Yazarlar, bu protokolün optimizasyonu için Texas MD Anderson Kanser Merkezi&#39;nde Üniversitesi Tıp ve Bilim, Rosalind Franklin Üniversitesi Reynolds laboratuarında tüm üyelerini ve Chen Dong laboratuar teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (K22AI104941) den JMR bir hibe ile desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürler Tıp ve Bilim, Rosalind Franklin Üniversitesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği dairesince onaylı protokolleri kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol için kullanılan (NCI satın alınmıştır), C57BL / 6 fareleri, spesifik patojenden serbest durumlar altında muhafaza edildi ve her hayvan deneyleri Tıp Rosalind Franklin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller kullanılarak testi gerçekleştirildi ve Bilim. Araçların, Sarf Malzemeleri, ve Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> Anti-CD3 ve anti-CD28 ile kaplayın 48 kuyucuklu veya 24-yuvalı plakalar (Tablo 1) steril PBS, kapak ve parafilm sarın buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için, ve daha sonra, T bir gün önce cı 4 ° C&#39;de O / N kuluçkalanması hücre izolasyonu. 37 o C de Alternatif, kat kuyular 1 saat 0.5-1 ml 1 ug / ml anti-CD3 ve anti-CD28 hem de kaplanarak Th0 Th1, Th2 ve iTreg şartları yerinetal hacmi (48 çukurlu plaka) eritin. Th17 için, tipik haliyle kaplama, anti-CD3 1 ug / ml&#39;de ml anti-CD28 2 ug / ml&#39;de. NOT: Bu daha yüksek bir anti-CD3 konsantrasyonu Th17 üretimi için en uygun süre daha düşük bir anti-CD3 konsantrasyonu, Th1, Th2 ve iTreg üretimi için uygun olduğunu bulduk. Bu nedenle, anti-CD3 ve anti-CD28 konsantrasyonları titre ve her laboratuvar (Tablo 2) için optimize edilmelidir. </li><li> Otoklav veya dezenfektan çözeltisi ile diseksiyon araçları (makas ve forseps) bir dizi sterilize. Bir tüp veya% 70 etanol içeren küçük beher disseksiyonlarında arasındaki araçların hızlı sterilizasyon için gerekli olacaktır. Son olarak,% 70 etanol ihtiva eden bir sprey şişesi diseksiyon önce fare yüzey sterilize etmek için gerekli olacaktır. </li><li> Alüminyum folyo düz strafor parçası veya Corkboard sararak bir diseksiyon yüzey hazırlayın. Kesme veya iğne yerine hayvan sabitlemek için kullanılır. </li><li> Ti toplanması için yemekler ya da tabak hazırlayınssues. Havuzu dokular halinde, 3 ml ihtiva eden ayrı bir 60 mm tabaklar steril PBS + dalak ve lenf düğümü dokular için FBS (PBS +) yeterlidir% 1. Tek tek farelerden tutmak dokular ayrı ise, kuyulara, arzu edilen sayıda PBS + &#39;nın bir 24-çukurlu plaka ihtiva eden 1 ml hazırlar. </li><li> Kullanmadan önce, hücre kültürü ve ön sıcak için tam RPMI ortamı hazırlanması (Tablo 1). NOT: Biz rutin RPMI kullanmak ancak IMDM&#39;de ve DMEM gibi diğer medya eşit derecede etkilidir ya da laboratuarda deney ve bağlı üstün olabilir. </li><li> Naylon kareler sterilize etmek için bir 120 um gözenek büyüklüğü ve otoklav ile örgü Kesme 2x2 sm (Tablo 1). </li><li> İsteğe bağlı: CD4 + hücre zenginleştirme öncesi sıcak koşma için autoMACS olarak sisteme sıralama yüksek hızlı manyetik hücre kullanarak ve makineye zarar görmesini önlemek için 37 o C su banyosunda tamponlar durulama ise. </li><li> Not: Zenginleştirme ayırma verimi artırmak ve zaman ayırma azaltmak için tavsiye edilir. </li><li> Tümhazırlama aşamaları, diseksiyon için hariç olmak üzere, bir steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır. </li></ol> Fareler gelen Lenf Nodu ve Dalak 2. izolasyonu <ol><li> Bir kurumsal onaylı tekniği kullanılarak hayvanların gerekli sayıda Euthanize. Olarak, erkek göre naiv T hücreleri ve alt vücut yağ yüksek oranda veya daha yaşlı farelerin C57BL / 6 dişi fareler, yaş, 5-10 hafta boyunca, kullanın. Not: erkek farelerden elde edilen hücreler in vitro olarak benzer gerçekleştirir ve protokol safhaları aynı kalır. 