This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

<ol>
	<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li><li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+morphogenesis:+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo.">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis.">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li><li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502/ROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis.">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li><li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation:+LET-502/ROCK,+MRCK-1+and+PAK-1,+three+kinases+with+different+roles.">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li><li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase,+MEL-11+myosin+phosphatase,+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase.">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li><li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans.">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684 (2014).</li><li>Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods. , 587-606 (1988).</li><li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform,+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains.">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li><li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry.">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li><li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function.">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).</li><li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness.">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li><li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin/IGF-1+signal.">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular &amp; cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li><li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size.">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43 (2014).</li><li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li><li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol erken karakterize etmek roman ölçümleri ve embriyonik uzama geç evreleri açıklar. 1. bölümde, kritik bir adım pad üzerinde bakteri potansiyel varlığıdır. Embriyolar hermetik pad ve görüntü alımı sırasında lamel arasında içine alınır. slayt Sızdırmazlık iki saatten fazla süren edinimi sırasında hayvanların kuruma önlemek için gereklidir. Bildiğimiz kadarıyla, slayt ve lamel arasındaki agaroz pedleri monte etmek için kullanılan sızdırmazlık hiçbiri hava geçirgen bulunmaktadır. bakteriler (ya da embriyo) büyük bir ped üzerinde mevcut olduğunda Sonuç olarak, kendi erken ölüme yol açan, bir kaç saat sonra, oksijen yoksun olabilir. üç kat embriyoların sahip - olmayan uzatılmış embriyoların karşılaştırıldığında uzunluğu 3 kat olan embriyolar tekabül - Potansiyel hipoksik koşullar iyi bir göstergesi olacaktır ilgi embriyoları ile birlikte kaydedilen bu embriyolar thei hareket durur berioksijen yokluğunda R yumurta kabukları. Hiçbir morfolojik ölçümler hipoksik koşullar ya da ölü embriyolar üzerinde yapılmalıdır. time-lapse görüntüleme kullanarak başka kritik bir adım embriyo gelişimi oluştuğu sıcaklıktır. Isı duyarlı mutantlar şu C&#39;de kullanılan elegans. Sıcaklık kayması biyolojik etkisi hızlı olabilir veya proteinin yarılanma ömrü ve onun taşıyan mutasyon doğasına bağlı olarak ertelenebilir. Dolayısıyla, embriyo maruz