Bu çalışmanın genel amacı, Ortak Kültürlerde M1 Makrofajlar 4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik aktivitenin Hızlandırılmış 2D Görüntülemesini elde etmektir. Yaşam hücreleri eş-kültürler modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskopisi kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Makrofajlar tarafından fagositoz aktivitesinin değerlendirilmesi görüntü vardı;görüntüleme yazılımı kullanarak çok noktalı zaman atlamalı video iki katına, bizim kuluçka test önce.
Makrofajların davranışında ve kanser hücreleri ile fagositik aktivitesinde honlamanın ihtiyaçlarını ve faydalarını karşılamak için yaptığımız konu. Çalışmada özellikle fare meme karsinomu. Bu çalışmanın ilk bölümü 4T1 fare meme karsinom hücreleri ve RAW 2647 fare makrofajlarının canlı hücreler eş kültür modeli ile başlar.
Deneye 41 fare meme karsinom hücresi ve RAW 2647 fare makrofajlarını ekleyerek başlayın. İlk olarak, 4T1 ve RAW 2647 hücrelerinden oluşan bir şişeyi eritin. Çözülmüş hücreleri 15 milyon konik tüpte 10 milimetre içinde seyreltin.
Daha sonra, hücre pelet elde etmek için 5 dakika boyunca 660 g kuvvet hücreleri santrifüj. Dikkatle medya aspirate, tam medya 8 milyon hücreleri yeniden askıya ve doku kültürü şişesi içine hücreleri aktarın. Hücreleri yüzde 5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Yapışkan koşullar altında kültür bir hafta sonra, gerektiğinde atmil tam medya ile şişe günlük ve ek izlemek. Bir sonraki adım M1 polarize RAW 2647 makrofajların immünboyama ile devam edin. Bu adım, M1 makrofajlarının tam bir polarizasyonunu sağlamaktır.
RAW 2647'nin birleşimi yüzde 70-80'e ulaştığında kültür medyasını atın ve PBS ile iki kez hafifçe durulayın. Makrofajları, bir hücre kazıyıcı kullanarak yapışık hücreleri yavaşça yerinden çıkararak toplayıp 50 milyon luk konik bir tüpe aktarın. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve oturma yoğunluğuna kalan çözeltiyi ekleyerek çanak başına 100,000 hücre lik bir yoğunlukta askıya alınmış bir hücre hazırlayın.
İki görüntüleme yemeği içine makrofajsüspansiyon 2 değirmen oturun. Hücreleri 2-3 saat 37 santigrat derecede yüzde 5 karbondioksit ile hücre yapışmasını sağlamak için kuluçka. M1 polarizasyon ortamını, yüzde 10 FBS ile tamamlanan tam bir ortama değirmen lps başına 100 nilligram ve değirmen interferon-gama başına 20 nilligram ekleyerek hazırlayın.
Daha önce kuluçkaya yatan makrofajlardan süpernatant kültürleri atın ve PBS kullanarak çanaktaki monokatmanları iki kez dikkatlice yıkayın. Eşleşen yemeklerden birine 2 milyon M1 polarizasyon ortamı ekleyin ve dura hücrelerinin M1 makrofajlar finnatype içine girmesini bekleyin. İmmünoboyamadan önce RAW ve M1 makrofaj hücrelerini 2 milyon 4 yüzde paraformaldehit kullanarak düzeltin ve oda sıcaklığında 50 dakika kuluçkaya yatırın.
Supernatant çıkarın ve pbs kullanarak hücreleri monolayer yıkayın, en az üç kez. PBS'de 50 milimetrelik amonyum klorür 2 değirmen ile söndürün ve oda sıcaklığında 50 dakika kuluçkaya yatın. Oda sıcaklığında 50 dakika PBS'de yüzde 0,3 Triton X-100 kullanarak permeabilize.
PBS oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzde 10 FBS kullanarak adım engelleme. Anti-iNOS antikor ile inkübün PBS FITC ve 4 santigrat derece gecede yüzde FBS konjuge. Alüminyum folyo ile kaplayarak koyu durumda 37 santigrat derece 10 dakika boyunca görüntüleme yemekleri içine DAPI 1 değirmen kuluçka.
PBS kullanarak hücreleri en az 3 kez yıkayın ve eşleşen yemekler içine 1 milyon DMEM ekleyin ve floresan görüntüleme için hazır. Bir sonraki adım 4T1 fare meme karsinom hücrelerinin tohumlama ile devam edin. 4T1 hücrelerinin birleşmesi yüzde 70-80'e ulaştığında kültür ortamını atın ve PBS ile iki kez durulanın.
Hücreleri ilişkilendirmek ve 37 santigrat derecede 20 dakikakuluçkaya kadar kuluçkaya yatmak için önceden ısıtılmış tripsin 1 değirmen ekleyin. Hücreler bağlı olarak çıktıktan sonra, bağlı olmayan hücreleri 15 milyon luk konik bir tüpe aktarın. Ve görülen tüp inaktive etmek için önceden ısıtılmış tam orta 2 değirmen ekleyin.
