Mitokondriler, kendi DNA'larına sahip olmalarına rağmen nükleer genoma büyük ölçüde güveniyorlar. Bu nedenle, son derece düzenlenmiş bir ithalat mekanizması gereklidir. Bu yöntem, sürecin ve dış uyaranlara nasıl uyum sağlayabileceğinin incelenmesine yardımcı olur.
Bu, mitokondrilerin çeşitli alt bölmelerine protein ithalatını nicel olarak değerlendirmek için mevcut tek biyokimyasal tekniktir. Mitokondrilerin uygulanabilirliği çeşitli hastalık durumlarına dahil edilir, bu nedenle protein ithalatının nasıl düzenlendiğini anlamak mitokondriyi hedefleyen yeni terapötik yaklaşımlara katkıda bulunmaya yardımcı olabilir. Mitokondrilerin canlılığını ve bütünlüğünü sağlamak için izolasyon sırasında ekstra bakım gereklidir.
Dokunun iyice kıyılması ve sonraki tüm peletlerin hafifçe yeniden dürtmesi gereklidir. Prosedürü gösteren Ashley Oliveira olacak, laboratuvarımda doktora öğrencisi. Mitokondrilerin iskelet kasından izolasyona başlaması için, kaslardan yağ ve bağ dokusunu çıkarın ve homojen bir bulamaç olana kadar önceden soğutulmuş bir saat camı üzerindeki dokuları kıyın.
Kıyılmış dokuyu önceden soğutulmuş 50 mililitrelik plastik santrifüj tüpüne yerleştirin ve tam ağırlığı kaydedin. Daha sonra, kıyılmış dokuyu ATP içeren tampon 1 ile on kat seyreltin. Kas örneğini 9,8 Hertz güç çıkışında 10 saniye boyunca homojenize etmek için sekiz milimetrelik çift bıçaklı homojenizatör kullanın ve görünür kas parçalarının kalmamasını sağlayın.
Numuneyi 9.000x G'de dört santigrat derecede 10 dakika döndürdükten sonra, peletı resüspenzyon ortamının kabaca 95 mikrolitresinde dikkatlice yeniden ıslatın. Üstnatantı atmadan önce numuneyi santrifüjlayın ve peleti bir P-200 pipet kullanarak yaklaşık 180 mikrolitre resüspenzyon ortamı ile hafifçe yeniden biriktirin. İn vitro çeviri için, ithalat deneyinde ve bir çeviri şeridinde kullanılacak mitokondri örneği başına 20 mikrolitre sağlamak için yeterli çeviri reaksiyon karışımı hazırlayın.
Kuluçka reaksiyonunu 30 dakika boyunca 30 santigrat dereceye yerleştirin. Çeviri reaksiyonunun başlamasından 15 dakika sonra, 90 mikrogram mitokondriyi steril 1,5 mililitre tüplere ayırın ve 10 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçka öncesi yapın. Steril 1,5 mililitrelik yeni bir tüp setinde, 75 mikrogram mitokondriyi çeviri reaksiyonunun 18 mikrolitresi ile birleştirin ve tüpü istenen süre boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Çeviri reaksiyonunun kalan hacmini buzda tutun. İthalat reaksiyonunu uygun kuluçka süresinden sonra sonlandırmak için, tüpü buza yerleştirmek için 30 santigrat dereceden çıkarın ve ardından sakkaroz yastığı ile tüpün üzerine dikkatlice ithalat reaksiyonunu aktarın. Örnekleri sakkaroz minderi ile 17.000x G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.
Bir P-1000 pipet kullanarak, peletin rahatsız etmeden üsttant dikkatlice çıkarın. Dış zara ithal etmek için, Reaksiyonu Tom40'a kullanarak gerçekleştirin ve peleti 50 mikrolitre taze hazırlanmış 0,1 molar sodyum karbonat içinde yeniden atın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, numuneyi 14.000x G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.
Daha sonra, örnekleri yazıda açıklandığı gibi SDS-PAGE elektroforezi için hazırlayın. Kalan çeviri reaksiyonunun üç mikrolitresini 37 mikrolitre lizis tamponu ve beş mikrolitre numune boyası ile karıştırarak kontrol çeviri şeridini hazırlayın. Numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın ve mitokondrileri saçmaktan kaçınmak için düşük hızda hafifçe aşağı doğru döndürün.
