Bu çalışma FWO-Vlaanderen, IOF projesi IOF10 / StarTT / 027 ve Gent Üniversitesi Özel Araştırma Hibe BOF12 / GOA / 014 tarafından desteklenmiştir.

Not: Aşağıdaki transfeksiyon ve ko-immünopresipitasyon protokolü 9 cm Petri kabı biçimi için kurulur. Diğer formatlar protokolü ölçekleme sonra da mümkündür. 1. Tohum insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri <ol><li> % 10 fetal dana serumu, 2 mM L-glutamin, 0.4 mM Na-piruvat ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 12 ml 9 cm&#39;lik petri tabağı başına 1.2 x 10 6 hücre transfeksiyondan önce HEK293T hücreleri bir gün Seed, 0.1 mM temel olmayan amino asit, 100 U / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin. </li><li> Hücreler, 37 ° C&#39;de 16 saat ve% 5 CO2 büyütün. </li><li> Görme transfeksiyondan önce ters ışık mikroskobu ile morfoloji ve hücrelerin canlılığını kontrol edin. Hücreler uygun transfeksiyon etkinliği için alt konfluent olması gerekir. </li></ol> HEK293T Hücreler 2. Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu Not: Kullanım 0.5-1 pCAXL-NP veya 9 cm tabak başına pCAXL-MX1 1-3 mikrogram ile birlikte boş pCAXL plazmid ug. Tüm örneklerde toplam plazmid DNA eşit miktarda kullanmak; Boş plazmid gerekirse ayarlayın. <ol><li> Aşağıdaki transfeksiyon tamponlar hazırlanması: <ol><li> 1.0 mM Tris-HCI, pH 8.0 ve 0.1 mM EDTA pH 8.0 konsantrasyonda Tris-EDTA (TE) hazırlayın. </li><li> 25 mM HEPES konsantrasyonlarda BS / HEPES hazırlayın (5.96 g / L, 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit), 274 mM NaCI (16 g / L), 10 mM KCI (0.74 g / L), 1.5 mM NaHPO 4 · 12H H2O (0.5 gr / L) ve 11.1 mM dekstroz (2 g / L). 7,05 pH ayarlayın. </li><li> 1.25 M CaCI2 · 2H 2 O (183.8 g / L) ve 125 mM HEPES (29,79 g / L) arasında dağılım gösterebilir ve CaCl2 / HEPES hazırlayın. NaOH ile 7,05 pH ayarlayın. </li></ol></li><li> Kullanımdan önce 37 ° C &#39;de transfeksiyon tamponlar ısıtın. </li><li> TE 600 ul plazmid DNA seyrelterek plazmid örnekleri hazırlanır.6 gözlü bir levhanın gözleri içine bu karışımları hazırlayın. </li><li> Plazmid örnekleri damla damla şekilde CaCl2 / HEPES 150 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı 3 kez pipetleme karıştırın. </li><li> (750 ul TE + DNA + CaCl2 / HEPES) taze 6-çukurlu plaka içindeki Resim BS / HEPES tamponu 750 ul damla plazmid çözeltisi eklenerek damla transfeksiyon çözelti hazırlayın. Tam da içeren BS / HEPES tamponu üzerinde eşit plazmid çözümü dağıtın. </li><li> 1000 RPM&#39;de 90 sn için, bir plaka karıştırıcısı üzerinde transfeksiyon solüsyonu çalkalayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> Transfeksiyon solüsyonu (1.5 mi) hücrelere damla damla ekleyin. Hücreler üzerinde transfeksiyon solüsyonu damla P1000 mikropipet kullanın. Tam 9 cm Petri kabı üzerine karışımı dağıtılır ve çok yavaşça plaka sallayın. </li><li> 6 st için CO 2, 37 ° C&#39;de kuluçkaya bırakılır ve% 5. Sonra aspirasyon orta kaldırmak ve hemen wi yerine12 ml taze, önceden ısıtılmış orta inci. Yavaşça hücre ayrışması önlenmiş, hücrelere taze ortam ilave edin. Bunun için, kuyunun kenarına pipet ucu tutun ve yavaşça orta dışarı itmek. </li><li> 37 ° C&#39;de ilave bir 16 saat daha kuluçkaya bırakılır ve% 5 CO2. </li></ol> 3. ko-immünopresipitasyon Not: transfeksiyondan sonra eş-immunoprecipitation 24 saat gerçekleştirin. <ol><li> Düşük tuz liziz tamponuyla yıkandı ve yüksek tuzlu yıkama tamponu hazırlanması. <ol><li> NEM miktarının tartılması ve mutlak etanol içinde çözülmesiyle 2 M, N-etilmaleimit (NEM) bir stok çözeltisi hazırlandı. Kullanmadan önce taze NEM stok çözeltisi hazırlayın. DİKKAT: NEM, çok toksik hazırlamak ve davlumbaz, bu stok solüsyonu kullanın. </li><li> 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 1 NP-40 ve bir proteaz inhibitör kokteyli konsantrasyonlarda düşük tuz liziz tamponu (1 tablo çözülür50 ml lisiz tampon maddesi içinde) ihtiva eder. 25 mM (örneğin, 1:80 seyreltilir), bir son konsantrasyon elde edecek NEM ekleyin. Proteaz inhibitörleri ve NEM ekledikten sonra buz üzerinde tutun. Not: Kullanmadan önce her zaman taze proteaz inhibitörleri ve NEM ekleyin. </li><li> 50 mM Tris-HCI, pH 8, 500 mM NaCI, 5 mM EDTA ve% 1 NP40 konsantrasyonlarda yüksek tuzlu yıkama tamponu hazırlayın. Yüksek tuz yıkama tamponu NEM içermediğini unutmayın. </li></ol></li><li> Hücre lizatlarının Hazırlanması. <ol><li> Ortamı çıkarın ve buz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su, 2 ml (PBS) ile hücreleri yıkayın. HEK293T hücreleri kolayca ayırmak gibi çok nazikçe, yıkama tamponu ekleyin. </li><li> PBS çıkarın ve 9 cm Petri başına buz soğuk düşük tuz lizis tamponu 600 ul ekleyin. </li><li> Buz üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edin. Plakalar yatay tutulur lizis tamponu ile plaka yüzeyinin tam kapsama sağlamak için, emin olun. Yavaşça her 5 dk plakaları sallayın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj hücre lizat toplayın4 ° C&#39;de 3 dakika 16,000 x g&#39;de için boru ve santrifüj çözünmeyen fraksiyonu pelet haline getirmek üzere. </li><li> Yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre lizatı, yani çözünür fraksiyonu aktarın ve buz üzerinde tutun. Hemen etkileşim proteinlerin ayrışma önlemek için, ko-immünopresipitasyon protokolü ile devam edin. Lizatlarında proteolitik etkinliğini sınırlamak için buz üzerinde mümkün olduğu kadar ya da 4 ° C &#39;de, aşağıdaki adımları. </li></ol></li><li> Bağışıklık-komplekslerinin Nesil. Not: Bu adımda, ilgi konusu bir protein, uygun antikor ile bağlıdır. NP MX1 etkileşimini incelemek için bir fare anti-NP monoklonal antikor kullanılır. <ol><li> Her numune için, bir anti-NP monoklonal antikorun 2 ul ve düşük tuz lisiz tamponu (250 ul toplam hacim) 113 ul lizat 135 ul karıştırın. , Örneğin batı beneklemesi gibi daha fazla analiz için -20 ° C&#39;de, kalan lisat saklayın edebilmiş Intera ifade seviyelerini belgeTransfekte edilmiş hücrelerde ölü m işbirliği yapmaktadır. Not: Alternatif olarak, her bir lizattan için, örneğin, 400 ug (Bradford reaktifi ile, örneğin) lizat proteini konsantrasyonunu ölçmek ve toplam proteinin sabit bir miktar kullanılır. </li><li> 4 ° C&#39;de bir döner tekerlek üzerinde 3 saat süre ile, antikor lizat karışımı inkübe edin. Bu aşama, bir gece boyunca inkübasyon için genişletilebilir. </li></ol></li><li> Protein G, tanelerin hazırlanması. Not: Protein G, boncuk sevk ve korunması için% 20 etanol içinde saklanır. Boncuk bulamaç normal olarak% 50 tanecikleri içerir ve immün komplekslerin immünopresipitasyon için kullanılmadan önce, bu boncuklar yıkandı gerekmektedir. <ol><li> Her bir örnek için, örneğin, boncuklar, 50 ul, boncuk çamurunun 100 ul kullanın. Bir tüp içinde ko-immünopresipitasyon deneyinde bütün örnekler için gerekli olan tanelerin miktarının yıkayın. Boncuk-bulamaç pipetlenmesini kolaylaştırmak için 1 ml pipet ucu kesin. </li><li> 8.000 x G proteini boncuk bulamaç santrifüjg ve 30 saniye süreyle 4 ° C&#39;de. Etanol çözeltisi çıkarın ve düşük tuz lisis tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin. Santrifüj protein G 8000 xg&#39;de boncuk bulamaç ve 30 saniye süreyle 4 ° C&#39;de yavaşça süpernatant kaldırmak. Bu yıkama adımı 3 kez tekrarlayın. Not: proteaz inhibitörleri ya da NEM içermesi gerekmez boncuk yıkamak için kullanılan düşük tuz lizis tamponu. </li><li> Protein G, tanelerin hacim tahmin ve düşük tuz lisis tampon maddesinin eşit hacmi düşük tuz liziz tamponu içinde yeni bir% 50 boncuk bulamaç ekleyin. </li><li> Her numune için, yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, boncuk çamurunun 100 ul transfer edilir ve kullanıma kadar buz üzerinde muhafaza edin. Bu boncuklar hızla tüpün dibine sediment gibi, bölünmeden önce boncuk bulamaç tekrar süspansiyon dikkatli olun. </li></ol></li><li> Protein G, boncuk ve bunların elüsyon ile immün komplekslerin immünopresipitasyonu. <ol><li> Santrifüj tüm boruları 30 sn 8,000 xg&#39;de ve 4 ° C ve immunoprecipitation protein G boncuklar kullanmadan önceTüm örneklerde mevcut olan tanelerin eşit miktarda olduğu görsel inceleme ile kontrol edin. Gerekirse yeniden örneklerin ve santrifüj bazı tanelerin miktarını ayarlar. Süpernatantlar atın. Peletlendi protein G boncuk rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Kısaca immün kompleksleri santrifüj (örn., Bir antikor, 250 ul ile lizatları) 8000 x g, 30 saniye ve 4 ° C&#39;de borunun alt kısmında tamamen örnek toplamak için. Protein G, boncuklar (50 ul) ile immün kompleksleri aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de bir döner tekerlek üzerinde 60 dakika kuluçkalayın. G proteini tanelerine proteinlerin spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için, bu immün kompleksleri boncuklar ile daha uzun bir süre 75 dakika inkübe etmeyin. </li><li> 8,000 x g&#39;de 30 saniye için (bağlı immün kompleksleri ile), protein G boncuk santrifüj ve 4 ° C ve süpernatantlar çıkarın. Peletlendi protein G boncuk rahatsız etmemek için dikkatli olun. İsteğe bağlı: veya -20, daha sonra analiz için C, 4 ° C &#39;de bu süpernatantlar depolamakÖrneğin, bağlanmamış protein miktarını tahmin etmek. </li><li> Yüksek tuzlu liziz tamponu içinde 900 ul, yaklaşık 5 dakika boyunca, protein G boncuk yıkayın. Boncuklar bütünüyle optimal yıkama için, yıkama tampon maddesi içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş olduğundan emin olun. 8,000 x g&#39;de 30 saniye için, protein G boncuk santrifüj ve 4 ° C ve süpernatantlar atın. Bu yıkama adım 4 kez tekrarlayın. Çökeltilir malzeme kaybını önlemek için topaklandı protein G boncuk rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Son yıkama aşamasından sonra, boncuklara 2x Laemmli numune tampon maddesi 50 ul ve (ko) imüno proteinleri elüte etmek için 95 ° C&#39;de 10 dakika boyunca bir süspansiyon ısıtın. <ol><li> Sodyum dodesil sülfat, 1 g, gliserol ve 3.5 ml 1 M Tris-HCI pH 6.8 ve β-merkaptoetanol ve 420 ul 3.5 ml 6x Laemmli tampon maddesi 10 ml hazırlayın. Damıtılmış su ilave edilerek, 10 ml toplam hacim için ayarlayın. 2x Laemmli tamponu elde etmek üzere distile su içinde 3 kez seyreltilir. DİKKAT: &amp;# 946; mersaptoetanol toksik, hazırlamak ve davlumbaz Laemmli tampon kullanabilirsiniz. </li></ol></li><li> Isıtıldıktan sonra, 8.000 xg&#39;de 30 saniye protein G boncuk santrifüj ve 4 ° C (kısa vadeli) ya da -20 ° C (uzun vadede) ° örnekleri saklamak. </li></ol></li></ol> 4. immunopresipite Proteinler (co-) analiz <ol><li> SDS-PAGE 20 ve 21,22 lekeleme batı hücre lizatı ve ko-immunoprecipitation eluatını mevcut proteinleri gözünüzde canlandırın. Tipik jel üzerinde Laemmli elüatın yarısını yükleyin. Jel yükleme için numune alırken topaklandı protein G boncuk rahatsız etmemek için dikkatli olun. Mx1 ve NP ifade, anti-MX1 ve anti-NP antikoru, sırasıyla 14, bir ile ortaya çıkarılmıştır. bantlar HRP-tabanlı chemiluminescence ve bir X-ışını filmi geliştirici ile tespit edilmiştir. </li></ol>