5-10 hft dişi fareler, genellikle fare başına 3-6 x 10 6 naif CD4 + T hücreleri verecektir. Ancak, fareler kullanılarak çeşitli tipleri verim ve performansını etkileyebilir. Örneğin, C57BL / 6 farelerinden alınan hücreler Balb.c farelerden aldıkları hücreler kullanarak, Th2 hücrelerin üretilmesi için daha iyi ise, Th1 hücrelerinin üretilmesi için daha iyidir. </li><li> Hayvan uzuvları yaymak ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi yerde pin. Uzun cildi kesinDikkatli olmak itudinally çene anüs değilken derin doku delinme. </li><li> Yayılması forseps ile cildi açın ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi lenf düğümlerine kolay erişim sağlamak için yerinde cilt pin. </li><li> Şekil 1&#39;de gösterilen yerlerden erişilebilir lenf düğümleri Hasat. Forseps bir çift ile lenf düğümü kapma forseps başka bir çift ile doku ayıran kolay çıkarılması için izin verir ise. Toplama kabındaki doku yerleştirin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterilen konumdan dalak hasat edilir. Bu durumda, periton içine dikkatli bir kesme dalak erişmek için gereklidir. Bir toplama kabına doku yerleştirin. </li><li> Daha fazla dokular hasat edilecektir işlemi tekrarlayın. Aksi takdirde bir sonraki adımlara geçin. Bu noktada, sıralama sonra T hücrelerinin kaplama kadar buz üzerinde kalan tüm adımları. </li></ol> 3. Doku İşleme ve CD4 + Zenginleştirme<ol><li> Küçük lökosit ölümle sonuçlanabilir eritrosit lizis gerekmez lenf nodu hücre preparatları olarak verimi artırmak için farklı yemekler lenf düğümleri ve dalak işleyin. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar ayrıca sıralama için etiketleme önce araya getirilmesi, sonra dalak ve lenf düğümü popülasyonlarının işlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. </li><li> PBS + 3 ml içeren yeni bir 60 mm çanak toplama çanak ve yerden doku (dalak veya toplanmış lenf nodları) sökün. Sterilize forseps kullanarak doku üzerinde örgü steril naylon bir kare yerleştirin. </li><li> Bir şırınga pistonu başparmak tarafına (3-10 ml) alın ve yavaşça örgü karşı doku şut. Hemen hemen tüm doku süspansiyonu gitmek gerekir. Alternatif olarak, iki Otoklavlanmış buzlu slaytlar arasındaki doku yerleştirmek ve süspansiyon içine öğütülmüş. </li><li> Süspansiyon yukarı Pipet ve bir kaç kez aşağı kalan çözünebilir öbekler kırmak için. Bir açılması üzerine naylon örgü yeni bir kare parça yerleştirin15 ml konik tüp ve kalan enkaz kaldırmak yoluyla süspansiyon filtre. </li><li> Tekrar ek lenf nodu ve dalak dokusu için 2-4 adımları. </li><li> Süspansiyon 15 ml tüp içine süzüldü sonra PBS + ile borunun kalan dolgu ve birkaç kez ters çevirin. 4 o C&#39;de 5 dakika boyunca 475 xg&#39;de hücreleri santrifüj </li><li> Dalak hücreleri için, yüzer, aşağıdaki santrifüj aspire ve eritrositleri lizise uğratmak üzere, 1 dakika için dalak başına buzla soğutulmuş 1X ACK çözeltisi, 1 ml hücre pelletini. Daha sonra, ACK üstünde PBS + 10 ml ilave tüp ters ve santrifüj 475 x g 4 O ° C&#39;de 5 dakika boyunca </li><li> Lenf nodu hücreleri için, PBS + 2 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon aspire. Arzu edildiği takdirde, bu da ACK liziz ve yıkama aşamasından sonra, dalak hücreleri ile birleştirilebilir. </li><li> PBS + ve bir 10 ml splenositlerin santrifüj ve tekrar süspansiyon sonra süpernatan aspire. Bu noktada, lenf nodu süspansiyon birdalak süspansiyon üstünde dded doku havuzu sıralamak için gerekli ise. 4 O ° C&#39;de 5 dakika boyunca 475 x g hızında tekrar santrifüj tüpü </li><li> Hücre pelet şimdi CD4 zenginleşmesi için hazırlanmış olabilir. Bu adımı gerçekleştirilmez ise, sıralama hazırlık adımlara devam edin. </li><li> Yüksek hızlı manyetik hücre sıralama sistemini kullanarak CD4 zenginleştirme için, CD4 boncuklar ile hücresel pelletini. Tipik haliyle, PBS + 85 ul seyreltilmiş boncuk 15 ul 1 fare dokuları etiketlemek için kullanılır. Gerektiği gibi, boncuk