SDS poliakrilamid jeline numuneler uyguladıktan sonra, jeli% 5 trikloroasetik asit veya TCA'da, sürekli karıştırarak beş dakika boyunca bir duman kaputunda kaynatın. Ardından, jeli çift damıtılmış suya, dakikada 50 dönüşte bir dakika boyunca dönen bir tabağa yerleştirin. Jeli 10 milimolar Tris'te dönen bir tabakta dakikada 50 dönüşte beş dakika yıkayın.
Proteini çökeltmek için, jeli 30 dakika boyunca dönen bir plaka üzerinde kaplayacak kadar tek azı dişi salisitik asit hacminde yıkayın. Jeli susuzmak için, jel kurutucunun gözenekli yatağına büyük bir lekeleme kağıdı ve jelin uygulanacağı alana bir kağıt havlu yaprağı yerleştirin. Daha sonra, 11 santimetreye 9 santimetrelik şişkin kağıt parçası kesin ve kağıdı kağıt havluya yerleştirin.
Jeli kaptan çıkarmak ve jeli ilk parçanın üzerine düz bir şekilde bırakmak için 11 santimetreye 9 santimetrelik ikinci bir kağıt kullanın. Jelin üzerine biraz daha büyük bir plastik parçası yerleştirin, sargının altında kırışıklık veya kabarcık olmamasını sağlayın. Daha sonra jel kurutucunun plastik kapağını sargının üzerine yerleştirin.
Vakumun sesini aç. Plastik kapağın köşesini kaldırarak ve kapağın yeniden mühürlenebilmesini bekleyerek plastik kapağın bir conta oluşturduğundan emin olun. Jel kurutucuyu 90 dakika boyunca çalışacak şekilde kapatın, 30 santigrat dereceden başlayarak kademeli olarak 80 santigrat dereceye ulaşın ve koşunun sonunda 30 santigrat dereceye geri dönün.
Jeli kurutma işleminde kullanılan plastik sargıya sarın. Susuz kaldıktan sonra jel katılaşmalı ve kağıt inceliğinde hissedecektir. Susuz jeli üzerine fosforlu bir film ile bir kasete yerleştirin.
Fosforlu görüntüleme yapabilen uygun bir görüntüleyiçle otoradyografi kullanarak jeli görselleştirmeden önce filmi 24 saat boyunca maruz bırakın. Temsili analiz, subsarkolemal ve intermyofibriller mitokondrilerde malat dehidrogenaz veya MDH için normal ithalat oranlarını ve öncüL MDH'nin çeviri ürününü göstermektedir. Valinomisinin eklenmesi, SS ve IMF mitokondri matrisine MDH protein ithalatını engelledi.
Benzer şekilde, deterjan Triton X, iç zarın çözünmesi nedeniyle her iki alt fraksiyona MDH ithalatını engelledi. Protein ithalatının tahmini artan süreler için gerçekleştirildi ve sonuç olarak ortaya çıkan veriler, ithalatın zamana bağlı bir süreç olduğunu ve SS ve IMF mitokondrilerinin ithalat için farklı oranlara veya kapasitelere sahip olduğunu gösterdi. Sıçanlar elektriksel uyarıma maruz kaldığında, Tom 40'ın dış zara ithalatı, kronik olarak uyarılmış hayvanlardan gelen kaslarda kontrollere kıyasla daha yüksekti.
Ornitin transkarbamylaz veya OCT ithalatı, mitokondriyal matrise her kuluçka noktasında artırıldı ve kronik olarak uyarılan kastan mitokondrilerde 1.4 kat artışa neden oldu. Protein ithalatı mitokondriyal içerik indeksi ile pozitif olarak ilişkiliydi ve COX aktivitesi ile değerlendirildi. Mitokondriyal aracılı kesme dekontozu araştırırken, Bax ve Bak çift nakavt hayvanlar mitokondriyal matrise azaltılmış protein ithalatı sergilediler.
Altı haftalık gönüllü tekerlek çalışması, çift nakavtlı hayvanlardaki ithalat kusurunu kurtardı. İthalat reaksiyonunun süresi ve hangi proteinin ithal edileceğinin gibi değişkenleri göz önünde bulundurmak önemlidir. Sitozolitik fraksiyonlar, sitozolizik faktörlerin ithalat oranını nasıl etkileyebileceğini anlamak için reaksiyona dahil edilebilir.
Alternatif olarak, proteinlerin seçici olarak nasıl ithal edilebileceğini anlamak için inkübasyondan önce proteinler değiştirilebilir. Bu teknik, çeşitli hastalık durumlarında ortaya çıkabilecek mitokondriyal miyopatilerin karmaşık etiyolojilerini anlamaya yardımcı olabilir.