kaldığı sıcaklık zaman içerisinde sabit olmalı ve mikroskop sahnede mikroskopi oda ya da ısıtma-soğutma bölmesinin uygun bir havalandırma ile kontrol edilmelidir. Bölüm 2 alkali hipoklorit tedavisi ile larvalar senkronizasyonu bağlıdır. Belirli koşullar altında, bu tedavi embriyonik öldürücülüğü (Emb) yol açabilir. Ağırlık popülasyonda% 20&#39;nin üzerinde Emb hipoklorit tedavi sırasında yüksek bir toksisite göstermektedirolumsuz morfolojilerinden etkileyebilir ment. Ağırlık arka yüksek Emb görüntülendiği Senkronize L1 daha fazla analiz için kullanılmamalıdır. Bu kısıtlama, protokol 3 için de geçerlidir. Biz larva hareketsiz anestezik ilaçların kullanımını tavsiye etmiyoruz. Levamisol özellikle deneysel önyargı tanıtan larvaları küçültmek eğilimindedir kas tetani indüksiyonu yoluyla nematod hareketsiz. maruz kalma süresi mikroskop sınırlamaları nedeniyle yeterince hızlı değildir, biz pedde agaroz konsantrasyonu artar ve yastık ve kapak arasında sıvı miktarını azaltarak larva motilitesini azaltan önerilir. Bakım kurutma boyutlarını azaltır, çünkü larva kurutulması için değil, ancak alınmalıdır. 3. bölümde, larvaların uzunluğu ölçümleri analiz numuneleri arasındaki akış oranlarının karşılaştırılması kullanılır. Bunu yapmak için, kontrol parçacıklarının dağılımı iştigal olması gerekirkırmızı. Bu değerler normalize olması gerekmez eğer tam bindirme dağılımları ise, TOF (time-of-flight) örnekleri karşılık gelen elde edilen değerler, mukayese edilebilir. (3.4.5.1 ayrıntıları verildiği gibi) PAK-1 (ok448) (Şekil 3C ve Şekil 5B) için gösterildiği gibi, kontrol parçacıkları-TOF fazla numune TOF normalizasyonu başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. Ağırlıkça vs Pak-1 (ok448) göreceli uzunluğu ve normalizasyonsuz en az 3 bağımsız deneyde benzer olduğu tespit edildi (veriler gösterilmemiştir). küçük boy farklılıkları ile larva karşılaştırarak özellikle Ancak, biz onsuz elde edilenlerle normalleşme elde edilen sonuçların teyit tavsiye ederiz. Akış sitometri kullanılarak larva uzunluğu ölçümleri, larva yerine görüntü analizi gibi mikrometre mutlak uzunluğu ağırlıkça, bu durumda, bir kontrol numunesine uzunluğu göreli sağladığı not edilmelidir. Bu, bağımsız deneyden gelen ölçümler olamaz imaağırlıkça üzerinde boyut oranını hesaplama sürece kombine edilebilir. Örnek kap içinde seyreltme için kullanılan tampon akış oranı üzerinde bir etkiye sahip olacaktır. Biz üretici tarafından önerilen kılıf tampon alımı sırasında oluşan kabarcıkların miktarını artırır deterjanı içerdiği görülmektedir. deterjan içermeyen, M9 tampon kullanarak, önemli ölçüde kabarcık oluşumunu azaltmakla birlikte, numune akış oranına etki sıralayıcı, tübülleri yumurta tıkanması kaçınmak daha az etkili oldu. Yumurta tıkanması kolayca birkaç saniye de yüksek bir TOF- ardından bir kaç saniye için kontrol parçacıkların gözlemlenebilir TOF belirgin bir azalma ile satın alma sırasında tespit edilir. Yumurta takmayı da kanalın tıkanması ve parçacık akışı (saniyede az olduğu 5 nesneler) tam tutuklama yol açabilir. Bu meydana gelirse debi geri gelene kadar, TEMİZ butonuna tıklayınız. Bu olay sırasında meydana gelen her türlü ölçümlersn veri analize dahil edilmelidir. Kılıf tampon ölü yumurtaların yüksek oranlarda ile karakterize suşları içeren deneyler için tavsiye edilebilir. (Aşama 3.2.3 ayarlanır) bir numune ve kılıf basıncı, zamanla (biraz) değişebilir ve çok sabit bir akış hızı sağlamak için deney boyunca elle ayarlanması gerekmektedir. Sonuçları