karışımı sesini rampa pelletini ve 4 o C&#39;de 15-30 dakika inkübe </li><li> PBS + 10 ml hücreleri yıkayın 4 O ° C&#39;de 5 dakika boyunca 475 x g hızında tekrar artıkları ve santrifüj çıkarmak için yeni bir 15 ml tüp içine naylondan süspansiyon geçmesi </li><li> Fare başına PBS + 100 ul pelet yeniden süspanse edin ve yüksek hızda manyetik hücre sınıflandırma sistemi üzerinde olumlu seçim geçin. Manuel ayırma sistemi, f kullanıyorsanızzenginleştirme için üreticinin talimatlarını ollow. Seçenek olarak ise, FACS tampon çözeltisi içinde tekrar süspansiyon örnekleri PBS, 1 mM EDTA (pH = 8) ve% 1 BSA, steril olarak filtreden geçirilmiş olan. </li><li> Pozitif kısmını çıkarın ve PBS + 10ml ile tekrar yıkayın. zenginleştirilmiş CD4 + fraksiyonu şimdi sıralamak için etiketli hazırdır. </li></ol> 4. Ayırma Naif CD4 + T hücreleri <ol><li> PBS CD62L, CD44, CD25, CD4 ve karşı yöneltilmiş içeren floresan antikorlar + hücre pelet etiketleyin. Tablo 1 &#39;de listelenen antikorlar kullanılarak, her biri için seyreltme sağlanır. Boyama için, antikor kokteylinin bir 100 ul hacim, bir fare doku başına kullanılır. </li><li> Antikor kokteyli pelletini tekrar ve karanlıkta 4 o C&#39;de 15-30 dakika inkübe. </li><li> 4 O ° C&#39;de, PBS + 10 ml santrifüj 475 x g 5 dakika boyunca hücreleri yıkayın </li><li> Yeniden başka bir naylon filtre veya hücre süzgeç kapağı üzerinde karışımı geçmekherhangi bir artık enkaz taşıyın. Hücre sıralayıcı ile uyumlu olan bir tüp içine etiketli hücreler Pipet. Buz üzerinde hücreleri tutun ve tür kadar ışıktan korunmalıdır. </li><li> Bir hücre sıralayıcı toplama uyumlu tüplerin dibine tam RPMI ortam veya FBS 1-2ml pipetleme toplama tüpleri hazırlayın. </li><li> Sıralama bir CD4 + CD25 gibi naif CD4 + T hücreleri - CD62L + CD44 - nüfusun (Şekil 2). Tam RPMI ortamı ile toplanan hücreler yıkanır ve yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj. </li><li> Tam RPMI içinde pelletini saf hücrelerin sayısı ve 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır. </li></ol> 5. in vitro Farklılaşma Kurma <ol><li> Anti-CD3 ve anti-CD28 kaplı plakalara çukurlarına aspire ve steril PBS (hiç FBS) ve 1 ml her bir yıkayın. 48 oyuklu plakalar için, RP 0.5 x 10 6 hücre / oyuk olarak 0.5 ml plakaMI. 24 oyuklu plakalar, kültür 1 x 10 6 hücre RPMI / oyuk içinde 1.0 ml. </li><li> Bu tür bir ilaç olarak, bir faktör etkisi test sırasında ya da daha önce, uygun oyuklara madde ekleme veya deneye bağlı olarak farklılaşma sonra ise. Sonraki, buna göre sitokinler ve engelleme antikorlar ile kültür ortamı tamamlamaktadır. Th0: 30 U / ml hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml hIL-2 ve 5000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml hIL-2, 2.000 ng 37,51 çözünür / ml, 5000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml hIL-2, 5.000 ng / ml XMG1.2 ve 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5000 ng / ml XMG1.2 ve 5.000 ng / ml 11B11. Not: Yukarıda belirtilen koşullar farklılaşma deneyinde (Örnek Sonuçlar bölümü) sonunda ölçülen sitokin üretimini maksimize etmek için en uygun olduğu bulunmuştur. Ancak, her koşul her laboratuvar (Tablo 2 için optimize edilmelidir </strong&gt;). Ayrıca, plakaya bağlı anti-CD28 ile birlikte çözünür anti-CD28 eklenmesi laboratuvarımızda Th2 sitokin üretimini arttırdığı bulunmuştur, fakat diğer T hücresi alt kümelerinin herhangi bir etkiye sahip olduğu bulunmuştur: </li><li> Önceden gen ifadesi ve sitokin üretimi analizine d 4-5 için% 5 CO2 ile 37 C &#39;de plaka inkübe edin. Seçenek olarak ise, hücre proliferasyonunu ve son verimi artırmak için, taze ortam ile 1 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlandı, 2 gün sonra, TCR uyaranlara hücreleri çıkarmak ve yeni bir kuyu (kaplamasız) plaka. Bu durumda, taze polarize sitokinler ve antikorlar gerekli değildir, ancak, IL-2, 10 U / ml Th0, Th1, Th2 ve