüj karıştırın. NOT: Onlar hücre yapışmasını değiştirebilir beri PBS solüsyonu herhangi Magnezyum veya Kalsiyum içermediğinden emin olun. </li><li> İkinci santrifüj sonrası tüplerde PBS atınız ve varsa kalan buffy coat çıkarın. Tekrarlayın üçüncü santrifüj temiz eritrositlerde elde etmek için 2.2.3 ve 2.2.4 numaralı adımları. </li></ol></li><li> Tekabül eden (% 5 RBC-süspansiyonlar elde etmek için% 10 ve% 15 1 ml bir tüp içinde plazma (0.95, 0.9 ve 0.85 mi) temiz eritrositlerde gerekli miktar (0.05, 0.1 ve 0.15 ml) karıştırın ) hematokrit. Bir mikrosantrifüj ile hematokrite edin. </li></ol> 3. Sıvılar Hazırlık <ol><li> Floresan izleyici partikülleri solüsyonu 60 ul ekleyin (% 1 katı, d parçacık = 0. 86 mikron, λ = 542 nm abs ve 1 ml RBC-Süspansiyon tüplere λ emisyon = 612 nm). NOT: (dahili polistiren tanecikleri boyalı) floresan izleyici parçacıkları mikrokanalın içinde akış hızını ölçmek için kullanılır. Lazer ışınının (λ = 542 nm), karşılık gelen dalga boyuna maruz kaldığında bu parçacıklar floresan. </li><li> PBS pH 7.4 çözeltisi hazırlayın ve PBS çözeltisi 1 ml aynı floresanlı işaretleyici partikülleri solüsyonu 60 ul ekle. </li></ol> 4. Agrega Boyut Ölçümleri <ol><li> Mikrokanalda sıvıları (RBC-süspansiyonlar ve PBS) eklemek için, 25 ul ve 100 ul iki cam şırınga kullanın. Bu iradeSistemin uygunluğu azaltmaya yardımcı olur. Tüp ve giriş delikleri montaj konnektörleri yoluyla şırınga mikrokanalı bağlayın. Sıvı haznesi ve şırınga arasında varolan basınç farkı kullanılarak cam şırıngalar doldurun. Hava kabarcığı sisteminde mevcut olduğundan emin olun. Alternatif bir yöntem olarak, mikrokanal hem de sıvı sürmek için bir basınç kontrol sistemi kullanır. </li><li> Yüksek hızlı kamera ve μPIV sistemine bağlı bir ters mikroskop sahnede mikrokanalı yerleştirin. Programı (PBS Q = 8 ul / saatlik bir akış hızı sokarken kan örneğin, Q = 2 ul / saat) arzu edilen akış oranları şırınga pompası. NOT: Sadece bir şırınga pompası kullanılır. Iki farklı iç çaplara sahip iki farklı cam şırınga kullanılarak, Y-mikrokanalın her dalı giren akış oranına değiştirmek mümkündür. </li><li> Gösterildiği gibi farklı bir giriş şubesi ve farklı akış oranlarında çift Y-mikrokanalda hem sıvıları her takın <strong&gt; Şekil 1. pompa debisini, farklı kesme oranları sınamak değiştirmek için. Bu (Şekil 2 ve 3) iki koldan 19 arasında (bu durumda 4) Aynı Uygun oranını korur. Ölçümleri almadan önce kararlı duruma ulaşması akış bekleyin: görsel pürüzsüz akışı için yüksek hızlı kamera görüntüleri inceleyin. NOT: oranı kan tabakası içinde doğrusal hız profili elde önemlidir. </li><li> Yüksek hızlı kamera kullanarak eritrositlerde gözünüzde canlandırın. Sıvı akışının görüntülerini kontrol, kayıt ve kaydetmek için bir bilgisayara bağlayın. İki sıvı akar kararlı duruma ulaştıktan sonra, kaydetmeye başlayın. <ol><li> Daha iyi sonuçlar için işlem birkaç görüntü elde edin. Agrega net görüntü için optimal bir kameranın açıklık süresi belirler. NOT: Bu durumda kamera pozlama süresi 0,5 milisaniye idi. Her çerçeve arasındaki zaman aralığının seçimi kamera çerçeve hızı ve t debisine dayanmaktadırO mikrokanal. Bu prosedürde işlenen her çerçeve arasındaki süre 60 msn idi. Bu nedenle, saniyede 18 kare kayıt yapabilen bir kamera yeterlidir. NOT: Hatalı ölçümlere yol açabilecek tüp ve şırınga, kan oturmasını kaçının. </li></ol></li><li> Görüntü işleme teknikleri (bu durumda MATLAB programı) kullanılarak aşağıdaki gibi (Şekil 4&#39;te gösterilen) piksel yoğunlukları göre görüntülerin her agregatlar saptandı, görüntü kalitesini iyileştirmek için: <ol><li> Görüntüleri her kare için daha iyi bir görüntü kalitesi elde etmek histogram ekolayzır yöntemini kullanarak kontrast geliştirin. </li><li> Ikili görüntülere gri tonlama görüntüleri dönüştürün. Bu amaç için, her bir piksel dönüşümünü belirler 0-1 arasında değişen bir eşik değerini, ayarlayın. Eşik daha büyük değerlere sahip pikseller beyaz piksel olarak tespit edilecek süre eşik değerin altında görüntüdeki herhangi bir piksel, siyah bir piksel olarak algılanacaktır. </li><li> DoldurmakDaha iyi sonuçlar için, bir bütün içinde boşluklara tekabül eden delikler (bulunan ve gerekirse). </li><li> Komşu hücreler agregatlar halinde ilişkili olan, böylece ikili görüntüdeki komşu beyaz pikseller belirleyerek hücreleri algılar. </li><li> Algılandı farklı agrega Etiket ve daha iyi görüntülenmesi için bir kırmızı-yeşil-mavi (RGB) görüntü içine ikili görüntü dönüştürmek. Görüntü işleme tekniğinin etkinliğini doğrulamak ve Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi tüm hücreleri dikkate alınmasını sağlamak için gelen işlenmiş görüntülerin her orijinal kare birleştirin. Gerçekleştirin adımlar 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 Yakalanan tüm çerçeveler için, 4.5.4 ve 4.5.5. </li><li> Tespit edilen piksel sayısına göre çerçeve içinde algılanan her bir agreganın alanını hesaplar. Kullanılan mercek büyütme dayanarak, bir kalibrasyon retiküle kullanarak, dönüşüm faktörünü hesaplamak ve um 2 sonuçları dönüştürmek. Her bir tespit agrega boyutları ortalamaÇerçeve ve sonra RBC-süspansiyonlar her kayıt için ortalama agrega boyutu elde etmek için tüm karelerin sonuçları ortalama. </li><li> Algılanan her agreganın içinde eritrosit temsilcisi tahmini sayısını belirlemek için tek RBC alanını hesaplayın. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, bu sonuçlar kullanılarak, (her bir agrega hücre tahmini sayısı ile temsil edilen) toplu boyutlarda bir fonksiyonu olarak her agreganın olan eritrosit yüzdesi dağılımını hesaplar. NOT: RBC agrega ölçmek için, ImageJ yazılımı her karede aynı görevleri gerçekleştirmek için (yerine MATLAB) kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 5. Sıvı Hız ve Kayma Hızı Ölçümleri Akışkan hızı ve μPIV sistemini kullanarak dolayısıyla kayma oranını belirlemek. <ol><li> Veri, yüksek hızlı kamera kullanılarak elde edilir sonra, μPIV sistemi için kullanılan çift darbeli kameraya geçin. Görüntü ac için bir görüntüleme yazılımı kullanınhız alanı belirlenmesi için akış ve görüntü işleme edinirken. </li><li> Lazer açmadan önce, lazer sınıfına bağlı olarak, tüm önlemler gerekli atın. Sonra sistemde, kamera ve lazer açın. </li><li> Kullanılan mercek büyütme dayalı kamerayı ayarlayın. Bu amaçla, bir mikroskop altında 10 um hassas bir bir Mikro kullanımı ve görüntüde 1 piksel boyutunu ayarlamak. </li><li> Lazer başlatın ve her iki sıvılarında parçacıkları görselleştirmek. Akımında hızlı parçacıkların odaklanarak mikrokanalın orta düzlemi bul (yani, en hızlı parçacıklar parlak olmalıdır). </li><li> Parçacığın düzgün deplasman sağlamak için dt (iki ardışık kareler arasındaki zaman aralığı) ayarlayın. En hızlı parçacıklar her iki görüntü arasında yaklaşık 5 ila 10 piksel taşımak gerekir. </li><li> Akış kaydetmeye başlayın. Görüntülerin 100 çift, ayrı 5 milisaniye kazanmak için yazılımı ayarlayın. Tüm dif için adımları 5.4, 5.5 ve 5.6 gerçekleştirinferent RBC-süspansiyonlar ve farklı kayma oranları için. NOT: metodoloji Daha fazla bilgi Pitts ve Fenech 20 çalışmasında verilmiştir. </li><li> Görüntüleme yazılımı ile çapraz korelasyon yöntemi kullanılarak elde edilen kayıtları işleyin. NOT: Bu önceden belirlenen büyüklükteki küçük pencereler halinde görüntülerin çifti kesikli oluşur denilen korelasyon pencere ve her pencerede partiküllerin deplasman aşağıdaki gibidir (sıvı akışı ve kullanıcı tarafından seçilen zaman aralığına göre). <ol><li> Edinilen görüntüler daha iyi veri işleme (arka plan çıkarma, &quot;baz kırpma&quot; 21 veya görüntü 22,23 örtüşen dahil) ön işleme ihtiyaç Öncelikle belirlemek. </li><li> Daha sonra korelasyon pencere boyutu ve şekli, hem de bir üst üste binen görüntülerin yüzdesi seçin. Detaylı bir çalışma Pitts ve arkadaşları tarafından yapıldı. 24 kan için optimum parametreleri ve görüntü ön işleme teknikleri belirlemek içinfarklı kanal yapılandırmalarında akış. 100 görüntü çiftleri ve hızının Root Mean Square (RMS) hata hesaplanan ortalama hız alanı olarak sonuçları ifade eder. </li></ol></li><li> Şekil 7 &#39;de gösterildiği gibi. Işlenmiş verileri kanal çıkışındaki bir hız profilini ekstrakte daha iyi bir profil için, boşluk hız alanı ortalama. NOT: hız profili oluşturan çubuklar kanal genişliği göre seçilen korelasyon pencere boyutuna karşılık gelmektedir. Hız RMS hata, deney hızı tahmini hata temsil Şekil 7&#39;de gösterilmektedir. </li><li> Tüm ölçümleri ve işleme yapılmaktadır kez lazer kapatın ,. Yazılım, kameralar, hareketli sahne, bilgisayar ve lazer: Tüm sistemin bileşenlerini kapatın. </li><li> Kayma oranını hesaplamak için, ilk olarak algılamak ve yüksek hızlı kamera kayıt dayalı mikrokanaldaki kan kalınlığını tahmin ediyoruz. Bu amaçla, tüm ortalamaBelirli kayıt çerçeveler videonun bir arka plan görüntüsü elde etmek. (% 5,% 10 ve% 15 hematokrit asılı olduğunda 10 ul / sa oranında akan bir RBC-süspansiyonlar için, Şekil 8&#39;de gösterildiği gibi), kan tabakası sınırlandırmak. İlgili kan tabaka kalınlığı için hız değerini elde ve kan tabaka kalınlığı ile hız değeri bölerek kesme oranını hesaplamak. </li></ol>

<ol>
	<li>Perkkio, J., Keskinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematocrit+reduction+in+bifurcations+due+to+plasma+skimming.">Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming.</a> Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).</li><li>Chien, S., Jan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+basis+of+the+mechanism+of+rouleaux+formation.">Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation.</a> Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).</li><li>Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion-mediated+red+blood+cell+aggregation+in+polymer+solutions.">Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions.</a> Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).</li><li>Schmid-Sch&#246;nbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shear+rate+dependence+of+red+cell+aggregation+in+vitro.">On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).</li><li>Pries, A. R., Secomb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+the+microcirculation.">Rheology of the microcirculation.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).</li><li>Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Red Blood Cell Aggregation. , (2011).</li><li>Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemorheological+disorders+in+diabetes+mellitus.">Hemorheological disorders in diabetes mellitus.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).</li><li>Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).</li><li>Lindqvist, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viscosity+of+the+blood+in+narrow+capillary+tubes.">The viscosity of the blood in narrow capillary tubes.</a> Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).</li><li>Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#229;hraeus:+Evolution+of+his+concepts+in+cardiovascular+physiology.">F&#229;hraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology.</a> Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).</li><li>F&#229;hraeus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suspension+stability+of+the+blood.">The suspension stability of the blood.</a> Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).</li><li>Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+specific+red+blood+cell+aggregation+indices+via+an+automated+system.">Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system.</a> Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).</li><li>Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser-assisted+optical+rotational+cell+analyzer+(lorca)+as+red+blood+cell+aggregometer.">The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).</li><li>Rampling, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+cell+aggregation+and+yield+stress.">Red cell aggregation and yield stress.</a> Clinical Blood Rheology. , (1988).</li><li>Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+human+erythrocyte+velocity+field+and+aggregation+measurements+at+physiological+haematocrit+levels.">Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels.</a> J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).</li><li>Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+variation+of+blood+viscosity:+modelling+using+shear+fields+measured+by+a+&#181;PIV+based+technique.">Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a &#181;PIV based technique.</a> Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).</li><li>Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+variation+of+blood+viscosity+and+velocity+distributions+of+aggregating+and+non-aggregating+blood+in+a+bifurcating+microchannel.">Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel.</a> Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).</li><li>Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+red+blood+cell+aggregability+in+a+flow+chamber+by+computerized+image+analysis.">Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis.</a> Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).</li><li>Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+microfluidic+system+for+red+blood+cell+aggregation+investigation.">Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation.</a> J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).</li><li>Pitts, K. L., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+for+velocity+profile+measurements+of+micro+blood+flows.">Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows.</a> J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).</li><li>Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+particle-image+velocimetry+of+bead+suspensions+and+blood+flows.">Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows.</a> Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).</li><li>Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+algorithms+for+microscale+particle+image+velocimetry.">Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry.</a> AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).</li><li>Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+measurement+accuracy+in+micro+PIV+by+image+overlapping.">Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping.</a> Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).</li><li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow:+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods.">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).</li><li>Bhamare, M. G., Patil, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+blood+cell+analysis+by+using+digital+image+processing:+a+preliminary+study.">Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study.</a> Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).</li><li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+classification+using+image+processing.">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Mevcut metodoloji kullanarak, niteliksel analiz etmek mümkündür ve kantitatif RBC farklı akış koşulları ve hematokrit altında toplanır. Başarılı test ve agrega tespiti için, mikro girişinde iki akışkanlar arasında uygun hız oranını belirlemek için çok önemlidir. Bu oran, hız profili 19 yarı lineer bir optimal kan tabaka kalınlığının elde edilmesi için çok önemlidir. Başarılı test için bir başka önemli faktör iyi bir görüntü kalitesi. Yöntem görüntü işleme dayanmaktadır beri Aslında, bu görüntü arka (kanal içinde sıvı) ve tespit edilecek parçacıklar arasında bir kontrast olması çok önemlidir. Şekiller 2 ve 3&#39;te gösterildiği gibi, burada, tanecikler, toplam saptanmasında yardımcı olur arka plan, daha koyu görünmektedir. görüntü işleme tekniği için dikkat edilmesi gereken en önemli parametre threshold değer. Bu nedenle, tersine göre, Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi, tüm gruplar, dikkate alınacak uygun eşik değerini seçmek için çok önemlidir elde edilmiştir. Bu çalışma için kullanılan mevcut olan görüntü ayrıştırması, yaygın olarak, hücre tespiti ve sayımı için kullanılan İstediğiniz ve küresel eşik değeri uygun değil gibi görüntü kalitesi değilse 25- 27., böyle bir Otsu yöntemi 28 veya uyarlanabilir bir eşik yöntemine (görüntü kesikli ve optimal eşik değerini belirlemek için farklı bir algoritma kullanabilirsiniz ) her discretized pencere için yerel bir eşik elde edilir. Dikkate alınması gereken bir diğer faktör um piksel uygun bir dönüşüm için ölçek faktörüdür. Uygun dönüşüm faktörü kullanılarak, tek çap ve agrega boyutu dağılımını belirlemek için görev yapacak biri RBC kalınlığını belirleyebilirsiniz (tahmini numbe dayalıHer toplu eritrosit r). Agrega yönüne bağlı olarak, düzgün biri RBC (frontal ya da yan görünüm) bölgeyi hesaplar. Bölüm 4 (adım 4.4.1) &#39;de belirtildiği gibi, agrega dinamik özellikleri her ardışık çerçeve arasında yakalanır sağlamak için uygun kamera pozlama süresini ve kare hızını belirlemek için önemlidir. Bu değer ölçümleri satın alırken kullanılan akış hızına dayanmaktadır. Çeşitli diğer faktörler μPIV sistemi kullanılarak sonuçlar elde dikkate alınması gerekmektedir ve Pitts ve Fenech 20 çalışmada açık bir şekilde ele alınmaktadır. metodoloji farklı hematokrit akan birkaç RBC-süspansiyonlar başarıyla test edildi. Ancak, görüntü işleme tekniği ve görüntü arka planı ve agrega arasındaki kontrast eksikliği sınırlaması nedeniyle, RBC (% 20 den% 45) daha yüksek hematokrit agregatlar tespit etmek zordur. Nitekim olarak bahsedilmektedirDaha önce, görüntü kalitesi bu metodolojinin için çok önemlidir. Bu protokol kullanılarak, RBC agrega boyutları kontrollü mikroakışkan cihaz ölçülebilir ve bu nedenle fizyolojik kesme oranlarında bir dizi için eritrosit yığın ebatları mikrosirkülasyonda dinamik rbc toplanması ile ilgili bilgi elde etmek ve elde etmek mümkündür. Kan reolojisinin sayısal ve deneysel çalışmaları tamamlayıcı ve klinik ve patolojik çalışmalar agrega boyutları ve davranışlarını ilişkilendirmek mümkündür.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Kırmızı kan hücreleri (eritrositler) kanın reolojik davranışlarını belirleyen çok önemli bir rol oynamaktadır. Neredeyse tek başına, in vitro ve in vivo olarak kan belli özelliklere sorumludur. Fizyolojik koşullar altında, eritrositler kan hacminin% 40 45% işgal. Mikrosirkülasyondaki, eritrositler nedeniyle sadece küçük damar çapları ve etkisi 1 kaymağını plazmaya kan hacminin% 20 kadar işgal. Mikrosirkülasyon plazma azalma Bu olgu Fåhræus etkisi olarak bilinir. Düşük kesme hızlarında, RBC bu nedenle kan Newtonian olmayan davranışlar katkıda birlikte köprü ve &quot;Rouleaux&quot; ya da agregalar olarak adlandırılan tek boyutlu veya üç boyutlu yapıları oluşturmak mümkündür. Bununla birlikte, rbc toplanması mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. İki teori eritrosit agregasyonunu model vardır: Hücreler teorisinin köprüleme nedeniyle makromoleküllerin 2 çapraz bağlanması ve kuvvet attrac içintion teorisi nedeniyle osmotik gradyan 3 moleküllerin tükenmesi neden oldu. Tipik haliyle, insan kanı, agrega 1 ila 10 saniye -1 kadar çok düşük kesme oranlarında 4 de oluşturur. Bu aralığın üstünde, RBCs bölmekte ve damar içinde ayrı akış eğilimindedir. Agrega oluşum koşullarını anlamak kanın reolojik davranışını tanımlayan açısından Hemorheology alanına büyük önem taşımaktadır. Bu agregalar genellikle makrodolaşım düzeyde (&gt; 300 um çapında) 5 görülür. Bu ölçekte, kan, bir Newton tipi sıvı ve homojen bir karışım olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu agregaların nadir kılcal seviyesi (çapı 4-10 um) görülür ve genellikle diyabet 6 ve obezite gibi patolojik durumların bir göstergesidir. Rbc toplanması enflamatuar veya enfeksiyon durumları içerir değiştirebilir diğer patolojik durumlar,hipertansiyon veya ateroskleroz, genetik bozukluklar ve kronik hastalıklar 7 kardiyovasküler hastalıklar. Bu nedenle, RBC toplama mekanizmasının anlaşılması ve (bu agrega ve akış koşullarının büyüklüğü arasında bir ilişki tanımlayarak) bu varlıkları analiz kanın microrheological davranışının anlaşılmasına yol açabilir ve dolayısıyla klinik uygulamalara bunu ilgilidir. RBC agregaları gibi hematokrit (kanda eritrositler hacmi), kayma hızı, damar çapı, RBC membran sertlik ve süspansiyon ortamı bileşim 8-10 gibi çeşitli faktörler tarafından değiştirilebilir. Bu nedenle, kontrollü şartlar etkin RBC agrega analiz etmek için gereklidir. Çeşitli yöntemler kan davranışları hakkında gerekli bilgileri sunuyor statik toplama ölçümleri (toplama indeksi) sağlayarak toplam oluşumunu analiz edebiliyoruz. Bu yöntemler, diğerlerinin yanı sıra, eritrosit sedimantasyon hızı dahilyöntem 11 ışık geçirgenliği yöntemi 12, ışık yansıma yöntemi 13 ve düşük kayma viskozitesi yöntemi 14. Birkaç çalışma RBC toplanmasını çalışma ve kontrollü akış şartlarında 15-17 toplulaştırma derecesini belirlemek için çalışmışlardır. Ancak bu çalışmalar dolaylı olarak toplama derecesi yanı sıra yerel viskozite ilgili bilgi veren mikroskobik kan görüntülerde dayalı ölçülen kesme sisteminde işgal alanı oranını belirleyerek RBC toplam boyutlarını araştırmak. Bu nedenle doğrudan RBC kontrollü ve sürekli kayma oranlarının altında, dinamik, mikrosirkülasyonda agrega ölçmek için yeni bir prosedür mevcut. Bir fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi bu nedenle, kan tabakasında bir kesme akışı oluşturma, (Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi) RBC-süspansiyonlar iki Y mikrokanaldaki, sürüklenir. Bu kan içinde sabit Shea katmanr oranı elde edilebilir. RBC-süspansiyonlar farklı hematokrit (H) düzeyleri (% 5,% 10 ve% 15) ve farklı kesme hızlarında (2-11 sn -1) altında test edilmiştir. Kan hızı ve kesme hızı akışı yüksek hızlı kamera ile görüntülenmiştir ise mikro Parçacık Görüntü Akımları (μPIV) sistemi kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar daha sonra eritrositlerde tespit ve toplam boyutlarını belirlemek için görüntü şiddetleri göre MATLAB kodu ile işlenir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU8-50 developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-50 series Plasma system&#160;</td>
			<td>Plasma Etch</td>
			<td>PE-50 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>B367861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracer fluorescent particles solution (15 mL)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>R800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggregometer</td>
			<td>RheoMeditech</td>
			<td>Rheo Scan AnD300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringes (50 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing (Tygon)</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>AAA00001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed camera (Basler)</td>
			<td>Graftek Imaging Inc.</td>
			<td>basler acA2000-340km</td>
			<td>A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pulsed camera&#160;</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td>
			<td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td>
			<td>Nexus3000 and PicoPlus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DaVis software</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>Davis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

Kan, bir Newtonian olmayan biyo-sıvı olarak, Hemorheology alanında birçok çalışmalar odağı temsil eder. Kan bileşenleri, kırmızı kan hücreleri, kan plazması içinde süspansiyon haline getirilmiş olan, beyaz kan hücreleri ve trombositler bulunmaktadır. Nedeniyle eritrosit bolluğu (kan hacminin% 40 ila 45%), onların davranışları, özellikle mikrosirkülasyondaki kanın reolojik davranışını belirler. Çok düşük kesme hızlarında, eritrositler monte görülmektedir ve form kişiler kan Newtonian olmayan davranışa neden olan agrega denir. Bu mikrosirkülasyondaki kan reolojisini kavrayabilme agrega oluşum koşullarını anlamak çok önemlidir. Burada açıklanan protokol görüntü işleme dayalı, sürekli kayma hızı altında kantitatif mikrosirkülasyonda RBC büyüklüklerinin belirlenmesi deneysel prosedür ayrıntıları. Bu amaçla, RBC-süspansiyonlar test edilmiş ve 120 x 60 mm poli-dimetil-siloksan (PDMS) mikrokanallar analiz. RBC-süspansiyonlar ent vardırKan katmanı içinde bir doğrusal hız profilini elde etmek ve böylelikle sabit bir kesme oranları geniş bir aralığını elde etmek için, ikinci bir sıvı ile yağmur. RBC agrega yüksek hızlı bir kamera kullanılarak görüntülendi sırasında kesme hızı, mikro görüntüleme ölçümleri (μPIV) sistemi kullanılarak belirlenir. RBC agrega çekilen videoları görüntüleri şiddetleri dayalı toplam boyutlarını belirlemek amacıyla görüntü işleme teknikleri kullanılarak analiz edilmektedir.

Çift-Y-mikrokanal içinde iki sıvı akımının bir örneği,% 5,% 10 ve% 15 hematokrit ile süspanse edildi ve 10 ul / sa oranında akan bir insan eritrositlerde, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Şekil 3, toplam boyutları ne zaman farkı göstermektedir kanalda akış% 10 Hematokrit için 5 ul / saat için 10 ul / saat arasında azaltılır. Hematokrit ve kesme hızı değişen bu agrega boyutlarının niteliksel kavramını verir., Üst üste üç çerçeveler için, 5 dört insan RBC agrega yerinden takip Şekil kamera kare hızı gereklidir ve niteliksel kavramının niteliksel bir ölçü sağlayan Her çerçeve içinde dağılımını toplar. Orta agregalar, sırasıyla yeşil ve kırmızı ile gösterilmiştir ve büyük agregalar (30&#39;dan daha büyük eritrositlerde tahmini) (9-30 kadar eritrositlerde tahmin edilen) ise Şekil 5 (8 ya da daha az tahmini eritrositlerde) ile, küçük agregatlar, mavi ile gösterilmiştir. Şekil 7&#39;de gösterildi sırasıyla. Ayrıca, her RBC-süspansiyon için Şekil 7&#39;de gösterilen hız RMS hataları, hız ölçümlerinin hassasiyetini belirten hızı değerleri ile karşılaştırıldığında nispeten küçüktür ve bu nedenle düşük makaslama. arayüz yerleri &#39;E&#39; olarak gösterilir ve aynı şekilde düz çizgiler olarak gösterilmiştir. (hız profilleri ve kan tabaka kalınlığına göre) farklı bir RBC-süspansiyonlar için uygun kesme hızları, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. RBC-süspansiyonların her biri için belirlenen ortalama agrega boyutları tespit etmek için bir görüntü işleme yöntemine göre RBC agregatların alanı, bir fonksiyonu olarak, Şekil 9&#39;da gösterilmektedirkarşılık gelen kesme oranı iyon. Her bir agrega olan eritrosit yüzdesi dağılımın bir örneği Şekil 6&#39;da gösterilmektedir. Agrega boyutları agregalardaki RBC tahmini sayısı olarak temsil edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig1.jpg" /> 1. Çift Y-mikrokanal yapılandırma ve giriş sıvıları Şekil. PBS Q = 8 ul / hr ikinci şubesini girerken kan Q = 2 ul / saat ilk şubesini girer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52719/52719fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig2.jpg" /> Şekil 2. Farklı hematokrit İnsan RBC-süspansiyon. Figür Q = 10 ul / saat akan insan RBC-süspansiyon Yakalanan çerçeveleri temsil (A)% 5 (B)% 10 ve (C)% 15 hematokrit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52719/52719fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig3.jpg" /> Şekil 3. Farklı akış oranlarında İnsan RBC-süspansiyon. Şekil (A) Q = 10 ul / saat ve (B) Q = 5 ul / saat akan% 10 hematokrit H askıya insan eritrositlerde Yakalanan çerçeveleri temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52719/52719fig3highres.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig4.jpg" /> Agrega tespiti için kullanılan görüntü işleme programı Şekil 4. Akış çizelgesi. Kullanılan temel metodoloji tarif gösterilen adımlar. Görüntü kalitesi c olması geliştirilmiştir<html> bir ikili görüntü onverted. agregalar algılanır ve kendi boyutlarına göre işaretlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52719/52719fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig5.jpg" /> Şekil 5. RGB renk ve birkaç insan RBC net hareketi üç ardışık çerçeveler için toplanır. Şekil dört (A) t = 0 ms, (B), t = 60 ms üç ardışık çerçeve tespit agrega ve net hareketini göstermektedir (C), t = 120 msn. Büyük agrega (&gt; 30 eritrositlerde tahmini), orta agrega (9-30 tahmini eritrositler) ve küçük agrega (&lt;8 eritrositlerde tahmini), kırmızı, yeşil ve mavi sırasıyla gösterilmiştir. Tespit edilen agrega her siyah bir daire ile işaretlenir.&quot;_blank&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig6.jpg" /> Farklı akış oranları için% 10 H RBC-süspansiyon Şekil 6. RBC toplam boyut dağılımı.% 10 H askıya kan örnekleri için Agrega boyut dağılımı, = 10 ve 5 ul / saat Q akan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52719/52719fig6highres.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakamın.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig7.jpg" /> Farklı hematokrit Şekil 7. Hız profili karşılaştırması. Hız profilleri için% 5 H (Kırmızı),% 10 H (mavi),% 15 H (yeşil) ve simülasyon 19 (düz çizgi) asılı plazma içinde eritrositler için gösterilmiştir Q = 10 ul / saat ile 120 x 60 mm çift Y-mikrokanal. arayüz yeri için E ile gösterilirdeneyler. Farklı hız profillerinin gelen RMS hatalar görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52719/52719fig7highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig8.jpg" /> Kan tabaka kalınlığının farklı RBC-süspansiyonlar ve sınırlandırılması için Şekil 8. Görüntü arka plan. Şekil 10 ul akan RBC-süspansiyonlar kan tabakası kalınlığı sınırlandırmasını gösterir / saat (A)% 5, (B askıya )% 10 ve (C)% 15, H. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52719/52719fig8highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig9.jpg" /> Figu9 Yeniden. İlgili kesme oranları bir fonksiyonu olarak ortalama agrega boyutları. Sonuçlar% 5 (A),% 10 (B) ve% 15 H (C) Q = 10 ul / saat akan farklı RBC-süspansiyonlar için elde edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52719/52719fig9highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hematokrit </td><td> Akış oranı (ul / saat) </td><td> Kayma hızı (sn -1) </td></tr><tr><td> % 5 </td><td> 10 </td><td> 11.02 </td></tr><tr><td> % 5 </td><td> 5 </td><td> 5.36 </td></tr><tr><td> % 10 </td><td> 10 </td><td> 8.17 </td></tr><tr><td> % 10 </td><td> 5 </td><td> 4.47 </td></tr><tr><td> % 15 </td><td> 10 </td><td> 7.41 </td></tr><tr><td> % 15 </td><td> 5 </td><td> 2.51 </td></tr></tbody></table> Farklı kan akımı durumlar için Tablo 1. Kayma hızı değerleri. Kayma hızı değerleri Q = 10 ul / saat akan,% 5,% 10 ve% 15 H ile farklı RBC-süspansiyonlar için μPIV veri ve görüntü işleme sonuçları kullanılarak elde edilir ve Q = 5 ul / saat.

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation at JoVE.com

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

protokol görüntü işleme tekniklerine dayanan, detay kontrollü ve sürekli kayma hızı altında Eritrosit (RBC) agrega ölçmek için deneysel bir prosedür tarif. Bu protokolün amacı, kontrollü bir mikroakışkan bir ortamda gelen kayma oranı RBC agrega boyutları ilişkilendirmek olduğunu.

Kırmızı Kan Hücresi Toplama Dinamik Soruşturma Kontrollü mikroakışkan Çevre

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Görüntüleme.  University of Ottawa.  protokol görüntü işleme tekniklerine dayanan, detay kontrollü ve sürekli kayma hızı altında Eritrosit (RBC) agrega ölçmek için deneysel bir prosedür tarif. Bu protokolün amacı, kontrollü bir mikroakışkan bir ortamda gelen kayma oranı RBC agrega boyutları ilişkilendirmek olduğunu. 

Video: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Biyomühendislik

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Ventilli Katmanlı mikroakışkan Cihazlar için çok adımlı Değişken Yükseklik Fotolitografi

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...