analiz etme ve zaman (Şekil 3C) üzerinde kontrol parçacıkların TOFs komplo yaparken azaltılması veya düşük oranda artış gözlemlenebilir olacak. akış hızı artışı karşısında neden olurken akış hızının azaltılması, zaman içinde parçacıkların ortalama TOFs artmasına neden olur. akış hızının değiştirilmesi olumsuz larva popülasyonları arasındaki küçük boyut farklılıkları tespit yönteminin duyarlılığını etkileyecektir. uzama kontrol genleri tanımlamak için amaçlayan ve zaman atlamalı mikroskopi kayıt gerektiren yöntemleri genellikle yüksekBirkaç genotipleri fenotipleme zaman ly zaman alıcı ve sıkıcı. tüm laboratuvarlar için geçerli değildir ekipman gerektiren iken akış sitometresinde-temelli yaklaşım, daha az zaman alıcı ve birkaç suşları karakterize gerektiğinde dolayısıyla daha verimli. (Mutant ve ağırlık TOF dağılımları karşılaştıran öğrencinin t-testi ile değerlendirildi; Şekil 5A ve B) Bu yöntem görüntü analizi kullanılarak ölçümlere göre de daha istatistiksel sağlamdır. Bu yöntem, daha sonra düşük ekspressivite / penetre uzama kusurları ifade suşlar için oldukça uygun olabilir. Akış sitometri kullanılarak çeşitli yöntemler nematod 9-12 kondisyonunuzu ölçmek için geçmişte geliştirilmiştir. Bu yöntemler, 96 çukurlu bir levha ve sonsuz sıralayıcı &#39;Refleks modülünde tevzi hayvanların kullanımı. Refleks modülü 96 oyuklu plakalar içinde tevzi nematod nüfusun doğrudan analiz edilmesini sağlar. Sonuç olarak, bu yöntemler, karakterize, mümkünbir senkronize olmayan nüfusun uygunluğu ölçmek için sağlam bir şekilde günde koşulları yüzlerce rize ve oluşturmaktadır. Onlar, ancak iyi senkronize L1 arasındaki küçük boyut farklılıkları tanımlamak için uygun değildir. L1 larvalarının arasındaki küçük farklar ölçümü 96 oyuklu plakalar ve verimli bir şekilde göz başına en fazla 100 nesne karakterize edilebilir Refleks modülünün kullanımı ile uyumlu olmayan bir hayvan çok sayıda boyunca ölçümünü gerektirir. Burada tarif edilen yöntem, önemli ölçüde azalır throughput pahasına, bu amaç için tasarlanmıştır. Bu protokolde 2 görüntü analizi kullanılarak üzerinde belirgin bir iyileşme olduğunu alet kalibre saatte bir 3 ila 4 koşulların karakterizasyonu, sağlar. Baş ve kuyruk genişliği oranı ölçümü embriyo 7 anteroposterior ekseni boyunca dengesiz meydana morfojenik süreçleri karakterize etmek geliştirilen ilk yöntemdir. Ne zamanErken uzama kontrol etmek için gösterilen genlere uygulandığı, bu yöntemler bu aşamada morfolojilerinden kontrol sinyal yollarının mekansal dağılımını açıklığa kavuşacaktır. Görüntü analizi ya da erken uzama sonunda embriyo uzunluğunun ölçülmesi ile kombinasyon halinde akış sitometrisi kullanılarak tutuklandı larva uzunluğunun ölçümü yüksek hassasiyet ve kesinlik ile erken veya geç uzama veya her ikisi de kontrol eden genlerin tanımlanmasını sağlayacaktır. Bu prosedürler sonra C. embriyonik uzama kontrol sinyal yollarının zamansal ve mekansal düzenlemenin gelecek anlaşılmasına önemli katkıda bulunabilir elegans. Ayrıca, bu yaklaşımlar aynı zamanda insülin ve TGF-beta gibi vücut uzunluğu kontrol sinyal yolları incelemek için adapte edilebilir çevresel kirleticiler 15, 16 13, 14 ve kronik maruziyet yolları. Bu ölçümler usin farklı larva aşamasında veya yetişkin yapılabilirL1 Protokoller 2 ve 3. Ölçme büyüklüğü farklılıkları g küçük varyasyonlar gibi L3, L4 larva veya yetişkin gibi büyük nesneleri daha solucan sıralayıcı ile daha zordur. Protokol 3 daha sonra kolayca bu ölçümleri yapmak için adapte edilebilir.

Kısa yaşam döngüsü: Yaklaşık 50 yıldır nematod Caenorhabditis elegans gelişimi, nörobiyoloji, evrim, konukçu-patojen etkileşimleri, vb önemli soruları incelemek için güçlü bir model olarak kendini kabul ettirdi 1 gelişme çalışmada bu modelin gücü yatıyor 3 gün; bu hayvanlar genetik olarak değiştirilmiş olabilir hangi ile kolaylığı; Çoğunlukla rahim dışı olduğunu yaşayan hayvanların ve gelişimi, hücre deplasman ve morfolojisi gözlem sağlayan şeffaflığı. nematod gelişim evreleri yetişkinlikte ardından embriyogenezis ve dört larva aşamalarını (L4 L1), içerir. embriyonik gelişim sırasında, epidermal morfogenezisi hücreleri onların kavşak yeniden nasıl bir grup olarak göç nasıl epitel daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve onların bireysel morfolojisi yanı sıra işlevsel epitel içinde göreceli konumunu değiştirmek kabiliyetini önemli ölçüde dikkat çekti.Epidermal morfogenezisi dört evreye ayrılır: dorsal epidermal hücrelerin yeniden organizasyonunda oluşan sırt interkalasyon, hipodermis olarak anılacaktır; böylece epitel hücre tek tabaka embriyo encasing ventral orta hat doğru ventral hipodermal hücrelerinin göç oluşan ventral muhafaza; erken ve geç uzama vermiform larva haline fasulye şeklinde embriyoyu dönüştürme. Aşağıdaki morfogenezi, embriyo kapak ve L1 larvaları kendi yakın çevrede mevcut bakterileri kullanarak beslemeye başlarlar. Embriyonik uzama nedenle embriyonik gelişim geç bir aşamasıdır. Bu uzunlamasına ekseni boyunca embriyo uzatılması ve enine çapa sahip bir azalma oluşur. Bu hipodermal hücre şeklinin dramatik bir değişiklik gerektirir. Uzama, erken ve geç faz ayrılmıştır. Vücut duvarı kasları w 1.75 kat aşamada sözleşme başladığınızda erken evre virgül aşamasında başlar ve biterILD tipi (WT) embriyo - olmayan uzatılmış embriyolar göre uzunluğu 1.75 kat olan embriyolar tekabül etmektedir. Bu aşamada ortaya çıkan morfojenik süreçler esas embriyo 2 anteroposterior ekseni boyunca onların uzama sürücü hipodermal hücrelerinin apikal kutbunda bulunan ipliksi aktin demetleri (FB&#39;ler) kasılmasıyla tarafından tahrik edilmektedir. FBs Daralma üç kinazlar LET-502 / ROCK, MRCK-1 ve PAK-1 5 ile miyozin-hafif zincirlerin fosforilasyon ile kontrol edilmesidir. vücut duvarı kasları işlevsel hale ve taahhüt başlattığınızda uzama geç faz başlar. Bu sırt ve karın hipodermal hücrelere vücut duvarı kasları gelen mechanotransduction sinyalizasyon içerir ve hayvanlar 3 yumurtadan biter. ve L1 larvaları (Larva tutuklama fenotip olarak bu durdurma onların gelişimi; uzama kusurları genellikle embriyolar olarak ölen hayvanların yüzdesi (Emb Embriyonik öldürücü); ile karakterize edilir Lva) ve ağırlık önemli ölçüde daha kısa olması. gelişimsel duraklama evresi tanımlanması ölü embriyo mikroskobik gözlem gerektirir ve Larva 3-6 tutukladı. Son zamanlarda, bu Cdc42 / rac regülatörü ve efektör pix-1 ve Pak-1 gibi birçok gen, erken ve geç uzama 3,7 sırasında hem morfojenik süreçlerini kontrol gösterilmiştir. Biz de son zamanlarda morfojenik süreçler erken uzama 3 7 sırasında embriyoların anteroposterior ekseni boyunca farklı olduğunu gösterdi. Bu bulgular, özellikle erken uzama sırasında ön-arka eksen boyunca embriyoların morfolojik karakterizasyonu sağlayan erken ya da geç uzama aşamalarını ve diğer ölçümleri hedefleyen yeni metrik gelişimini motive etti. Bu yeni yöntemler kendi genişliği yanı sıra başında ve erken uzama sonunda embriyoların uzunluğu ölçülerek ibaret oreklamlar ve kuyrukları. 7 İki protokolleri de L1 aşamada 7&#39;de senkronize yumurtadan yeni çıkmış larvaların uzunluğunu ölçmek için geliştirilmiştir. larva, yetişkin ve kültür ortamı mevcut bakteri tedavisi ile çözülür ise embriyoların yumurta kabukları alkali hipoklorit muameleye karşı korunmaları. Bu işlem daha sonra besili yetişkin 8 çoğunluğunu ihtiva eden bir senkronize olmayan nüfusu embriyolar saflaştırmak için kullanılır. Gıda kısıtlama yeni yumurtadan larva senkronize etmek için kullanılır. Bu larvaların uzunluğunun ölçülmesi sonra uzama kusurları tespit etmek için kullanılır. yumurtadan larva olmayan tam olarak uzatılmış embriyolar beslerken, &quot;normal uzunluğu&quot; olarak geri ancak gıda yokluğunda yakalandıklarında indirgenmiş büyüklüğünü korumak çünkü bu ölçüm kültür levhaları üzerinde tutuklandı larva ölçülmesi tercih edilmektedir. Burada, biz le ölçümünü sağlayan ayrıntılı protokolleri mevcutzaman atlamalı DIC mikroskopi ve görüntü analizi (Protokol 1) kullanılarak embriyolar ve bunların baş genişliği ve kuyruk uzatılması ngth. Biz de görüntü analizi (Protokol 2) ve Flow-Sitometri (Protokol 3) kullanılarak senkronize larva uzunluğunu ölçmek için ayrıntılı protokolleri sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="696">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agar&#160;</td>
			<td style="width:195px;">BioShop</td>
			<td style="width:119px;">AGR001.500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:195px;">Bioshop</td>
			<td style="width:119px;">AGA001.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2 (calcium chloride)</td>
			<td style="width:195px;">Bio Basic Inc.</td>
			<td style="width:119px;">CT1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cleaning solution&#160;</td>
			<td style="width:195px;">union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">300-5072-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass coverslips</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-542B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glass slides</td>
			<td style="width:195px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">high fluorescent control particles</td>
			<td style="width:195px;">union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">310-5071-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic)</td>
			<td style="width:195px;">Bio Basic Inc.</td>
			<td style="width:119px;">PB0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic)</td>
			<td style="width:195px;">Bio Basic Inc.</td>
			<td style="width:119px;">PB0445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgSO4 (magnesium sulfate)</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic)</td>
			<td style="width:195px;">Bio Basic Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SDB0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl (sodium chloride)</td>
			<td style="width:195px;">Bio Basic Inc.</td>
			<td style="width:119px;">DB0483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pebeo Drawing Gum 45ml</td>
			<td style="width:195px;">p&#233;b&#233;o</td>
			<td>PDG033000</td>
			<td>any art/craft store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Peptone</td>
			<td style="width:195px;">BioShop</td>
			<td style="width:119px;">PEP403.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sheath buffer</td>
			<td style="width:195px;">union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">300-5070-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">COPAS Biosort</td>