iTreg kültürleri için yeni ortama ilave edilmelidir. </li></ol> Farklılaşma 6. Analizi <ol><li> Akış sitometrisi ile sitokin analizi için, / ml iyonomisin veya 1 ug (örneğin, bir Brefeldin bir Golgi inhibitörünün varlığında 4-6 saat süre ile, anti-CD3 / ml Tablo ng 10ng / ml PMA ve 1000 ile her bir yeniden uyarmak1). Hücre içi sitokin boyama deney bağlı (Şekil 3) gerçekleştirin. Not: Leke olmayan soy spesifik sitokinler ya da (gösterilmemiştir), IL-4 ve IFNy gibi transkripsiyon faktörleri, negatif kontroller olarak ve farklılaşma verimliliği bir göstergesi olarak her bir durum için, Th17 kültürler için (Şekil 3). Ayrıca, Tregs karşılıklı bir gelişme olarak, Th17 kültürleri için leke Foxp3 TGFβ eklenmesi ile meydana gelebilir. </li><li> Protein ölçümü için, sitokine spesifik ELISA (Şekil 3), her bir sıra ve testte süpernatantlar toplamak. Test edilen faktör kontrol numuneleri ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunu etkilediğini endişe varsa, hücreler, yıkanabilir, normalize sayılır ve ELISA tahlilleri için süpernatanların toplanması önce 24 saat boyunca anti CD3 1 ug / ml ile yeniden uyarılan. L kadar olabilecektir, IL-4 koşulları, yıkama ve tekrar uyarılmasından gereklidir Th2&#39;den IL-4 kaldırmak için tahlil halindeİlk türev kültüründen eftover. </li><li> Gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyon analizi için hasat hücreleri kuluçka döneminden sonra, yıkama, normalize, ve anti-CD3 ve 1 ug / ml hasat mRNA önce (Şekil 3) ile 2-6 saat boyunca tekrar harekete geçirir. </li></ol>

<ol>
	<li>Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+murine+helper+T+cell+clone.+I.+Definition+according+to+profiles+of+lymphokine+activities+and+secreted+proteins.">Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins.</a> J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).</li><li>Dong, C., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+decision:+T-helper+1+and+2+subsets+in+immune+responses.">Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses.</a> Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).</li><li>Hsieh, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+TH1+CD4++T+cells+through+IL-12+produced+by+Listeria-induced+macrophages.">Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages.</a> Science. 260 (5107), 547-549 (1993).</li><li>Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+12+acts+directly+on+CD4++T+cells+to+enhance+priming+for+interferon+gamma+production+and+diminishes+interleukin+4+inhibition+of+such+priming.">Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).</li><li>Szabo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transcription+factor,+T-bet,+directs+Th1+lineage+commitment.">A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment.</a> Cell. 100 (6), 655-669 (2000).</li><li>Afkarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-bet+is+a+STAT1-induced+regulator+of+IL-12R+expression+in+naive+CD4.">T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4.</a> T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+T-bet+is+induced+by+multiple+pathways+and+prevents+an+endogenous+Th2+cell+program+during+Th1+cell+responses.">The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses.</a> Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).</li><li>Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+interleukin+4+(IL-4)-producing+cells+in+vivo+and+in+vitro:+IL-2+and+IL-4+are+required+for+in+vitro+generation+of+IL-4-producing+cells.">Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells.</a> J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).</li><li>Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+directs+the+development+of+Th2-like+helper+effectors.">IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors.</a> J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).