The authors have no acknowledgements.

1. Bakteriler Süspansiyon hazırlanması: <ol><li> Bir çizgili kültür plakasına kaynaktan, aseptik olarak steril bir aşılama döngüsü yoluyla uygun bir büyüme ortamı (Tablo 1), 100 ml içeren 250 ml&#39;lik bir steril şişeye tek bir koloni inoküle. </li><li> Düzenli büyüme kontrol 1-2 gün için uygun koşullar altında (Tablo 1) yörüngesel çalkalamalı bir enkübatörde şişeyi yerleştirin. 140 RPM çalkalama hızını ayarlayın. </li><li> Aseptik, 23 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 3000 x g&#39;de iki steril 50 ml konik tüp ve santrifüj tüpleri içine bakteri süspansiyonu aktarın. </li><li> Süpernatant aspire ve steril pepton, 15 ml su ile birlikte her bir bakteri pelletini. Vortex gerekli. Bir boru / kap içine süspanse bakteri kültürü birleştirin. </li><li> Stok kültür titresi belirlemek için bölüm 4 başına üç nüsha olarak stok kültürü titre. </li><li> Buzdolabında 2 haftaya kadar 4 at için77; 2 ° C kadar gerekli. Yeniden titreye kullanım sırasında kültür, adım 4.8. </li></ol> 2. Trombosit Ürün Hazırlığı: <ol><li> Akredite bir kan bankasından bir standart aferez trombosit insan ürünü toplayın. Trombosit ürün aşağıdaki toplama şartlara uygun olmalıdır: 90-360 ml hacmi ve 0.8 -3.8 x 10 6 plateletler / ul konsantrasyon. <ol><li> Trombosit ürünü patojen azaltılması için işlemden önce 2 saat en az dinlenmiş emin olun. Bu 2 saat boyunca çalkalama olmaksızın, bir trombosit inkübatörde 22 ± 2 ° C &#39;de ürünler saklayın. İki saat sonra trombosit ürün trombosit kuluçka makinesi içinde 22 ± 2 ° C&#39;de çalkalandı olduğundan emin olun. Kadar 22 saat sonrası toplama ürünü kullanın. </li></ol></li><li> 3 ml&#39;lik bir enjektör 2 ml lik bir numuneyi çıkarın kullanarak trombosit ürününün pH değeri 22C ölçmek için uygulanır. Ürün sağlamak için bir kan gazı analizörü kullanın pH&gt; 6.6 vardır. Bir hematolojik analizör kullanarak trombosit ürünün trombosit konsantrasyonunu ölçmek için aynı örneği kullanın. Ürün 0,80-3,8 x 10 6 plateletler / ul toplama konsantrasyon gereksinimini karşılar olun. </li><li> Görme trombosit ürünün girdap değerlendirir. Ürün sahip bir &quot;0&quot; ürün atılır girdap. </li><li> Direkt beyaz ışık kaynağı altında trombosit çantasını tutun ve kısaca trombosit çanta sıkın. Görme trombosit numunenin dönen desen gözlemlemek. Aşağıdaki ölçeğini kullanarak ürünü Puan. NOT: 2 - Pozitif Girdap: Güçlü kontrast ile tüm torbaya boyunca görünür homojen olmayan Swirling. 1 - Intermediate Girdap: Bazı homojensizlik görünür, ama sadece birkaç yerde ve kötü kontrast. 0 - Negatif Girdap: öncesi ve trombosit çanta sıkma sonra kalan Bulanık homojenlik </li></ol> 3. Riboflavin ve UV Süreci: <ol><li> Transteril bir tüp yerleştirme aygıtı kullanılarak bir riboflavin ve UV ışığı aydınlatma ve saklama torbasına trombosit ürünü Sfer. Transferden sonra bir boru macunu kullanarak boş trombosit ünitesi toplama torbası kaldırma ve biyolojik tehlikeli atık olarak boş çanta atın. </li><li> Hafif koruyucu dış şal gelen stok solüsyonu riboflavin, 500 mcM 35 ml&#39;lik kese çıkarın. Steril dok işleme ve saklama torbasına giriş hattı üzerine riboflavin kiti. Içindekiler trombosit ünitesine boşalmasına izin verin. </li><li> Riboflavin kesesinden set riboflavin çantası / arıtma ve depolama çanta asmak ve yavaşça işleme ve depolama çanta dışarı ve riboflavin torbaya kalan havayı ifade eder. Trombosit ürünün küçük bir miktar sağlamak, aynı zamanda trombosit ürüne herhangi bir kalıntı riboflavin durulama riboflavin torba içine eksprese edilir. Riboflavin ve trombosit çözüm işleme ve saklama torbasına geri drenaj izin ver ve sonra giriş hattını