<ol>
	<li>Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mx+proteins:+antiviral+gatekeepers+that+restrain+the+uninvited.">Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).</li><li>Goujon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+MX2+is+an+interferon-induced+post-entry+inhibitor+of+HIV-1+infection.">Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).</li><li>Kane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MX2+is+an+interferon-induced+inhibitor+of+HIV-1+infection.">MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection.</a> Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+MxB+protein+inhibits+HIV-1+infection.">The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection.</a> Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+human+MxA+GTPase+blocks+nuclear+import+of+Thogoto+virus+nucleocapsids.">Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).</li><li>Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+interactive+region+of+human+MxA+GTPase+is+involved+in+GTPase+activation+and+interaction+with+viral+target+structures.">The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+(Orthomyxoviridae).">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution-guided+identification+of+antiviral+specificity+determinants+in+the+broadly+acting+interferon-induced+innate+immunity+factor+MxA.">Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).</li><li>Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+antiviral+activity+of+the+human+MxA+protein+against+Thogoto+and+influenza+A+virus.">Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus.</a> J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).</li><li>Turan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+MxA+proteins+form+a+complex+with+influenza+virus+NP+and+inhibit+the+transcription+of+the+engineered+influenza+virus+genome.">Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome.</a> Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).</li><li>Dittmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+strains+differ+in+sensitivity+to+the+antiviral+action+of+Mx-GTPase.">Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase.</a> J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).</li><li>Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viral+nucleoprotein+determines+Mx+sensitivity+of+influenza+A+viruses.">The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses.</a> J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).</li><li>Manz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+influenza+A+viruses+escape+from+restriction+by+human+MxA+through+adaptive+mutations+in+the+nucleoprotein.">Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein.</a> PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).</li><li>Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-inducible+protein+Mx1+inhibits+influenza+virus+by+interfering+with+functional+viral+ribonucleoprotein+complex+assembly.">Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly.</a> J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).