</li><li>Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+GATA-3+is+differentially+expressed+in+murine+Th1+and+Th2+cells+and+controls+Th2-specific+expression+of+the+interleukin-5+gene.">Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene.</a> J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).</li><li>Zheng, W., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+GATA-3+is+necessary+and+sufficient+for+Th2+cytokine+gene+expression+in+CD4+T+cells.">The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells.</a> Cell. 89 (4), 587-596 (1997).</li><li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH17+cells+in+development:+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming.">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li><li>Jiang, S., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+issue+on+CD4(+)+T-cell+subsets.">A complex issue on CD4(+) T-cell subsets.</a> Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).</li><li>Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+Foxp3.">Regulatory T cells and Foxp3.</a> Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).</li><li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance.">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li><li>Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+dysregulation,+polyendocrinopathy,+enteropathy,+x-linked+syndrome:+a+paradigm+of+immunodeficiency+with+autoimmunity.">Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity.</a> Front Immunol. 3, 211 (2012).</li><li>Shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4+T+cells.">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li><li>Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+CD4++T+cell+lineage+differentiation.">Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation.</a> Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).</li><li>Harrington, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+17-producing+CD4++effector+T+cells+develop+via+a+lineage+distinct+from+the+T+helper+type+1+and+2+lineages.">Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).</li><li>Langrish, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation.">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+lineage+of+CD4+T+cells+regulates+tissue+inflammation+by+producing+interleukin+17.">A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.</a> Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).</li><li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17++T+helper+cells.">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).</li><li>Chung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+regulation+of+early+Th17+cell+differentiation+by+interleukin-1+signaling.">Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling.</a> Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).</li><li>Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4+signaling+in+T+cells+promotes+autoimmune+inflammation.">Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).</li><li>Reynolds, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4(+)+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease.">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1.">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li><li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+pathogenic+T(H)17+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling.">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li><li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells.">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li><li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T(H)+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes.">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li><li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes.">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan ederim.