Bir hücre pelet elde etmek için 5 dakika için 600 g kuvvetinde santrifüj. 10 değirmen prerun örnekleme DMEM orta supernatant ve yeniden askıya pelet çıkarın. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 100,000 hücreyi değirmen DMEM'e dönüştürün.
Tc tedavi ile görüntüleme içine. Bir sonraki adım CFSE boyama kullanarak yaşayan 4T1 fare meme karsinom hücreleri etiketleme olduğunu. İlk olarak, daha önce 4T1 hücreleri ile tohumlu görüntüleme çanak varolan medya kaldırın.
CFSE boyama çözeltisini 1 milyon PBS'de seyrelterek CFSE boyama çözeltisini hazırlayın ve 5 macrmal dışarı çalışma izni alın. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika veya karanlıkta 37 santigrat derece kuluçkaya yatırmak için görüntüleme kabına 1 değirmen CFSE boyama solüsyonu ekleyin. Hücrelere eşit DMEM artı boyama çözeltisi ekleyin ve 5 dakika tohum izin verin.
Bir sonraki adım 4T1 ile RAW2647 fare makrofajları ve ortak kültür tohum etmektir. 4T1 hücrelerinin CFSE tesviye sonra, PBS kullanarak, iki kez görüntüleme çanak yıkayın. 4T1 görüntüleme çanak içine makrofajlar süspansiyon Tohum 2 değirmen.
Bir sonraki adım, RAW 4627 makrofajlarını M1 finnatype'a polarize etmektir. Imagine dish içine 2 milyon M1 polarizasyon ortamı ekleyin ve RAW hücrelerinin M1 makrofaj finnatype içine girmesini bekleyin. Çalışmanın ikinci bölümü, 4T1 hücrelerinin fagosilenmiş M1 makrofajlarının zaman atlamalı değerlendirmesidir.
Bir sonraki adım canlı hücre li skopi mikroskopisfitoz değerlendirmesini içerir. Önce mikroskobu aç. Sıcaklığı 37 derecede ayarlayın.
Ve yüzde 5 karbondioksit gazı. Ortak kültür hücrelerini sahnenin ortasına yerleştirin ve üst hazneyi hafifçe vidalayın. Yakalanacak farklı bir konum seçerek sahne motorize joystick kullanın.
Canlı hücre görüntüleme yaparken göz önünde bulundurulması gereken birçok faktör vardır. Oldukça küçük bir video elde etmek için. Görüntüleme maruziyetinin optimizasyonu, zaman ölçümü ve aynı zamanda odak düzeltmesinin otomatikleştirilmesini gerektirir.
Videonun aşırı açıkta kalması durumunda, yanlış zaman aralığı ve ayrıca odak dışında, videonun kullanılamaz hale gelir. Bu faktörlerden biri tespit edilirse denemenin tekrarı yapılmalıdır. Şekil bir immünoresans yeşil anti-iNOS ile dönüm gösterir.
Mavi nükleer marker DAPI. Ve çoğu görüntünün geliştirilmiş sürümleri. Film 1, M1 makrofajlarını ve 4T1'i anlayan temsili bir canlı hücre filmidir.
CFSE floresan ve IC mikroskopi çok kanallı edinimi kullanılarak yakalanan çoğu meme karsinom hücreleri eşlenmiş. Film 2 canlı hücre video mikroskopi filmler tek bir evlilik çanak multi-point. İndüklenen M1 makrofajları ile 4T1 fagositozunun gösterilmesi.
Görüntüler 13 saat boyunca 50 dakikalık aralıklarla kaydedildi. Film 3 canlı hücreli video mikroskobu film, tek bir koordinat noktası M1 Makrofajlar tarafından 4T1 fagosittoz derinlemesine görselleştirme göstermek için seçilen. Kırmızı oklar M1 makrofajlar gösterir, sarı daire gösterir 4T1 hücreleri bir dizi 4T1 hücreleri fluorene ve goffman söndürmek.
Gözenekli toplazma olarak tanımladığı M1 makrofajlar 4T1 fare bellek karsinomlarının epitel morfolojisi vardır. Makrofajlar hücre-hücre teması kurmak için 4T1 hücreleri eklemek için hareket görülebilir. Daha sonra M1 makrofajlar başına 4T1 hücrelerinin alımı takip eder.
Bu videoyu izledikten sonra canlı hücreli video mikroskobu deneyi;4T1 fare meme karsinomu ve RAW 2647 merad makrofajları ile nasıl yapılacağını iyi anlamalısınız. Ayrıca fagositöz kompozisyon gerçekleştirmek için her iki hücre türünün gece co-kültürleri üzerinde kurmak gerekir. Ayrıca nasıl LPS ve interferon-gama makrofajlar ile 4T1 eş-kültuers anlamak gerekir.
