우리는 최대한의 효율과 수율에 대한 프로토콜을 최적화 도움이 로스 랩의 사전 구성원을 인정하고 싶습니다.

인플루엔자 H3N2 VLP의 생성 1.​​ 포유 동물 발현 시스템 <ol><li> 이러한 서브 클론 전술 pTR600 진핵 발현 벡터 내로 구조적 바이러스 당 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA), 뉴 라미니다 제 (NA), 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 개그 P55. 7 </li><li> 화학적 능력 대장균 (예 DH5α)에서 DNA를 증폭하고 제조자의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 형질 급 플라스미드를 분리. DNA의 양 수율 및 사용자의 필요에 따라 달라집니다. </li><li> 가습 인큐베이터에서 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 성장 배지에서 포유 동물 세포주 293T를 유지한다. </li><li> 은 T-150 조직 배양 플라스크 플라스크 다음 하루 전체 세포 부착 및 85-95% 세포 포화 상태를 취득하도록 플라스크 당 45-75 × 10 6 세포를 포함하도록 세포를 성장. 원하는 conflu에 대한 현미경으로 세포를 검사ency. 참고 : 높은 세포 밀도는 전형적 그러나 과도한 컨 플루 세포 부산물 폐기물의 축적의 결과 및 세포 생존을 감소 상업적 형질 전환 시약을 사용하는 경우 최소한의 세포 독성을 최적 단백질 발현을 생성 할 것을 권장한다. </li><li> NA : 1 : HA의 두 형질의 날 (1)의 DNA 조성물 DNA 세포를 제조자의 권장 사항에 따라 리포솜과 DNA 혼합물을 제조 및 형질 개그 T-150 플라스크 당 40 μg의 총 DNA 양으로. 각각의 플라스크를 20 내지 30 ml의 총 부피가 포함되도록 항생제없이 무 혈청 배지에서 형질 전환 DNA와 리포좀 용액을 희석. 참고 : 유전자 구조의 비율은 사용자 최적화가 필요할 수 있습니다. : 1 비율 여기서 증명되지 않았지만, 유사한 형질 전환 절차는 1에서 호흡기 합 포체 바이러스 (RSV) F 및 HIV 개그 수행되었다. DENV 및 CHIKV 하나의 발현 플라스미드, T-150 플라스크 당 DNA의 20 μg의 총 최적의 전자에 사용되는xpression. DNA : 형질 전환 시약 비율은 사용자에 최적화되어 있습니다. 사용은 형질 전환 방법에 기초하여 형질 매체 추천 즉, 다가 양이온 지질 형질 따라서 미디어 성장 호르몬 보충 될 수 감소 또는 소 태아 혈청의 부재를 추천 및 혈청의 부재하에 성장을 지원하기 위해 미량 원소. </li><li> 5 % CO 2 배양기에 37 ° C로 플라스크를 돌려줍니다. 200 ML의 볼륨의 경우, 9 T-150 플라스크를 사용합니다. 세포는 VLP 수확의 날까지 형질 전환 배양 배지에서 유지됩니다. </li><li> 72-96 시간 포스트 형질이 항원에 따라, 또는 현미경 검사를 통해서 추정으로 세포 생존율이 70 ~ 80 %로 감소 할 때 후 세포에서 수확 배양 상청. 전송 50 ML 원뿔 튜브에 뜨는 및 세포 파편 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 500 × g에서 세포를 스핀 다운. 참고 : yiel 것이다 부착 세포에 신선한 사전 예열, 무 혈청 형질 미디어 3 일 뜨는 교체와 비슷하거나 약간 감소 수율 VLP를의 다 두 번째 많은 사용자가 최적화되어야한다. </li><li> 초 원심 분리를 통해 침전 전에 0.22 μm의 기공 멤브레인을 통해 풀 뜨는 및 필터. </li><li> 0.8 % 칠면조 또는 포유류의 적혈구를 사용하여 표준 혈구 응집 분석 (14)에 의해 HA-표현 VLP를의 혈구 응집 활성을 테스트 또는 항원 특이 적 ELISA를 진행합니다. 대표적인 결과 그림 2를 참조하십시오. </li></ol> 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템을 사용하여 2 CHIK의 VLP 식 <ol><li> 상업적 배큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 S-27 균주 chikungunya 바이러스 캡시드 및 외피 단백질 (C-E3-E2-6K-E1)를 발현하는 재조합 배큘로 바이러스를 생성한다. </li><li> 28 ° C에서 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 혈청 인 Sf9 성장 배지에서 배양 스포 도프 테라 프 루기 페르 Sf9 세포. suspens에 대한 스피너 플라스크 배양을 시작하는 데 3 ~ 5 × 10 5 C / ㎖를 사용하여이온 세포 증식. 