Dalak saf Th hücreleri içerir, lenf düğümleri, bu nüfus oranı çok daha yüksektir. Düzgün, bu protokolde lenf düğümleri tespit ve kaldırmak için Başarısızlık saf hücrelerin kötü verim neden olacaktır. Bu daha çok yağ dokusu olması yaşlı farelerin ya da erkek farelerde özellikle zor olabilir. Hayvan bacaklarda ve cilt Şekil 1, uygun bir sabitleme ve çivileme gösterildiği gibi erişilebilir dış lenf nodu kolay görselleştirme için izin verir. Lenf düğümleri ve dalak...

farklı soy veya CD4 + T helper altkümelerinden kavramı (Th) hücreleri 20. yüzyılın ikinci yarısında 1 beri civarında olmuştur. Hücre çoğalması ve efektör Th hücreleri içinde nihai farklılaşmasının birkaç tur birlikte uyaran sinyallerin sonuçlar mevcudiyetinde aynı kökenli antijenin tanınması. Bu işlem sırasında oluşan Th hücre tipi aktivasyonu 2 sırasında, bu sitokin ortama bağlıdır. Başlangıçta, naif Th hücreleri T hücre reseptörü (TCR) aktivasyonu, birlikte uyaran CD28 ligasyonu ve sitokin sinyalizasyon aşağıdaki 2 farklı soy içine polarize düşünüldü. Tip 1 yardımcı hücreleri (TH1) olan IFNy sitokin, bunların etki edici üretiminin yanı sıra farklılaştırma işlemi 3,4; IL-12 sinyalleme duyulan gereksinimi ile karakterize edilir. Sonunda farklılaşmış Th1 hücreleri en belirgin b karakterize bir genetik profile sahip olduğu keşfedildiy Th1 genetik programın 5 ana regülatörü olarak kabul edilir T kutusu aile transkripsiyon faktörü ifadesi, Tbx21 (T-bahis). Bundan başka, IL-12, hem IFNy gibi T bahis ifade 6,7 teşvik edebilir. Immün yanıt olarak, Th1 hücreleri, hücre içi patojenler hem de oto-bağışıklık iltihap kuvvetli promotörler karşı konakçı savunması için önemlidir. Bunun aksine, tip 2 yardımcı hücreleri (Th2) kendi gelişimi için IL-4 ve IL-4, IL-5 de dahil olmak üzere, bunların etki edici sitokinler ve IL-13 gerektiren, B hücre yanıtları tahrik etmek için önemlidir ve alerji 8-patojen, 9. Th1 hücrelerinin benzer, Th2 hücreleri kendi ana transkripsiyonel regülatör ifade etmek bulundu, GATA&#39;nın-3 10,11 olarak adlandırılan. İlginçtir, polarize sitokinlerin varlığı ve belirli bir Th soyun nesil sadece belirli bir alt kümesi Th bir bağışıklık yeniden sırasında baskın hale gelebilir düşündüren, başkalarının 2,12 gelişimine antagonistiktiryanıtlarının yokluğu. Th1 ve Th2 soylarının belirlenmesi için, daha fazla çalışma son folikül yardımcı (TFH), (Th9), IL-9-üreten ve IL-22 üreten (Th22) dahil (T yardımcı hücrelerinin daha bile eşsiz bir alt küme, gösterdi ), 13 gözden. In vitro olarak farklılaşma deneylerin amaçları doğrultusunda, bu protokol regülatör T hücreleri (regülatör) ve IL-17 üreten CD4 + T hücreleri (Th17) olarak adlandırılan, yalnızca iki ek Th alt kümelerini odaklanacaktır. CD25 + regülatör T hücrelerinin timüsteki doğal (nTreg) oluşabilir; naif Th hücreleri de (14,15 gözden) çevre düzenleyici olmak üzere (iTreg) bağlı olabilir. Tregs Her iki tür karakteristik transkripsiyon faktörü, çözünür anti-inflamatuar aracıların üretimini, IL-2, tüketimi ve hücre temas yoluyla mekanizmaları 14,15 içerir, bunların etki edici bastırma mekanizmaları için kritik öneme sahiptir forkhead kutu P3 (Foxp3) olarak adlandırılan ifade eder. FoxP eksikliğiCiddi, çoklu organ otoimün bozukluğunun 3 ekspresyonu, bağışıklık düzensizliği, poliendokrinopati, enteropati olarak adlandırılan, enflamasyon çözme ve kendi çevresel tolerans düzenlemede, bu Th alt-grubun önemli bir rol gösteren X-bağlantılı sendromu (IPEX), 16 antijenleri. İn vitro olarak, saf CD4 + T yardımcı hücreleri, Foxp3 yukarı doğru regüle ve IL-2 ve 14,15, TGF-β uyarılan regülatör programına kararlı hale gelir. (17,18 gözden) sadece sitokin üretimini göz önüne alındığında, özellikle CD4 + T hücre soyları içinde önemli bir plastisite orta