</li><li>Brewer, C. F., Riehm, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+possible+nonspecific+reactions+between+N-ethylmaleimide+and+proteins.">Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins.</a> Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).</li><li>Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+ribonucleotide+reductase+M1-gemcitabine+interaction+in+vivo+by+N-ethylmaleimide.">Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide.</a> Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).</li><li>Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dimerization+of+human+MxA+promotes+GTP+hydrolysis,+resulting+in+a+mechanical+power+stroke.">Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke.</a> Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).</li><li>Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+and+metal-ion-binding+properties+of+the+Ca2+-binding+helix-loop-helix+EF-hand+motifs.">Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs.</a> Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+mouse+Mx+proteins+inhibit+different+steps+of+the+influenza+virus+multiplication+cycle.">Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle.</a> J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Antiviral proteinler ve bunların viral hedeflere arasındaki etkileşimi incelemek bu proteinlerin antiviral mekanizmasının ayrıntılarını anlaşılması çok önemlidir. Bu yeni antiviral stratejilerin geliştirilmesi için temel virüsler ve onların ana-evrimleşmiş eş nasıl yeni anlayışlar vermek ve olabilir. Burada anlatılan optimize ko-immünopresipitasyon protokol fare MX1 protein ve viral hedef, grip NP proteini arasındaki etkileşimi incelemek için izin verir. NP-MX1 etkileşimi NEM (Şeki...

Myxovirus direnci (Mx) proteinler, viral patojenlere karşı doğal bağışıklık savunma önemli bir parçasıdır. Bu proteinler tip I ve tip III interferonlar tarafından indüklenen büyük Dynamin benzeri GTPazlar bulunmaktadır. karşılık gelen Mx genleri, bir ya da birden çok kopya halinde hemen hemen tüm omurgalıların içinde bulunmaktadır ve bunların gen ürünleri Ortomiksoviridae (örn., influenza virüsü), Rhabdoviridae (örn., veziküler stomatit virüsü), Bunyaviridae (örneğin, de dahil olmak üzere, virüslerin bir geniş inhibe eder. la crosse virüsü) ve (örneğin, insan bağışıklık eksikliği virüsü-1), 1-4 Retroviridae. Bu proteinler virüslerin böyle geniş bir dizi tanımak nasıl görünürde herhangi paylaşılan birincil dizisi bu virüsler, motiflerin olmadan, belli değil. Potansiyel, onların viral hedefleri ile Mx proteinlerinin etkileşimi analiz diğer ana hücre faktörleri ile yüksek mertebeden kompleksleri içeren, t moleküler mekanizmalarını anlamak için yardımcı olacaktırşapka virüs ve ev sahipleri arasında silahlanma yarışında gelişmiştir. Memeli Mx proteinleri ve viral hedefler arasındaki etkileşim, insan mxa için en yaygın çalışılmıştır. İnsan MxA ortomiksovirüsler influenza A ve Thogoto virüsü de dahil olmak üzere pek çok virüslerin çoğalmasını inhibe edebilmektedir. MxA böylece enfeksiyon 5 blok sonuçlanır nükleer girişini engelleyen Thogoto virüs ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) bağlanmaktadır. MxA ve Thogoto virüs vRNPs arasındaki bu etkileşim, eş çökeltme ve ko-immünopresipitasyon deneyleri 6-9 ile gösterilmiştir. Mx proteinleri influenza A virüsleri engel Nasıl daha az açıktır. Önemli bir sorun, bir MX proteini ve bir grip gen ürünü arasındaki bir etkileşimi göstermek için açık değildir olmasıdır. Bir rapor influenza A virüs bulaşmış hücreleri 10 insan mxa ve NP proteini arasında bir etkileşim göstermiştir. Bu etkileşim sadece eş-immunopr tarafından gösterilen olabilirecipitation hücre etkileşimi, geçici ve / veya zayıf olduğunu düşündürmektedir, liziz önce çapraz bağlanma belirteci ditiyobis (sukkinimidil propiyonat) ile muamele edilmiş olsaydı. Daha yeni çalışmalar, farklı grip A suşları ayırıcı Mx duyarlılığı NP proteininin 11,12 kökeni ile tespit edildiğini göstermiştir. Bu doğrultuda, influenza A virüsleri kısmen NP proteini 13 özel kalıntıları mutasyona Mx kontrolünden kaçabilir. Böylece, ana Mx için influenza A virüs temel hedefi, büyük olasılıkla NP vRNP kompleksleri monte NP protein olduğunu göstermektedir. Ancak, bu daha yeni çalışmaların hiçbiri grip NP veya vRNPs ve ya insan mxa veya fare MX1 arasında bir etkileşim göstermiştir. Yakın zamanda ilk kez gösterdi burada ayrıntılı olarak tarif edilen bir optimize edilmiş ko-immünopresipitasyon protokolü 14 ile grip NP ve fare MX1 proteini arasındaki etkileşim. Genel co-immunoprecipitation, protein-protein etkileşimi araştırmak için en sık kullanılan biyokimyasal yaklaşımlardan biridir. Bu doğal ortamda, protein-protein etkileşimlerini incelemek sağlar çünkü bu teknik, çoğu zaman, alternatif teknikler, örneğin, maya iki hibrid tercih edilir. Ilgi konusu olan proteinlerin karşı antikorların olup olmadığını ko-immünopresipitasyon endojen olarak ifade edilen proteinleri ile gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, ilgi duyulan proteinlerin transfeksiyon ya da enjeksiyon aracılığıyla hücre içinde eksprese edilebilir ve bir afinite etiketi kullanılabilir. Yukarıda belirtilen avantajlara ilave olarak, tarif edilen ko-immünopresipitasyon protokolü zayıf ve / veya geçici protein etkileşimleri saptanmasını sağlar. Bu optimize edilmiş protokolde ana bileşeni hücre parçalama tamponu içinde, N-etilmaleimit (NEM) eklenmesidir. NEM 6,5-7,5 arasında bir pH değerinde, örneğin sistein, mevcut serbest tiyol grupları ile reaksiyona giren bir alkile edici bir madde, sabit bir tiyo-ester oluşturmak üzere(Şekil 1). Yüksek bir pH&#39;de, NEM da amino grupları ile reaksiyona giren ya da hidroliz 15 uğrayabilir. NEM tipik haliyle disülfid bağı oluşumunu önlemek ya da enzimatik aktivitesini inhibe etmek için, serbest tiyol gruplarını bloke etmek için kullanılır. Örneğin, NEM, genellikle sistein proteazlarıdır, ki desumoylating enzimler, bloke edilmesi için kullanılmaktadır. Grip proteinleri sumoylation viral proteinlere 16 arasındaki etkileşimi etkileyebileceği bildirilmiştir çünkü tarif edilen ko-immünopresipitasyon protokolde, NEM ilk liziz tamponuna dahil edildi. Beklenmedik, Milli Ekonomi Modeli&#39;nde eklenmesi eş immunopresipitasyon influenza NP ve fare MX1 arasındaki etkileşimi belgelemek için anahtar olduğunu kanıtladı. Milli Ekonomi Modeli&#39;nde eklenmesi NP-MX1 etkileşimini tespit etmek önemlidir nedeni belli değildir. Muhtemelen etkileşim çok geçici ve / veya zayıf. NEM MX1 belirli bir konformasyon, bir viral protein ya da bilinmeyen bir üçüncü alçı koruyarak, örneğin etkileşimi, stabilize olabilirDaimi. NEM gibi bir stabilize edici etkisi ribonükleotid redüktaz M1 ve inhibitör gemsitabin (F2dC) 17 arasındaki etkileşim için, örneğin, daha önce tespit edilmiştir. MX1 ve NP hem NEM tarafından değiştirilebilir çoklu sistein artıklarını ihtiva etmektedir. Örneğin, Rennie&#39;yle ve ark. Tarafından yapılan bir çalışmada, sapsız MxA varyantı iyodoasetamit ile modifiye edilebilir, üç çözücüye maruz kalan sistein artıklarını ihtiva ettiğini ortaya çıkarmıştır. Serinler, bu kalıntıların mutasyona tâbi mXA enzimatik aktivitesini etkileyebilir fakat disülfitin aracı toplanmasını 18 engelledi değildi. Bu sisteinler MX1 ​​muhafaza edilir, bu MX1 analog sisteinler NEM tarafından, bu etkinin de uyum ve çözünürlük gibi modifiye edilebileceğini de önermektedir. Buna ek olarak, NEM da MX1 anti-influenza aktivitesi için gerekli olan MX1, bir GTPaz aktivitesini etkiler ve böylece MX1 ve NP arasındaki etkileşimi sabitleme olabilir. Ancak, GTPaz acti tarihinde NEM doğrudan etkisiNEM grip NP ve GTPaz MX1 proteininin 14 inaktif mutantlar arasındaki etkileşimi tespit etmek için gerekli olduğu gibi MX1 ve vite, olası değildir. Açıkçası, daha fazla araştırma NP-MX1 etkileşim NEM etkisini çözülmeye ihtiyaç vardır. Özet olarak, tarif edilen ko-immünopresipitasyon protokolü antiviral MX1 proteini ve bunun viral hedef influenza NP proteininin etkileşimini çalışma sağlar. Bu protokol, aynı zamanda, belirli protein şeklindeki stabilizasyonu bağımlı olan diğer zayıf ya da geçici etkileşimler üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Belirli düzenlemelere bağlı protein-protein etkileşimi gibi kalmodulin 19 kalsiyum-bağlayıcı proteinler, örneğin, daha önce tarif edilmiştir. Son olarak, NEM uygun rolü, aynı zamanda, eş çökeltme tahlilleri gibi protein-protein etkileşimlerini tespit diğer yöntemler de kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>52100-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-3876</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-30212</td>
			<td>also known as NP40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 873 580 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NP monoclonal antibody</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-4282</td>
			<td>ascites blend of clones A1 and A3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RNP polyclonal serum</td>
			<td>NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository</td>
			<td>NR-3133</td>
			<td>directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4FF</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyperfilm ECL 18 x 24 cm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9068-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation of the mouse mx1 protein with the influenza a virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

N-etilmaleimit sistein proteazlarını geri dönülmez (Şekil 1) önlenmesi için, örneğin, serbest tiyol gruplarını düzenlemek için kullanılabilecek bir organik bileşiktir. Antiviral MX1 proteini influenza virüs nükleoprotein ile etkileşerek bir virüs çoğalmasını engeller. Burada anlatılan optimize ko-immünopresipitasyon protokolü bu NP-MX1 etkileşim çalışma sağlar. HEK293T hücreleri grip NP proteininin varlığı veya yokluğu antiviral M...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein at JoVE.com

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

co-immunoprecipitation-mouse-mx1-protein-with-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K Görüntüleme.  VIB. This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Video: Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Enfekte Hücre Kromatin gelen Gribi ribonükleoprotein Komplekslerinin Affinity Arıtma

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Domuz influenza A virüs Algılama ve İzolasyonu için Burun Mendil

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.