통로 일상적 이들은 2-4 × 106 C / ㎖ (3-4 일마다)의 세포 밀도에 도달했을 때. </li><li> 지점 교반기 플레이트 시스템에서 130 rpm으로 교반와 스피너 플라스크에서 서스펜션 문화 인 Sf9 세포. 적절한 통기를 들어, 스피너 플라스크없이 절반 이상 볼륨에서 문화 볼륨을 유지한다. </li><li> CHIK VLP를 발현를 들어, 1의 복수개 감염으로 재조합 바쿠 바이러스로 2 × 106 세포 / ml의 밀도로 Sf9 세포를 감염 28 ° C의 배양기로 복귀. 통상적으로, 250 ㎖의 Sf9 세포를 함유하는 하나 또는 두 개의 스피너 플라스크, 감염. 참고 : 우리는이 방법을 사용하지 않지만, Sf9 세포가 통 플랫폼을 사용하여 28 ℃에서 진탕 플라스크에서 배양 할 수있다. </li><li> 세포 생존율이 70~80%로 감소되었을 때 수확 문화는 72-96 시간 게시물 감염 후 또는 제조사의 프로토콜에 따라 트리 판 블루 배제에 의해 결정. 참고 : 세포가 감염된 상태에서 증식을 계속하고있다삼일 후 감염 수 (dpi)에 재조합 CHIK VLP의 배큘로 바이러스에 감염된 인 Sf9 문화의 ~ 80 %의 생존. 배큘로 바이러스에 감염된 세포는 모양이 크다. 형태는 직사각형에 둥근에서 변경 될 수 있습니다. 바큘로 바이러스 감염의 후기 단계에서, 세포를 용해시키기 시작했다. </li><li> 직접 현탁 배양에서 50 ML 원뿔 튜브에 넣고 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운 전송 문화. </li><li> 상층 액을 수집하고 초 원심 분리를 통해 침전하기 전에 0.22 μm의 기공 막을 통해 필터링합니다. </li></ol> VLP / SVPs 3. 침전 / 정제 <ol><li> 바이오 안전성 후드 70 % 에탄올로 25mm X 89mm 열린 정상 초원 심 분리기 튜브를 소독. 에탄올을 사용하기 전에 오프 마른 확인합니다. </li><li> 깨끗한 튜브에 뜨는 32 ml의 최대로드합니다. 25 ㎖의 최소한의 볼륨이 붕괴하고 부적절하게 작성 초원 심 분리기 튜브의 손상을 방지하는 것이 좋습니다. </li><li> 조심스럽게 상층 액 재치를 밑받침PBS의 시간 멸균 3 ㎖의 20 % 글리세롤 (v / v)로. 확인 튜브가 균형을 확인합니다. </li><li> 4 ° C에서 4 시간 동안 135,000 XG에 스핀. </li><li> 대기음 뜨는은 펠렛을 보장하는 것은 관에서 꺼 내려하지 않습니다. </li><li> 재현 탁 적극적로 pipetting 아래로 멸균 PBS로 튜브의 하단에 VLP를을 침전. PBS의 양은 VLP를가 VLP 총 단백질 수율 및 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다 재현 탁 할 필요가 있었다. 통상적으로, 적어도 100 ㎕를 각각 VLP 펠렛을 재현 탁. </li><li> 샘플을 저장 장기 저장 단기 저장 및 -80 ° C에 보관 4 ° C. </li></ol> 4. 단백질 수율 및 특이 항원 (PSA)의 금리 결정 <ol><li> 같은 제조사의 프로토콜에 따라, BCA 분석과 같은 상업용 단백질 정량 방법을 사용하여 총 단백질 함량을 측정. </li><li> 특정 항원 함량을 평가하기 위해, 표준 항원 2-5의 희석액을 직접 도포하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행1; ELISA 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 총 단백질 시료의 g. <ol><li> 플레이트의 항원의 존재를 조사하고 마이크로 플레이트 리더 검출 흡광도를 생성하기 위해 종래의 ELISA 개발 기판을 사용하여 항원 - 특이 적 항체에 따른다. VLP를 HA가 발현 샘플에 대한 HA 및 ELISA 분석의 대표적인 결과는 그림 2를 참조하십시오; HA와 NA의 많은 조합이 가능하지만 수익률은 HA-NA 호환성 (15)에 따라 다를 수 있습니다. 참고 : 항원 특이 항체는 변수 친 화성을 가지고 있고 항체의 엔드 포인트 희석 적정는 VLP 정량을 수행하기 전에 결정하는 것이 좋습니다. 상업적인 항체를 ELISA에 사용하기 위해 제안 된 농도 또는 희석 범위뿐만 아니라 제안 된 프로토콜을 가질 것이다. </li></ol></li></ol>