olabilir. Ancak, in vitro farklılaşma protokolleri amacıyla, benzersiz bir soy olarak her alt kümesi görüşecekler. Son zamanlarda, IL-17 sitokin üreten, Th17 hücrelerinin bir alt kümesi, otoimmün iltihabı 19-21 sırasında özellikle patojenik pro-iltihap fonksiyonları ile benzersiz bir soy olarak tanımlanmıştır. Th17 hücreleri benzersiz bir transkripsiyon faktörü ifade, Th17 genetik programı 22 koordinatları olarak adlandırılan retinoid ilgili yetim reseptör gama t (RORγt). TGFβ RORγt indüksiyonu ile Th17 soyunun üretimi için önemlidir. Ancak, TGFβ sinyal etkisi sadece (12 gözden), IL-6 ile sinerji üzerine Th17 taahhüdünü neden olduğuna inanılmaktadır. Daha ileri çalışmalar için diğer pozitif IL-1β de dahil olmak üzere, Th17 kararlılığını düzenleyen sinyallerin, artan sodyum ve TLR çeşitli 23-26 sinyal olduğunu göstermiştir. Diğer raporlar, in vivo olarak, patojenik Th17 hücreleri aslında TGFβ sinyal bypass olanlardır ve bunun yerine farklılaşma 27, IL-1, IL-6 ve IL-23 arasında bir kombinasyonuna bağlıdır olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu nedenle, Th17 hücre sinyal yollarının çeşitli türetilebilir; Th17 soy bağlılığı için bu protokolün amaçları için, yaygın olarak kullanılan (TGFβ ve IL-6) yolusunulacaktır. Tüm efektör soyları için aşağıda tarif edilen farklılaşma protokolleri tüm deney süresi boyunca TCR ve CD28 için uyaranı sabit antikor dayanır. Bununla birlikte, diğer göstermiştir ki antijen sunan hücreler 28 veya çapraz bağlama, anti-CD3 ve Hamster antikoru anti-CD28 antikorları, 2 gün 29 aynı zamanda çeşitli Th alt-üretilmesini indükleme son derece etkili araçlardır ile TCR aktivasyonu. Burada sunulan protokol Th17 hücreleri 31 ikincil lenfoid organlara 30 kemirgen CD4 + T hücreleri izole ve üretmek için daha önce bildirilen yöntemler üzerine inşa. Önemli bir farklılık, bu protokol, lenfoid dokulardan naif CD4 + T hücreleri izole etmek için bir hücre ayıklayıcısıyla kullanımına dayanır olmasıdır. Ancak, birçok şirket artık gereksinimi f atlamak mümkün olabilir ki, naif CD4 + T hücreleri için zenginleştirebilirsiniz hızlı ayırma kitleri teklifveya sıralama deneye bağlı olarak. yöntemler ve bu protokolde sunulan reaktifler rutin kullanımı ve en etkili bulmak ne. Ancak, alternatif reaktifler ve metodolojiler aşağıda sunulan adımları birçok mevcut olduğunu akılda tutmak ve onların amaçları için en iyi çalışacaktır belirlemek için bireysel laboratuvara kadar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete RPMI:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 micron nylon mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>CMN-0120-10YD</td>
			<td>Cut into 2 cm2 squares and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alternative: 100 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td>Alternative to cutting nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS rinsing solution</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>Warm in a 37 oC water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 beads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-049-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human (h) IL-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse (rm) IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-6</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>406-ML-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rmIL-12</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>210-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hTGFb</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2C11 (anti-CD3)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37.51 (anti-CD28)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0015-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11B11 (anti-IL-4)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BE0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD62L-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>104406</td>