			<td style="width:195px;">union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel metrics to characterize embryonic elongation of the nematode caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Baş, bagaj ve Baş / Kuyruk genişliği Oranı Sağlam Metrik vardır. Burada anlatılan protokoller başarılı düzenleyiciler ve Rho GTPases pix-1 efektör işlevini, pak-1 karakterize ve let-502 erken uzama 7 sırasında kullanılmıştır. Bir guanin-değişim faktörü pix-1 ve sırasıyla pak-1 kod (GEF) ve RHO&#39;daki-1 7 için bir efektör için Rac / Cdc42 GTPases için özel ve let-502 kodlar bir efektör. Bu çalışmada, PIX-1 ve PAK-1 ilk uzama 7 esnasında epidermal morfojenezi kontrol gösterildi. metrik olarak bu çalışma kullanılan baş ve kuyruk genişliği ölçümü, ilk kez ön emb bulunan bu hipodermal hücrelerini göstermektedirryo kendi posterior 7 bulunan daha farklı morfojenik programlarını takip. Bu ölçümlerin tekrarlanabilirliği ve sağlamlığı kurmak için, baş genişliği 1.2 kat aşamada bağımsız 12 yabani tip (wt) embriyolar üzerinde beş kez ölçüldü. Bir grup için ölçümlerin düşündüren; ölçüm beş farklı gruplar arasında varyansları karşılaştırıldı sonra ölçümlerin arasında anlamlı farklılık (Şekil 4A F testi p değeri&gt; 0.5) ortaya (R istatistik paketi kullanılarak) Brown-Forsythe testi kullanılarak değerlendirildi embriyoların tekrarlanabilir. Bu ölçümler ile bağlantılı tekrarlanabilirlik ve parti etkilerinin değerlendirilmesi üç farklı gün (n = 12 embriyo) üzerinde yapılan 4D-DIC görüntüleme 1.2 kat aşamada ağırlık embriyoların baş genişliğinin ölçümü yoluyla yapıldı. Bu üç ölçüm gruplar arasında, varyans önemli ölçüde farklı değildi ve anlamlı toplu etkisi baş w darbeye bulundulikli ölçüm sonuçları (F-testi p-değeri&gt; 0.5; Şekil 4B). Benzer sonuçlar kuyruk genişlik ölçümleri ve erken uzama farklı aşamalarında yapılan ölçümler için elde edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu veriler erken uzama kusurları karakterize etmek için sağlam metrik olarak baş-genişliği, kuyruk genişliği ve baş / kuyruk genişliği oranını kurdu. Baş ve Kuyruk Genişlik yanı sıra Embriyolar Uzunluğu Ölçme Embriyo ve Antero-posterior ekseni boyunca Erken Uzama Kontrol Genler Karakterizasyonu için izin verir. Embriyoların uzunluğu, hem de baş ve kuyruk genişliğinin ölçümü taşıyan wt ve mutant embriyo üzerinde yapıldı erken uzama kontrol eden gen fonksiyonu allel kaybı güçlü null veya ısıya: pix-1 (gk416);(ok448)-1 pak ve let-502 (sb118ts) 7. Bu kafa / kuyruk (H / T) başlangıçta wt ve mutant embriyoların genişlik oranı (1.2-kat aşamada) ölçüldü ve non-permisif sıcaklıklarda erken uzama sonunda (Şekil 4C sol ve sağ panel) mevcuttur. Erken uzama başında hiçbir tarafındaki değiştirme ya da daha düşük bir H varken / T oranı pak-1, PIX-1 gözlendi ve let-502 mutantlar wt hayvanlarda (1.2 kat aşamada, Şekil 2C, sol panele kıyasla Şekil 4C;; sağ panel)), erken uzama sonunda her üç mutant ağırlık embriyolar önemli ölçüde daha yüksek H / T oranı (t-testi p-değerleri &lt;0.006 gösterdi. Bu pix-1, pak-1 ve let-502 mutant embriyoların erken uzama sonunda anormal ön-arka morfolojisi görüntüler ortaya koymuştur. Daha fazla analiz kafa genişliği karşılaştırma ve kuyruk betwee genişliği1.2 kat sahne ve aynı ölçüm parametreleri kullanarak erken uzama sonu n kafa genişliği daha az, PIX-1 pak-1 azaltılmış ve let-502 mutantlar kuyruk genişliği let-502 mutantlar önemli ölçüde daha az azaltır olduğunu ortaya sadece 7. Pix-1 ve pak-1 kontrol morfojenik süreçler embriyo 7 ön kısmında ağırlıklı olarak meydana gelen ise bu, embriyonun anteroposterior ekseni boyunca benzer olduğunu let-502 kontrol morfojenik süreçleri ortaya çıkardı. Erken uzama (Şekil 4D) başlangıcında karşı ucunda embriyoları arasındaki uzunluk farkı da ölçülmüştür. Bu tek başına önemli ölçüde elongatio azaltmaya yetecek karşılaştırıldığında erken uzama anlamlı pix-1 ve PAK-1 mutant ön morfojenezinin değişikliğin öne ağırlıkça PAK-1, PIX-1 azaltılmış ve izin-502 mutantlan olarak bulunduembriyonun n. Protokol 2 ve 3 wt ve mutant arka tutuklandı larva uzunluğunu belirlemek için kullanıldı. (; Yayınlanmamış veri Protokolü 3), bu larvaların uzunluğu hem görüntü analizi (Protokol 2) 7 ve akış sitometri kullanılarak değerlendirildi. Sağlam ve yüksek tekrarlanabilir bir şekilde (Şekil 5A) içinde mikrometre içinde hayvanların uzunluğunun mutlak ölçümlerde görüntü analiz sonuçlarını kullanarak larva uzunluğunun ölçülmesi. Bu analiz, ağırlıkça (Şekil 5A) ile karşılaştırıldığında senkronize mutant larva görüntüleme önemli ölçüde uzunluğu azalttığını ortaya 7. Akış sitometri tabanlı bir protokol (Protokol 3) ile, bu larvaların ölçümü benzer sonuçlar (Şekil 5B) vermiştir. Bununla birlikte, ikinci bir yaklaşım kullanılarak ölçülmüştür larva sayıda önemli ölçüde genotip karşılaştırması (t istatistiksel sağlamlığını artış olduğuna dikkat edilmelidir -<html> Test p-değerleri &lt;10 -24). Bu bulgulara dayanarak, akım sitometri yaklaşım çok ince uzama kusurları göstererek mutant hayvanlar karakterize etmek amacıyla görüntü analizi üzerinde daha iyi bir seçim olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53712/53712fig1.jpg" /> Agaroz Pad 1. Hazırlık Şekil. Bant. B maskeleme iki kat kapsadığı iki boşluk-slaytlar arasına yerleştirilen A, Mikroskop slayt, agaroz ped iki boşluk-slaytlar tarafından desteklenen başka bir slayt ile kaplıdır. C, ile kestikten sonra son şeklini ve agaroz pad boyutu bir jilet lamel sığdırmak için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53712/53712fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> g2.jpg &quot;/&gt; . Şekil 2. Erken ve Geç Uzama Defektlerde Ölçüm A - B, virgül aşaması (A) bir embriyo uzunluğu ve erken uzama (B) sonunda ölçülmesi. Embriyoların ölçmek için kullanılan kırmızı çizgi, (solda) 1.2 kat aşamada ve erken uzama (sağda) sonunda embriyolar ölçülür ImageJ. C, Baş ve kuyruk genişliği segmentli satırı aracını kullanarak çekildi. Oklar ölçülen alanların lokalizasyonu temsil (Martin ve ark modifiye., 2014). Ölçü bar:. 20 um D, larva uzunluğu senkronize L1-larvaları için ölçülür. Sağ panel yakalanan görüntü (sol) büyütülmüş bir görünüşüdür. kırmızı çizgi ImageJ segmentli satırı aracını kullanarak çekildi. Larva uzunluğunu ölçmek için kullanılır. Ölçek çubuğu:. 100 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53712/53712fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Akış sitometri. A, Ayırıcı ve Green ve kontrol parçacıkların Kırmızı emisyonu gösteren COPAS Biosort sıralama penceresini kullanarak Senkronize Larva uzunluğu Şekil 3. Ölçme, (ölü ve Time-Of-Flight göre yaşayan hayvanlar, TOF kabarcıklar ). B, Örnek deney için farklı zaman noktalarında kontrol parçacıklarının TOF. Zamana karşı TOF doğrusal fonksiyonu eğim kontrolü parçacıklarının TOF deney boyunca zaman içinde sabit olduğunu gösteren, yaklaşık 10 -5 olan.: C, dağılımların maksimal değerinin bir yüzdesi olarak ifade edilen, kontrol partikül TOFs dağılımı. Sigara normalize ve normalize kontrol parçacık dağılımları için temsil edilir pak-1 (ok448). Diğer dağıtımlar normalize değildir. D yaşam için TOFs dağıtımıHayvanlar dağılımların maksimal değerinin bir yüzdesi olarak ifade edilmiştir. TOFs belirtildiği gibi pak-1 (ok448) hariç, kontrol parçacıkları üzerinde normalize değildir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53712/53712fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53712/53712fig4.jpg" /> Şekil 4. Pix-1, Pak-1 ve Let-502 Mutantlar Günümüze Erken Uzama Kusur. A - B, baş Tekrarlanabilirlik ve sağlamlığı değerlendirme ölçümleri genişliği A, 1.2 kat aşamada (n = 12 embriyolar) de ağırlık embriyolar için kafa genişliği beş bağımsız ölçümleri.. Ortalamalar ve standart sapmalar (hata çubukları) gösterilir. ölçümler arasında anlamlı olmayan (ns) farklar Brown-Forsythe testi kullanılarak hesaplandı (biziing R istatistik paketi) (F-testi p değeri&gt; 0.5). B, üç farklı günde (n = 12 embriyolar wt embriyolar Baş genişliği ölçümü). Ortalamalar ve standart sapmalar da belirtilmiştir; Ölçümler arasında Varyans anlamlı bir fark yoktu (ns; Brown-Forsythe F-testi p değeri&gt; 0.5) C, kafa / kuyruk genişlik oranı dağılımı erken sonunda 1.2 kat aşamada (sol panel), en. ağırlıkça uzama (sağ panel), pIX-1 (gk416), Pak-1 (ok448) ve 23 ° C&#39;de izin-502 (sb118ts) mutantlar - 24 ° C. Arasındaki bu çalışma için kullanılan let-502ts embriyoların anne 25.5 ° C. D, ağırlık olarak uzama, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) Dağıtım büyütüldü unutmayın ve let-502 (sb118ts) mutantlar virgül sahne ve geç uzama başlangıç. Kutu araziler min, max, 25 inci, 50 inci (ortanca) ve 75 temsilnüfusun inci yüzdelik. * T-testi p-değeri &lt;0.05, ** t-testi p-değeri &lt;0.006 (Martin ve ark modifiye., 2014). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53712/53712fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53712/53712fig5.jpg" /> Şekil 5. Pix-1 (gk416), Pak-1 (ok448) ve L et-502 (sb118ts) Larva Mevcut Uzunluk Kusurları. Ağırlıkça ölçülen larvaların A, Uzunluk, pix-1 (gk416), pak-1 (ok448) ve let-502 (sb118ts) hayvanlar görüntü analizi (Protokol 2). B, akış Sitometreyi kullanılarak ölçülen Bağıl larva uzunluğu (kullanılarak ölçülen protokol 3). Parantez içindeki sayılar th için kullanılan hayvanların sayısına tekabüle ölçümleri. uzunlukları ve ortalama standart hata araçları (SEM; hata çubukları) temsil edilir. P değerleri -test Student t. (P) gösterilir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53712/53712fig5large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

novel-metrics-to-characterize-embryonic-elongation-nematode

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

6.0K Görüntüleme.  Université du Québec à Montréal. Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo. 

Video: Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Nörobilim

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

Bir<em&gt; Caenorhabditis elegans</emAmylopathy Çalışmaları&gt; Model Sistemi

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Antipsikotik İlaçların Etki Mekanizmaları incelenmesi için Yöntemleri<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Locomotion Speed ​​Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).

Dinamik Kantitatif Duyusal Test Merkezi Ağrı İşleme karakterize etmek

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

bir<emCaenorhabditis elegans</emBeslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyi

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Caenorhabditis elegans'ta Dendritik Dikenleri Görüntüleme

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...