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우리는 성공적으로 SVPs 다양한 병원균에 대해 여러 구조 단백질로 구성 VLP를 표현하고 정화 위에서 설명한 기술을 사용했다. 일반적으로, 우리는 VLPs를 생성하는 포유류 발현 시스템을 사용한다. 그러나, 우리의 손에, 포유 동물 세포는 CHIK의 VLP 수익률이 낮았다 산출했다. 재조합 배큘로 바이러스 곤충 세포 시스템을 사용하는 경우 CHIK VLP의 수율은보다 강력했다. 일반적으로, 배큘로 바이러스 곤...

바이러스 유사 입자 (VLP를)은 인간의 예방 접종에 대한 승인 된 기술입니다. 실제로, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 및 간염 Β 포함한 더 현대적 허가 백신의 일부 (HepΒ) 백신이 방법을 사용한다. VLP를이 자기 ​​조립이 가능한 구조 단백질로부터 형성된다. 조립 된 입자는 바이러스 모폴로지을 모방하지만, 감염 또는 바이러스 성 게놈이 부족하기 때문에 복제 할 수 없습니다. VLP를가 표현 원핵 생물과 진핵 생물 시스템의 수와 정제 할 수있다. - 28 %, 효모 - 20 %, 식물 - 9 %, 곤충 - 28 %, 그리고 포유류 - 15 % 1 박테리아 : 문헌의 검토는 서로 다른 발현 시스템은 다음과 같은 비율로 사용되는 것으로 나타났습니다. 참고로, L1 캡시드 단백질을 기반으로 HPV 백신은 효모 (가다실) 또는 곤충 전지 시스템 (서바릭스)이 생산됩니다. HepΒ 백신, 및 Recombivax Engerix-Β 또한 효모에서 생산 한 HepΒ 표면 항원 (3)로 구성되는4. 우리는 여러 조립 구조 단백질의 공동 발현을 요구하는 VLPs를 생성하는 포유 동물 및 곤충 세포 발현 시스템을 사용한다. 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 뎅기열 바이러스 (DENV), 및 chikungunya 바이러스 (CHIKV) : 우리의 작업은 인간의 병원균에 대한 설계, 생산 및 정화 VLP 기반 백신에 초점을 맞추고 있습니다. 우리의 방법은 다수의 발현 플라스미드의 다중 구조 단백질의 공동 발현 또는 단일 발현 플라스미드 (도 1)을 허용 할 정도로 유연하다. 이전에는 제조 및 정제 H5N1 VLPs를 인간 배아 신장 293T 세포 5,6-에서 인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (HA), 뉴 라미니다 제 (NA), 매트릭스 (M1)을 코딩하는 플라스미드의 공동 발현 조립. 유전자는 포유 동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화 pTR600, transc을 개시 사이토 메갈로 바이러스의 즉시 초기 프로모터 플러스 인트론을 포함하는 진핵 세포 발현 벡터에 클로닝진핵 삽입의 ription 및 전사 (7)의 종료에 대한 소 성장 호르몬 폴리아 데 닐화 신호. HA, NA (도 1A) 및 다른 바이러스의 매트릭스 단백질, HIV 개그 P55,의 3 플라스미드의 공동 발현을 사용하여 유사한 접근 방식이 연구에서 인간 계절 인플루엔자 아형 H3N2 VLPs를 생성을 위해 사용하고, 생성하는 것으로 나타났다 인플루엔자 입자 (8)과 비슷한 크기의 VLP를. 인플루엔자 백신은 주로 항 HA 항체를 유도하지만, 인플루엔자 뉴 라미니다 제를 첨가하는 형질 세포 (9)와 같은 본 추가 면역 원성 표적에서 신진 VLP 있도록 시알 리다 아제 활성을 매개한다. RSV VLP를 생산하기 위해, 우리는 또한 이전에 기술과 전자 현미경 6,10 특징으로 추가, HIV 개그를 사용하여 VLP 형성의 유연성을 보여주기 위해 독점적 RSV 표면 당 단백질을 제시 원형 백신을 설계하는 HIV 개그의 관련이없는 코어를 선택했다. 기타이전 즉 RSV 당 단백질 뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV) (11), 및 인플루엔자 매트릭스 (12)로부터 각종 바이러스 요소를 사용하여 조립 될 수 제시 VLPs를 보여 주었다. 전체 길이 표면 당 단백질 서열은 효소 면역 분석법 (ELISA)을 통해 기능성 수용체 결합 및 항체 인식의 분석에 대한 필요가있을 수있다 천연 배좌를 유지 본 연구에 이용 하였다. 입자를 생성하는 하나의 플라스미드 발현 시스템의 사용에 대한 우리의 예는 DENV 및 CHIKV 있습니다. DENV의 경우에, 우리는 PRM / E 구조 유전자 발현 카세트 (13)를 함유 한 플라스미드를 293T 세포 없음 캡시드와 서브 바이러스 레 입자 (SVPs)를 생산할 수있다. 용어 SVP가 바이러스 구조 단백질의 조립에서 코어 또는 캡시드 단백질의 부재를 나타 내기 위해 사용된다. CHIK VLP를도 CHIKV 구조 유전자 카세트 부호화 캡시드 및 외피 단백질을 함유 한 플라스미드를 사용하여 제조 될 수 있고, 또는 I의재조합 배큘로 바이러스 곤충 세포 발현 (- C도 1b)을 위해 최적화 동일한 구조 유전자 카세트를 인코딩 감염시켜 세포 nsect. 상술 된 접근법 식의 최종 결과는 20 % 글리세롤 쿠션을 초 원심 분리를 통해 정제 할 수있는 세포 배양 배지에 VLP를 릴리스한다. 이 보고서에서 우리는 표현과 포유 동물 및 곤충 세포 시스템에서 이러한 VLP를 정화하는 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Cimarec I 6 multipoint stirrer plate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Polyclear ultracentrifuge tubes</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size</td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate citrate buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-phenylenediamine dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m vacuum filter top (500 ml)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>339741&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

expression and purification of virus-like particles for vaccination

바이러스 유사 입자 (VLP를) 및 서브 바이러스 레 입자 (SVPs)은 살아있는 병원체의 사용을 통해 증대 바이오 안정성의 이점을 제공하는 바이러스 백신 디자인에 대한 대체 방법이다. 비 감염성 및자가 조립 VLPs를 살아있는 병원체 또는 항원 전달을위한 재조합 바이러스 벡터의 필요성을 우회 면역원으로 구조 단백질을 제공하는 데 사용된다. 이 글에서, 우리는 전임상 동물 실험에서 미래의 애플리케이션을위한 VLP 설계 및 개발의 여러 단계를 보여줍니다. 절차는 다음 단계를 포함 항원 투여에 대한 항원의 선택, 선택의 세포주, VLP를 / SVPs의 정제 항원의 발현 및 정량화. 우리는 우리의 항원의 발현 모두 포유 동물 및 곤충 세포 라인의 사용을 설명하고 방법은 수율이 다른 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 병원체의 종류에 적용 할 수있는 면역 원성 항원 STR로 대체함으로써 달성 될 수있다관심 사용자 미생물 uctural 단백질. VLP를하고 SVPs는 항원의 특성과 최고의 백신 후보의 선택에 도움이됩니다.

VLP 수익률은 바이러스 항원 구조 설계에 의한 변수했다. 이 프로토콜에서는, 우리는 초 원심 분리하여 상층 액의 SVP 또는 VLP를 생산 및 정제를위한 곤충과 포유 동물 세포의 사용을 증명하고있다. DENV PRM / E 구조 유전자 발현 카세트의 네 아형 표 1 (1-4으로 경계가) DENV SVPs의 버전을 구성하고 0.6 ml의 양으로 총 단백질 mg을 1.1-2.6의 범위를 보여주기 위해 사용되?...

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Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

expression-and-purification-of-virus-like-particles-for-vaccination

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JoVE Journal

Biology

21.8K 조회수.  University of Georgia.  여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다. 

비디오: Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

연구

면역학 및 감염병학

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

Allantoic Fluid로부터의 고역가 재조합 뉴캐슬병 바이러스의 생산

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

암 연구학

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

생체공학

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane vesicles (OMVs) are mainly secreted by gram-negative bacteria during average growth, with a nano-sized diameter and self-adjuvant activity, which may be ideal for vaccine delivery. OMVs have functioned as a multifaceted delivery system for proteins, nucleic acids, and small molecules. To take full advantage of the biological characteristics of OMVs, bioengineered Escherichia coli-derived&#160;OMVs were utilized as a carrier and SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) as an antigen to construct a &#34;Plug-and-Display&#34; vaccine platform. The SpyCatcher (SC) and SpyTag (ST) domains in Streptococcus pyogenes were applied to conjugate OMVs and RBD. The Cytolysin A (ClyA) gene was translated with the SC gene as a fusion protein after plasmid transfection, leaving a reactive site on the surface of the OMVs. After mixing RBD-ST in a conventional buffer system overnight, covalent binding was formed between the OMVs and RBD. Thus, a multivalent-displaying OMV vaccine was achieved. By replacing with diverse antigens, the OMVs vaccine platform can efficiently display a variety of heterogeneous antigens, thereby potentially rapidly preventing infectious disease epidemics. This protocol describes a precise method for constructing the OMV vaccine platform, including production, purification, bioconjugation, and characterization.

The present protocol describes the bioengineering of outer membrane vesicles to be a "Plug-and-Display" vaccine platform, including production, purification, bioconjugation, and characterization.

SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인을 표시하는 외막 소포를 기반으로 하는 "플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle (VLP)-Based Vaccines Using a Capture Assay

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate antigen-displaying VLPs. Surface antigen-specific antibodies are coupled to, and thus immobilized on a solid and insoluble matrix such as beads. Due to their high affinity to the target antigen, these antibodies can capture VLPs decorated with the cognate antigen anchored in the membrane envelope of the VLPs. This protocol describes the binding of antigen-specific antibodies to protein A- or G-conjugated magnetic beads. In our study, human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs formed by the group-specific antigen (Gag) viral core precursor protein p55 Gag and displaying the envelope glycoproteins (Env) of HIV are examined. The VLPs are captured utilizing broadly neutralizing antibodies (bNAbs) directed against neutralization-sensitive epitopes in Env. The VLP capture assay outlined here represents a sensitive and easy-to-perform method to demonstrate that (i) the VLPs are decorated with the respective target antigen, (ii) the surface antigen retained its structural integrity as demonstrated by the epitope-specific binding of bNAbs used in the assay and (iii) the structural integrity of the VLPs revealed by the detection of Gag proteins in a subsequent Western blot-analysis. Consequently, the utilization of bNAbs for immunoprecipitation facilitates a prediction of whether VLP vaccines will be able to elicit a neutralizing B cell response in vaccinated humans. We anticipate that this protocol will furnish other researchers with a valuable and straightforward experimental approach to examine potential VLP-based vaccines.

Detection of Neutralization-sensitive Epitopes in Antigens Displayed on Virus-Like Particle VLP-Based Vaccines Using a Capture Assay

Here, we present a protocol to detect neutralization epitopes on antigen-displaying virus-like particles (VLPs). Immunoprecipitation of the human immunodeficiency virus (HIV)-derived VLPs is performed using envelope glycoproteins-specific monoclonal antibodies coupled to protein G-conjugated magnetic beads. Captured VLPs are subsequently subjected to SDS-PAGE and Western blot-analysis employing viral core protein Gag-specific antibodies.

포획 분석기를 사용하여 바이러스와 같은 입자(VLP) 기반 백신에 표시되는 항원에서 중화에 민감한 에피토프 검출

The virus-like particle (VLP) capture assay is an immunoprecipitation method, commonly known as a &#39;pull-down assay&#39; used to purify and isolate ...

Generating a Multivalent-Displaying Outer Membrane Vesicle Vaccine

Source: Feng, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64213">A &#34;Plug-And-Display&#34; Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates a method to generate multivalent-displaying outer membrane vesicle (OMV) vaccines. Mammalian cells are transfected to express and secrete viral antigens fused to a SpyTag and a polyhistidine tag. These antigens are then purified using a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column. The purified antigen is mixed with outer membrane vesicles expressing surface-bound SpyCatcher (SC) protein. Multiple antigens covalently attach to SpyCatchers via their SpyTags (ST), creating OMVs that display the antigen, serving as a multivalent vaccine.

다가 표시 외막 소포 백신 생성

1. Plasmid construction

	Insert DNA encoding SpyCatcher sequence (Figure 1) into an ampicillin-resistant pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) plasmid (see Table ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunotherapy

Immunogenics and Vaccine Development

A Technique for the Generation of Influenza Virus-Like Particles via a Mammalian System

Source: Arevalo, M. T., et al.&#160; <a href="https://app.jove.com/v/54041">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the generation of influenza virus-like particles (VLPs) in a mammalian system. Upon expressing three eukaryotic expression vectors &#8212; encoding different viral structural proteins &#8212; in suitable mammalian host cells, the expressed viral proteins self-assemble into VLPs on the host plasma membrane and release via budding from the cell surface.

포유류 시스템을 통한 인플루엔자 바이러스 유사 입자 생성 기술

Source: Arevalo, M. T., et al.&#160; Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the ...