kelepçe. Boş riboflavin çanta bize kaldırBir tüp mühürleyen ing ve biyolojik tehlikeli atık olarak boş çanta atın. </li><li> Steril dok aydınlatma ve saklama torbasına giriş hattı üzerine dişi şırınga konnektörü ile 6 &quot;boru hattı. Kadın şırınga konnektörü üzerine 10 ml şırınga varil (pistonu çıkartın) takın. </li><li> Aseptik bir pipet aracılığıyla şırınga içine stok bakterilerin 5 ml ekleyin. Giriş hattı kelepçeyi açın ve bakteriler trombosit ürüne içine boşaltın. Bazı trombosit ürün, 10 ml şırınga ağzına geri akmasına izin verilerek bir şırınga gövdesi içinde durulayın. 10 ml şırınga gövdesi çıkarın. </li><li> Aseptik 30 ml şırınga takmak ve trombosit ürünün içine karıştırılır stok bakteri sağlamak için giriş bağlantı noktası iki kez en az yıkayın. Ürün iyice karıştıktan sonra, temiz bir 5-10 ml&#39;lik bir şırınga kullanın ve 2 ml ön-muamele numuneyi çıkar. Aşılama aşamasından tanıttı havayı sağlamak, yeni bir şırınga kullanılması veya adım örnekleme kaldırılır. <ol><li> Bölüm 4 başına tedavi öncesi örneği titre. </li></ol></li><li> Arıtma ve depolama çantasından giriş satırını kaldırın ve ürünü tartın. </li><li> Aydınlatıcı içine Ürünü yerleştirin ve standart bir trombosit tedaviye başlamak için ekrandaki komutları izleyin. <ol><li> Operatör ID girin. </li><li> Güvenli ve Aydınlatıcı plakaya çanta monte edin. </li><li> Barkod okuyucu veya manuel giriş tuş takımını kullanarak Aydınlatıcı içine Numune Kimliği girin. </li><li> Tarama ürün tipi. </li><li> Kuvars kelepçesini kapatın. </li><li> Aydınlatma cihazı otomatik olarak enerji 6.24 J / ml teslim edecek. Tipik tedavi süresi 5-10 dakika sürer. </li></ol></li><li> Tedavi ve saklama torbasına örnek ampul hattı üzerine dişi şırınga konnektörü ile 6 &quot;boru hattı tedavisi steril rıhtım ardından. Ürün, teknikte iyi karıştırılır sağlanması ve daha sonra bir 5 ml şırınga takın ve 2 ml&#39;lik bir tedavi sonrası numuneyi çıkar. <ol><li> Post-tedavi sam titrebölüm 4 başına ple. </li></ol></li></ol> 4. Bakteriyel Titre <ol><li> Tedavi öncesi ve sonrası numune titresi tahmin ve her bir numunenin bir bitiş noktası seri seyreltme gerçekleştirmek için gerekli 5 mi seyreltme borulannın uygun bir şekilde hazırlayabilecektir. Aseptik pepton su 1.8 ml gerekli tüpleri doldurun. </li><li> Titre, bir 10-misli seri seyreltme şeması kullanılarak her numune. Aseptik ilk seyreltme tüpü (10 -1) için sulandırılmamış numuneden 0.2 ml aktarın. Vortex bu seyreltme tüpü ve transfer sonraki seyreltme tüp 0.2 ml. Dilüsyonları gerekli numara ile seri seyreltme devam edin. <ol><li> Aseptik aktarımı, her seyreltme oranından 100 ul uygun bir agar plaka (Tablo 1) kaplanacak. </li></ol></li><li> Steril bir hücre serpme kullanarak, eşit, her agar plaka üzerine numuneyi dağıtmak. </li><li> (Ters çevirin ve uygun şartlarda plakalar inkübe <strong&gt; düzenli büyüme kontrol 1-2 gün Tablo 1). </li><li> 30-300 koloniler ile plakaları sayın. Daha fazla, 300 koloni içeren plaklar (TNTC) saymak için çok sayıda kabul edilir. En az 30 koloni içeren levhalar niceleme limitinin (LOQ) altında olduğu kabul edilir. </li><li> Her test numunesinin titresi hesaplayın ve CFU / ml olarak sonuçları kaydedin. <ol><li> CFU / ml hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Düşük seyreltme plaka üzerinde koloniler varsa, Saptama (LOD) Limiti&#39;ni hesaplamak için aşağıdaki denklem kullanın: <img alt="Denklem 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> ve <img alt="Denklem 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Nerede: N p parçacıklar (CFU) en az sayıda =güvenle tespit edilebilir Ü. Bir mikroorganizma tespit edilmemiş olacağını p = olasılık; bir mikroorganizmanın tespit etmek için bir% 95 güven, p, 05 =. Ml V = toplam ürün hacmi plaka v = hacim kaplama (ml) x seyreltme seviyesi </li></ol></li><li> Negatif Kontrol, iki agar plakaları her birine seri seyreltmeleri kullanılır pepton su 0.5 ml plaka. Test edilecek aynı levha tipinde kullanın. Ters çevirin ve 1-2 gün aralıklarla büyüme kontrol etmek için uygun koşullarda plaka kuluçkaya yatmaktadır. <ol><li> Büyüme ya agar plaka üzerinde görülürse, kullanılan pepton şişe su atılmalıdır; Çalışmanın sonuçları da geçersiz olur. </li></ol></li><li> Pozitif Kontrol, yeniden titresi kullanılan bakterilerin stok kültür için. Ters çevirin ve 1-2 gün aralıklarla büyüme kontrol etmek için uygun koşullar plakalar inkübe. Titre kaydının CFU / ml log 1.0 ± olmalıdırÇalışma için ed stok titre (bölüm 1.5 bakınız) geçerli kabul edilecek. </li></ol>

<ol>
	<li>Brecher, M. E., Hay, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contamination+of+blood+components.">Bacterial contamination of blood components.</a> Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).</li><li>Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+bacteria+in+inoculated+platelets:+implications+for+bacteria+detection+and+the+extension+of+platelet+storage.">Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage.</a> Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).</li><li>Cardo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+inactivation+of+Leishmania+donovani+infantum+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).</li><li>Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+inactivation+of+Trypanosoma+cruzi+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).</li><li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+viral+risks+of+blood+and+blood+products.">Current viral risks of blood and blood products.</a> Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).</li><li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contamination+and+transfusion+safety:+experience+in+the+United+States.">Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States.</a> Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).</li><li>Dumont, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+single-donor+apheresis+platelets+for+bacterial+contamination:+the+PASSPORT+study+results.">Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results.</a> Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).</li><li>Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laboratory+comparison+of+pathogen+reduction+technology+treatment+and+culture+of+platelet+products+for+addressing+bacterial+contamination+concerns.">A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns.</a> Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).</li><li>Greco-Stewart, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+marcescens+strains+implicated+in+adverse+transfusion+reactions+form+biofilms+in+platelet+concentrates+and+demonstrate+reduced+detection+by+automated+culture.">Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture.</a> Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).</li><li>Keil, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Plasmodium+spp.+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).</li><li>Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+associated+with+transfusion+of+cellular+blood+components+in+Canada.">Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada.</a> Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).</li><li>Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+years'+experience+of+using+the+BacT/ALERT+system+to+screen+all+platelet+concentrates,+and+additional+testing+of+outdated+platelet+concentrates+to+estimate+the+frequency+of+false-negative+results.">Six years' experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results.</a> Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).</li><li>Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+Biological+Mechanisms+of+Pathogen+Reduction+Technologies.">Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies.</a> Photochem. Photobiol. , (2014).</li><li>Murphy, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+platelet+concentrates+for+bacterial+contamination:+low+numbers+of+bacteria+and+slow+growth+in+contaminated+units+mandate+an+alternative+approach+to+product+safety.">Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety.</a> Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).</li><li>Brien, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+incidence+and+residual+risk+of+HIV,+HBV+and+HCV+at+Canadian+Blood+Services.">Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services.</a> Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).</li><li>Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+platelets+for+bacterial+contamination+at+the+Welsh+Blood+Service.">Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service.</a> Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).</li><li>Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+universal+point-of-issue+assay+for+bacterial+detection+in+buffy+coat+platelet+components.">Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components.</a> Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).</li><li>Reddy, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+of+a+novel+riboflavin-based+technology+for+pathogen+reduction+and+white+blood+cell+inactivation.">Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation.</a> Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).</li><li>Ruane, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+inactivation+of+selected+viruses+and+bacteria+in+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+light.">Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light.</a> Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).</li><li>Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system+against+Babesia+microti+in+apheresis+platelets+and+plasma.">Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma.</a> Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).</li><li>Vanlandingham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+inactivation+of+chikungunya+virus+in+plasma+and+platelets+using+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system.">Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system.</a> Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).</li><li>Walther-Wenke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+bacterial+contamination+of+blood+components+in+Germany:+effect+of+contamination+reduction+measures.">Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures.</a> Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).</li></ol>

Bu yazının tüm yazarlar halen Terumo MKC, Mirasol PRT sisteminin geliştirici ve üreticisi tarafından istihdam edilmektedir. Bu video-makale için Yayın ücretleri Terumo MKC tarafından ödenen oylandı.

Bakteriyel tarama kan bankacılığı kurumlarında yaygın bir uygulama haline geldi ve birçok yerde için bakteri bulaşmış trombositlerin transfüzyonu önlemek için birincil yöntem olarak hizmet vermektedir. Bakteriyel tarama genellikle S. gibi hızlı büyüyen Gram negatif bakterilerin çoğunluğu yasaklamakta rağmen marcescens, E. E. coli, E. cloacae, bu S. gibi yavaş büyüyen Gram pozitif bakteriler tespit için mücadele aureus, Streptococcus spp., ve S. epidermidis 8. Ne yazık ki, bu üç Gram pozitif bakteriler, hasta mortalite 1 yol açmıştır Kirlenmiş trombosit birimleri ve bu üç organizmalar içeren trombosit ürünleri transfüzyonu% 50 yukarı sorumlu tutulmaktadır. En az bir organizma, tipik 4-8 ​​mi tarama numunesi içinde bulunan ve böylece bakteriyel tarama kadar yeterince yüksek olması için trombosit ürün bakteriyel titresi dayanır. Bir bakteri 4-8 ml&#39;lik numune hacminde çekilecek için bakteriyel titre yeterince yüksek değilse, cihaz yanlış negatif olarak işaretlenmesi ve transfüzyon için serbest bırakılır. Bakteriyel tarama için alternatif bir yaklaşım, tüm trombosit birimler yapılabilir ve bu işlevsel olmayan olarak kirlenmesine neden olan organizmaları hale getirebilir proaktif bir süreç istihdam olabilir. Bu çalışmada, bakterilerin yüksek titerleri bilerek riboflavin ve UV ışığı patojen indirgeme işleminin toplam redüksiyon kapasitesini test etmek için trombosit birimlere ilave edildi. Bakteriyel yükleri, bu çalışmada test edilen, ancak çok normal bağış esnasında kan ürünlerinde bulunan edilen miktarlardan, bu çalışma riboflavin ve UV ışığı işlemi önemli bir kontamine trombosit biriminde canlı bakteri titresi azaltmak mümkün olduğunu göstermeye yarar 5.4 log (bakteri kontamine 99,7-99,9996% azalma) (Şekil 2) 2.6. Bir sahih edinmek içinte log azalma değeri, bakteri titre adımları yaparken operatör hassas pipetleme becerileri ile birlikte iyi aseptik teknik olması çok önemlidir. Seri seyreltmeler performans Imprecise pipetleme hataların birikmesi, böylece doğru titre ölçümüne neden olabilir. Bu çalışmada toplanan veriler düşük seviyede, klinik olarak anlamlı bakteriyemi (&lt;20 CFU / birim) karşı sistemi meydan riboflavin ve UV ışınlarına, önceki çalışmaları destekler. Bir önceki çalışmada gerçek bir klinik kirlenme olayı taklit etmek için tasarlanmış ve sonuçlar riboflavin gösterdi ve UV ışığı 7 günlük trombosit saklama süresi boyunca bakteri gelişimini önlemede etkili oldu. Önceki çalışmada elde edilen verilere dayanarak Modelleme trombosit ürünleri bakteriyel kontaminasyon mevcut risk tahminleri mevcut seviyeleri 8&#39;den kadar 98 kadar% azalma olabileceğini düşündürmektedir. Riboflavin ve UV ışığı süreci bakteriyel ekrana olumlu karşılaştırırSadece klinik olarak anlamlı bakteri yükü 8 ile meydan okuduğunda trombosit birimlerinde bakteriyel kirleticileri tespit etmek için bir% 66 etkinliğini göstermiştir ing. Bütün teknolojiler gibi, trombosit ürünleri PRT tedavisi bakteri bulaşmış trombosit birimleriyle kendi sınırlamaları vardır ilişkili komplikasyonları önlemek için. PRT sistemleri bakteri sporlarına karşı etkili değildir ve PRT sistemi kalan endotoksin hala alıcı septik çarpmasına neden olabilir Gram negatif bakterilerin yüksek titreleri inaktive olabilir böylece bile endotoksin inaktive yok. Bakteriler yüksek titreleri yaymak için önce PRT iyi depolama sırasında erken yapılır. Bu iki çalışmanın kombinasyonu ile gösterildiği gibi, sonuç olarak, riboflavin ve UV ışığı işlemi hem Gram negatif ve Gram pozitif organizmaların bakteri yüklerini azaltan, ve bakteriyel tarama için uygun bir alternatif sunar. Rutin davranıyorriboflavin ve UV ışığı ile g trombosit ürünleri de virüsler ve parazitler gibi diğer kan yoluyla bulaşan ajanların potansiyel iletimini azaltarak yararı vardır.

Trombositlerin transfüzyonu, plazma, eritrositler paketlenmiş ve tam kan ürünleri, modern tıpta önemli bir rol oynamaktadır ve çeşitli tıbbi durumların tedavisinde hayati sıvıyı yerine ve sonuçta hayatlarını kurtarmak için kullanılabilir. Trombositler, ya tam kandan izole ve toplanmış bir transfusable doz halinde veya trombosit aferez sürecinde toplanan Hücresel bir ürünüdür. Vücutta trombositlerin ana rolü yara yerlerinde kanamayı durdurmak ve hemostaz korumaya yardımcı olmaktır. Düşük trombosit hücre sayımı (trombositopeni) muzdarip hastalar spontan kanama olaylarına duyarlı ve trombosit hücresi normal aralıkta geri sayım getirmek için trombositler ile transfüzyon. Toplanan trombosit 5-7 günlük bir süre için saklanabilir ve sabit bir ajitasyon altında iken 22 ± 2 ° C&#39;de saklanır. Trombosit transfüzyonu özelliklerini hayat kurtarıcı orada nedeniyle co transfüzyon alıcıya hafif bir risk olmaya devam rağmenparazitler, bakteriler ve virüsler 11 ile bu ürünlerin ntamination. Viral nükleik asit testleri uygulanması (NAT), hepatit C virüsü (HCV), Hepatit B virüsü (HBV), insan immüno-ve eksikliği virüsü (HIV) gibi büyük kan yoluyla bulaşan maddeler, viral bulaşma riskini anlamlı derecede düşme 5. Bu ajanlar HIV 1000000 8 uyarınca bağış, HCV için 1.000.000 6.7 başına bağış ve HBV 15 1000000 1,7 başına bağış olmak için Kanada Kan Hizmetleri&#39;nden yeni bir yayın kalıntı riski tahmin ediyor. Trombosit ürünleri her yıl milyonlarca transfüzyon çünkü birçok alıcı potansiyel olarak yaşamı tehdit eden komplikasyonlara maruz 1000 7 ve: bakteri genellikle kamuoyuna daha az dikkat toplamak rağmen, trombosit ürünleri bakteriyel kontaminasyon sıklığı yüksek 1 olarak tahmin edilmiştir Sepsis 6 gibi. Araştırma zamanda bu bakteri yükü göstermektedirkirlenme düşük bölgesinin &lt;100 koloni oluşturan birim (CFU) / ürün 2,16, ancak besin açısından zengin ortam ve oda sıcaklığında depolama öncesinde transfüzyon tehlikeli yüksek titreleri için çoğalırlar bakterilerin kirletici sağlar. Şu anda, trombosit alıcı ulaşmasını bakteri bulaşmış ürünlerin önlemek için yalnızca onaylanmış yöntemler kültür tabanlı sistemler ve bakım testi hızlı noktası kullanımı geçer. Kısaca, kültür tabanlı sistemler için trombosit ürünleri 4-8 ml örnek bir şişe içine trombosit üründen çıkarılır ve inoküle edilir, bunun üzerine bakterilerin ürün olarak çoğalma izin 12-24 saat için 22 ° C&#39;da bir çalkalayıcı üzerinde saklanır besleyici ortamı ihtiva etmektedir. Şişe bakteri üremesi için şişe izleyen bir alet yerleştirilir. Gösterge şişe bakteri üremesini tespit ederse bayraklı ve karşılık gelen trombosit ünitesi atılır. Bu süreç hızlı gro tespit etmede oldukça başarılı ikenkanat organizmalar, yavaş büyüyen türlerin birçoğu böylece transfüzyonu 7,12,14,16,22 için çıkacak yanlış negatif birimler için potansiyel yaratıyor, tespit için yeterince yüksek bir titreye büyümek yok. Bakteriyel yükü önemli ölçüde artmıştır zaman kültür tabanlı algılama sistemlerinin aksine, bakım testi hızlı noktası genellikle trombosit saklama dönemi daha sonra yapılır. Yüksek titreleri bakım testlerinin noktası kültürü temelli sistemlere göre daha az duyarlı olduğu için gerekli ve onlar bir titreye ≥1 x 10 3 CFU / ml 17 ulaştıktan sonra sadece güvenilir bakteri tespit edilmiştir. Ancak bu tür testler örnekleme 1 saat içinde sonuçlar sağlayabilir. Bu testlerin performansı değişkenlik alıcı 9 ölümcül septik reaksiyona neden yalancı negatif ürünün salınımına yol açmıştır. Trombosit ürünleri bakteriyel kontaminasyon sorununu mücadele için alternatif bir yol patojen azaltma proc rutin kullanımı yoluylakirletici bakterilerin inaktive yerine onları tespit deneyebilirsiniz ess. UV ışığı ile bir arada, bir photosensitizer olarak riboflavin kullanarak, bakteri 3,4,8,10,19-21 riboflavin ve UV .bir kullanımı dahil olmak üzere patojenik kan yoluyla bulaşan kirletici maddelerin geniş bir enfeksiyon oluşturma azaltmak için gösterilmiştir Patojen azaltılması için hafif toksik olmayan mutajenik ve riboflavin ve UV ışığı ile muamele edilmiş bileşenler transfüzyon alıcı hem de kan ürünleri 18 taşıma olanlar için güvenli olduğu gösterilmiştir. Kısaca, riboflavin moleküller, bakteri, parazit, virüs ve herhangi bir çekirdekli hücre (örneğin, beyaz kan hücreleri) nükleik asitleri (DNA ve RNA) ile ilişkilendirebilir. UV ışığına maruz kalma ve böylece nükleik asitlerin replikasyonu ve / veya transkripsiyon önlenmesi ve 13 inaktive organizmanın bırakarak, nükleik asitler (öncelikle guanin bazlar) fonksiyonel gruplarının bir kimyasal değişimini neden riboflavin etkinleştirir. Plaka gibi çekirdeklerini kaybetmiş hücrelersağlar ve kırmızı kan hücreleri, bağlı nükleik asidin eksikliği riboflavin kimyası ile etkilenmez. Riboflavin ve UV ışığı teknolojisi ile önceki çalışma klinik olarak anlamlı bakteri yükü (&lt;20 CFU / ürün) 8 kontamine trombosit ürünü taklit etmek amaçlanan bir deney tasarımı kullanılarak bakterilerin seçilmiş bir grup değerlendirdi. Bu çalışmanın amacı, yüksek titre bakteriyel kirlenmeye karşı riboflavin ve UV ışığı sürecini değerlendirmektir (&gt; 1.0 x 10 5 CFU / ml) sistemin toplam bakteri azaltma kapasitesini ölçmek amacıyla plazmada tedavi trombosit ürünleri. Hemovigilance çalışmaları 1 ile toplanan verilere dayalı olarak, genel olarak ortaya çıkan gram negatif ve gram pozitif organizmaların panel bu çalışmada değerlendirme için seçilir ve aşağıdaki türler dahil: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, B.cereus (vejetatif formu), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ve Klebsiella pneumoniae. B. dışındaki tüm canlılar, cereus, ATCC&#39;den elde edilmiştir ve öncelik kan bileşenlerinden izole edildiğini tespit edilmiş bakteri türleri elde üzerine yerleştirilmiştir. B. cereus bu çalışmada test kontamine trombosit ürününden içten izole klinik türdür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

Bakteriler tarafından trombosit birimlerinin kirlenmesi uzun nedeniyle sonrası bağış depolama koşulları önemli bir transfüzyon riski olarak kabul edilmiştir. Ürünler, rutin bir ajite çalkalayıcı üzerinde 22 ° C&#39;de bakteri büyümesini teşvik edebilen bir durum saklanır. Trombosit ürün içine inanılan bakteri sayısı çok düşük olduğu halde, bu bakteriler, ciddi yan etkilere yol, çok yüksek bir titre önce transfüzyon çoğalabilir. Bu çalışmanın amacı, trombosit ürünlerinin ortak kirleticiler olarak tespit edilmiştir bakteri panele karşı riboflavin tabanlı patojen azaltma süreci değerlendirmektir. Bu panel aşağıdaki organizmaları dahil: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa, ve K. pneumoniae. Her trombosit ünite yüksek bakteri yükü ile aşılandı ve numuneler b çıkarıldıtedavi öncesi ve sonrasında oth. Bir koloni deneyi oluşturan bir uç noktası sulandırması şeması kullanılarak ön-işleme ve tedavi sonrası bakteri titrelerini belirlemek için kullanılmıştır. Log azalma tedavi öncesi titresi gelen tedavi sonrası titresi çıkarılarak hesaplandı. Aşağıdaki günlük indirim gözlendi: S. epidermidis 4.7 log (99,998%), S. aureus 4.8 log (99,998%), S. 3.7 log (99.98%) Mitis, S. pyogenes 2.6 log (% 99.7), S. marcescens 4,0 log (% 99,99), Y. enterocolitica 3.3 log (% 99,95), B. neotomae 5.4 log (99,9996%), B. cereus 2.6 log (% 99.7), E.coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4.7 log (99,998%) ve K . pneumoniae 2.8 log (% 99.8). Bu çalışmanın sonuçları süreci bakteriyel kontaminasyon ile ilişkili ciddi yan transfüzyon olay riskini azaltmak için yardımcı olabilir öneririz.

On bir farklı bakteri türlerinin azaltılması riboflavin ve UV ışığı göre PRT işlemi kullanılarak değerlendirildi. Bu ajanlar trombosit ürünleri daha yaygın kirletici bazılarını temsil ve pozitif beş Gram ve altı Gram negatif organizmalar bulunur. En az altı trombosit ürünler organizma başına değerlendirilmiş ve her bir ürünün trombosit ürünü bakteri&gt; 1.0 x 10 5 CFU / ml son titresi elde etmek için yeterli bakteri ile aşılandı. Önceki tedavi etmek için örnek bir trombosit ürünü hemen riboflavin ve UV işlemi ile muamele edildi ve bundan sonra, tedavi öncesi titresi belirlemek için uzaklaştırılmıştır. Aşağıdaki günlük azalmalar gözlenmiştir trombosit ürünleri tedavi sonrasında: S. epidermidis 4.7 log (99,998%), S. aureus 4.8 log (99,998%), S. 3.7 log (99.98%) Mitis, S. pyogenes 2.6 log (% 99.7), S. marcescens 4,0 log (% 99,99), Y. enterocolitica 3.3 log (% 99,95), B.neotomae 5.4 log (99,9996%), B. cereus 2.6 log (% 99.7), E. coli ≥ 5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4.7 log (99,998%) ve K. pneumoniae 2.8 log (% 99.8) (Şekil 2). Riboflavin ve UV işlem için yukarıda belirtildiği gibi tüm birimler sistem özellikleri bir araya geldi. Ek redüksiyon testi S. ile gerçekleştirildi buffy coat türetilmiş tabakalar kullanılarak pyogenes. Anlamlı bir fark S. azaltılması gözlendi aferez trombositler karşı ince beyaz tabaka elde edilen trombositler içinde pyogenes (veriler gösterilmemiştir). <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tablo 1: riboflavin ve UV ışığı kullanılarak değerlendirildi bakteriyel tür için büyüme koşulları. Trombosit ürünleri kirletebilir gösterilmiştir hem Gram negatif ve Gram pozitif bakterilere oluşan bir panel, bu çalışma için seçilmiştir. Büyüme yaymak için kullanılan koşulları (sıcaklık ve ortam türü) ve titer organizmalar gösterilir. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Şekil 1: Riboflavin ve UV ışığı patojen azaltma süreci. Riboflavin 500 uM nominal konsantrasyonda% 0.9 tuzlu su içinde çözülmüştür. Çözüm, her trombosit ürünün içine bağlanmış ve süzülmüş steril oldu. Bakteriler, her trombosit birimine aseptik eklenmiş ve daha sonra UV enerji (yaklaşık 6-10 dakika) 6.2 J / ml ile muamele edilmiştir. Bu in vitro tedavi sonrası trombosit ünitesi nihai bakteri titresi belirlemek için numune alındı ​​çalışma. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Şekil 2:., Riboflavin ve UV ışığı Riboflavin ile muamele edilmiş ve UV ışığı trombosit ürünleri yaygın bakteriyel kirletici bakteri yüklerini azaltmak için kullanılan, farklı bakteri türlerinin indirgenmesi. Günlük 10 indirim farkıOrtalama tedavi öncesi titresi ve ortalama tedavi sonrası titresi arasında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination at JoVE.com

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Riboflavin ile Trombosit Ürünleri ve UV Işık Tedavisi: Yüksek Titre Bakteriyel Kontaminasyon Karşı Etkinliği

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

treatment-platelet-products-with-riboflavin-uv-light-effectiveness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Görüntüleme.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Video: Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types of cells. Because of safety concerns associated with these HIV-1 derived vectors, producing large quantities of LVs is challenging. In this paper, we report a method for producing high titers of self-inactivating LVs. We retrovirally transduce the tet-off stable producer cell line GPR to generate a cell line, GPRS, which can express all the viral components, including a dendritic cell-specific glycoprotein, SVGmu. Then, we use concatemeric DNA transfection to transfect the LV transfer plasmid encoding a reporter gene GFP in combination with a selectable marker. Several of the resulting clones can produce LV at a titer 10-fold greater than what we achieve with transient transfection. Plus, these viruses efficiently transduce dendritic cells in vitro and generate a strong T cell immune response to our reporter antigen. This method may be a good option for producing strong LV-based vaccines for clinical studies of cancer or infectious diseases.

Here, we use retroviral transduction and concatemeric transfection to create a cell line that can express the components of a lentiviral vector (LV) in the absence of tetracycline. This LV encodes GFP and is pseudotyped with a glycoprotein, SVGmu, which is specific for a receptor on dendritic cells.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Fonksiyon kazancı Reporter sistemleri ile spesifik Mikobakteriyel güvenirlik oranlarının ölçülmesi

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

Bakteriyel Keratite Karşı İlaç Tedavilerini İncelemek İçin Porcine Ex Vivo Kornea Modeli Kurulması

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...