			<td>Use at 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD25-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102008</td>
			<td>Use at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4-PerCP</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100434</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103012</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol&#160; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8139</td>
			<td>Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I-0634</td>
			<td>Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4506-51</td>
			<td>Use at 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse na&#239;ve cd4+ t cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

İnci durumuna bağlı olarak değişebilir farklılaşma analizi için zaman noktası T hücresi reseptör aktivasyonunun gücü gibi test edilir. Farklılaşma 2-3 gün sonra hücreler, T-hücresi çoğalması derecesini tespit etmek için ışık mikroskobu ile görselleştirilebilir. Hücrelerin çoğalmasını ve geniş topaklanma sergileyen Wells muhtemelen büyük olasılıkla kültüründe 4 gün sonra ortam tüketecektir, eksojen IL-2, örneğin, Th1 ve Th2 olarak ilave dayanarak günde 4 Farklılaşma koşulla...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse NaÃƒÂ¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets at JoVE.com

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

51.7K Görüntüleme.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals. 

Video: Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle toxicity testing in immortalized cell lines or primary cells have shown discrepancies, highlighting the need to extend the use of primary cells for in vitro assays. This protocol describes the isolation of mouse liver macrophages, named Kupffer cells, and their use to study nanoparticle toxicity. Kupffer cells are the most abundant macrophage population in the body and constitute part of the reticulo-endothelial system (RES), responsible for the capture of circulating nanoparticles. The Kupffer cell isolation method reported here is based on a 2-step perfusion method followed by purification on density gradient. The method, based on collagenase digestion and density centrifugation, is adapted from the original protocol developed by Smedsr&#248;d et al. designed for rat liver cell isolation and provides high yield (up to 14 x 106 cells per mouse) and high purity (&#62;95%) of Kupffer cells. This isolation method does not require sophisticated or expensive equipment and therefore represents an ideal compromise between complexity and cell yield. The use of heavier mice (35-45 g) improves the yield of the isolation method but also facilitates remarkably the procedure of portal vein cannulation. The toxicity of functionalized carbon nanotubes f-CNTs was measured in this model by the modified LDH assay. This method assesses cell viability by measuring the lack of structural integrity of Kupffer cell membrane after incubation with f-CNTs. Toxicity induced by f-CNTs can be measured consistently using this assay, highlighting that isolated Kupffer cells are useful for nanoparticle toxicity testing. The overall understanding of nanotoxicology could benefit from such models, making the nanoparticle selection for clinical translation more efficient.

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Nanoparçacık Toksisite Testi için Kupffer hücre izolasyonu

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında