The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.

Bütün deneysel protokoller Tıp Fakültesi Hamamatsu Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. MCMV (Smith ve soyu) ve rekombinan hazırlanması 1. M32-gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) -MCMV <ol><li> Ve daha önce tarif edilen 8 - (1.9 1.2), aşağıdaki yönteme göre rekombinant M32-EGFP-MCMV oluşturur. </li><li> Vahşi tip MCMV (: U68299 erişim sayısı) Smith soyundan türetilen yeniden birleştirici virüsleri kullanın. Ekle EGFP (4361 baz çifti; bp) 37.089 ve 41.450 bp arasında - homolog rekombinasyon yoluyla MCMV genomunda (M32 M31 lokus). </li><li> M32, 5&#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(ileri doğru primer), 5: polimeraz zincir reaksiyonu ile MCMV M32 yükseltin (41.450 - hemen aşağıdaki primerler kullanılarak dizisi gen lokusu kuşatan, 39.246 BP - 39286 bp dizisi ve M31 (37.089 eteklenen kalan &#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT3 &#39;(ters primer), M31, 5&#39;-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39; (ileri doğru primer) 5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;(ters primer). </li><li> Nhel ve BamHI sınırlama bölgeleri kullanılarak EGFP ifade vektörüne M32 lokusu yerleştirin. Afili ve Xbal siteleri kullanarak plazmit -recombinant M32-EGFP içine M31 odağı yerleştirin. EGFP - - M32 dan Nhel ve Afili ile M31 dizisi - EGFP - M32 tutunmaya M31 rekombinasyon plazmid ve H 2 O çözülür </li><li> MCMV (Smith suşu) çekirdekleri içine bölünmüş yapı transferinde homolog rekombinasyon ikna etmek için bir elektroporasyon sistemi kullanılarak NIH3T3 hücreler 24 saat sonrası enfeksiyon (hpi) ile enfekte. </li><li> 3 gün sonra enfeksiyon, enfekte olmuş hücrelerin EGFP ifade odaklar için altı oyuklu plakalar içinde 1 / 1.000 oranına ve ekranda enfekte edilmemiş fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) ile birlikte kültür hücreleri de. </li><li> harveYeşil floresan odakları içeren kuyulardan st virüs içeren süpernatantlar ve on kat sulandırmak. Saflaştırma için, tek yeşil flüoresan odakları görüntüler kuyuları seçin. </li><li> Tüm odaklar sınırlayıcı seyreltme enfeksiyonu görüntüleme EGFP ifade kaynaklanan zaman, virüs preparasyonu Resim vahşi tip virüs kalmasını gösteren saftır. Daha önce 17 açıklandığı gibi plak tahlil yöntemi ile virüs ölçmek. </li><li> eldiven ve maske takıyor biyogüvenlik seviye 2 sertifikalı biyogüvenlik dolaplarında mcmv davranın. </li><li> 12 günlük ICR fare embriyoları hazırlanan MEFS Passage MCMV (Smith suşu) ve rekombinant MCMV daha önce 17 nitelendirdi. </li><li> 16 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile enfekte MEF kültürlerin yüzer hücreleri çıkarmak. </li><li> Ultrasantrifüj işlemi 70.000 x g&#39;de 40 dakika boyunca süpernatanlar. Tris-tamponlu tuzlu su, 1 ml virionlar içeren pelet yeniden süspanse edin ve önceden oluşturulmuş bir lineer S üzerine aktarmakorbitol gradyanı (% 25 -% 70). 60 dakika için 18 Ultracentrifuge yine de 70,000 x g. </li><li> bir şırınga ile viryon içeren grup hasat. 40 dakika boyunca 70.000 x g&#39;de ek ultrasantrifüj aşamasından sonra hasat virionlar Pelet. </li><li> enfeksiyon deneyler kadar -80 ° C&#39;de fosfat tamponlu salin (PBS) ve mağaza 1 ml pelletini. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 19 plak deneyi yöntemi ile virüs titresi ölçmek. </li><li> Floresan mikroskobu (Şekil 1 A) ve transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) 8 (Şekil 1B) partikül yapısı (489 nm, 508 nm emisyon uyarma) rekombinant MCMV parçacıkların EGFP ifade görselleştirme. </li></ol> Nil Kırmızı Floresan mikro-boncuk 2. Hazırlık <ol><li> Satınalma karboksil floresan Nil kırmızı mikroboncuklar ve çapına göre tüpler içine mikro-500 ul koyun (0.04- Yaklaşık 0.06 um, 3.63 x 10 ila 12 parçacıkları; 0.1 - yaklaşık 5.75 x 10 10 parçacıkların 0.3 um; ve 1,7-2,2 um, yaklaşık 6.85 x 10 7 parçacıkları). </li><li> Herhangi bir endotoksin çıkarın ve oda sıcaklığında steril su içinde yeniden süspanse boncuklar yaklaşık 1 gün için 0.1 M NaOH ve 500 ul boncuk tedavi edin. </li><li> kullanımdan önce, oda sıcaklığında, C57BL / 6 farelerinden elde edilen,% 10, fare serumu ile boncuk O / N adsorbe eder. </li><li> agrega, girdap boncuk ayırmak ve kullanmadan önce iyice sonikasyon. </li></ol> Yenidoğan Farelerde içine MCMV ve Floresan mikro boncuklar 3. ICV enjeksiyon <ol><li> 12 saat ışık / karanlık döngüsü altında sıcaklık kontrollü bir tesiste normal gebe ICR farelerine koruyun. yenidoğanların doğum gününde P 0.5 olarak belirlenmiştir. </li><li> 10 ul şırınga ve% 70 alkol ile 27 G iğne sterilize edin. </li><li> MCMV veya floresan mikro içeren enjeksiyon çözeltisi (5 ul) yükdikkatle şırınga pistonu çekerek iğne içine boncuk. </li><li> 4 dakika - 3 buz üzerinde fare koyarak yenidoğan fare (P 0.5) kısıtlamaktadır. hayvan anestezi altına alındıktan sonra, anestezi derinliğini belirlemek için ayak tutam yanıt yöntemini kullanın. </li><li> Mark yaklaşık 0,7 bir yerde toksik olmayan bir laboratuvar kalemle enjeksiyon sitesi - 1,0 mm sagital sütür ve 0.7 yanal - yenidoğan Bregma (Şekil 2A) 1.0 mm kaudal. </li><li> iğne işaretli enjeksiyon yerinde kafatası yüzeye dik derin 2 mm, yerleştirin. Referans olarak, bir toksik-olmayan makinesi ile iğne ucu 2 mm işaretleyin. </li><li> Yavaş yavaş kafa derisi (Şekil 2B) açmadan lateral ventrikül içine MCMV (yaklaşık 5 × 10 5 PFU) 5 ul enjekte edilir. </li><li> (- Yaklaşık 5.75 0.3 um x 10 8 parçacıklar 0.1) farelerin başka bir grubunda, floresan mikroboncukları ihtiva eden bir 5 ul çözelti enjekteaynı yöntem kullanılır. </li><li> geri akışı önlemek için piston hareketini kestikten sonra 20 sn - Yavaşça iğne 10 kaldırın. </li><li> Kurtarmak için 5 fareler tutmak için - hareket ve genel tepki restore kadar sıcak bir kap içinde 10 dakika. </li><li> zaman noktalarında (3, 12, 24, 48 ve 72 saat), enjeksiyon sonrası bir aralığında bölüm 5&#39;de tarif edilen şekilde beyin hasat. </li></ol> Yenidoğan Farelerde içine MCMV veya Floresan mikro boncuklar 4. IV Enjeksiyon <ol><li> 4 dakika - 3 buz üzerinde fare koyarak yenidoğan fare (P 0.5) kısıtlamaktadır. </li><li> P 0.5 yenidoğan MCMV intravenöz enjeksiyon yapmak için 35 g bir iğne ile bir 1 ml şırınga kullanın. </li><li> Yüzeyel temporal (yüz) ven görselleştirmek için bir transilluminator (damar bulucu) kullanın. Enjeksiyon öncesinde, cerrahi bant (Şekil 2C) kullanarak transilluminator&#39;de yenidoğan sabitleyin. </li><li> (1.5x) büyüteç giyerek, yavaş yavaş MCMV (yaklaşık 5,45 × 50 ul demlenmeye; 10 9 parçacıklar) veya floresan mikro boncuk (0.04 - yaklaşık 0.06 mikron, 3.63 × 10 11 parçacıklar 0.1 - yaklaşık 0,3 um, 5.75 × 10 9 parçacıkları ve 1,7-2,2 mikron, yaklaşık 6.85 × 10 6 parçacıklar) yüzeysel temporal ven içine (Şekil 2B). </li><li> iğneyi çıkardıktan sonra, kanama geçene kadar enjeksiyon yerinde baskı uygulamak için% 70 alkol içeren gazlı bez kullanın. </li><li> Yenidoğan sıcak konteyner kafesine dönmeden önce kurtarmak için yaklaşık 5 dakika verin. </li><li> zaman noktalarında (3, 12, 24 ve 72 saat) enjeksiyon sonrası bir aralığında bölüm 5&#39;de tarif edilen şekilde beyin hasat. </li></ol> Parafin Bölüm 5. Beyin Dokusu Numune Hazırlama <ol><li> ezilmiş buz üzerinde küçük bir plastik tabak enjekte yenidoğanlar yerleştirin. </li><li> hayvan anestezi altına alındıktan sonra, anesthes derinliğini belirlemek için ayak tutam yanıt yöntemini kullanınia. </li><li> göğüs boşluğu açmak için göğüs kafesi üzerinden bir merkezi ya da iki uç yatay uç kesim yapmak. </li><li> keskin bir makas ile atrium bir kesim olun. atrium içine% 4 paraformaldehid (PFA) çözümü demlenmeye. Karaciğerin spontan hareket (PFA dansı) ve hafifletilmiş renkli gözlenen zaman perfüzyon durdurun. asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​etmeyin. </li><li> İlk bir makas kullanarak kafa kaldırarak (daha önce 20 tarif) yenidoğan teşrih. </li><li> kafatası açığa çıkarmak için burun boyundan kabuklarıyla birlikte bir orta hat kesi olun. </li><li> dikkatlice kafatasının iç yüzeyi boyunca kayar, bir tarafta foramen magnum içine iris makas keskin ucunu yerleştirin. </li><li> arka kafatası yüzeyi uzak kenarına kadar uzanan bir kesim yapmak ve karşı tarafta aynı kesim yapmak. beyincik etrafında kafatası kaldırmak. </li><li> Dikkatle beyne zarar görmesini önlemek için bir tarafta kafatasını geri soyma. bu işlemi tekrarlayınbeynin diğer tarafında prosedür. </li><li> Bir spatula kullanarak, beynin ventral yüzeyi boyunca koku ampuller ve sinir bağlantılarını kesmek. </li><li> Yavaşça hala makas kullanarak kafatası beyin bağlayın ve beyin kaldırmak herhangi bir dura kırpma, baş beyin ayırın. </li><li> % 4 PFA, 4 ° C&#39;de 24 saat süre ile, beynin en az 10 katı volüm içeren sabitleştirici bir şişede beyin yerleştirin. </li><li> su yer değiştirmesi için kademeli etanol banyoları, bir dizi doku kurutmak ve daha sonra bir blok oluşturur parafin mumu ile infiltre. 21 4 mikron kalınlığında dilimler halinde bir mikrotom ile parafin blok kesin. </li><li> Deparaffinize enfekte beyinleri 22 slaytlar rehydrate ve. Parafin kesitler için in situ hibridizasyon geçin. </li></ol> Dondurulmuş Bölüm 6. Beyin Dokusu Numune Hazırlama <ol><li> 5.1 özetlenen adımları izleyerek beyin çıkarın - 5.11. </li><li> Floresan mikrobilyeleri ve M32-EGFP-MCMV gözlemlemek, düz dipli cryomolds üzerine rezeke beyin yerleştirin. tamamen beyin örneği kapsayacak şekilde gömme orta ekleyin. Yapış chuck taktıktan önce cryomolds kenarına tutmak için forseps kullanarak, önceden soğutulmuş n-heksan (-80 ºC) içinde cryomolds dondurma. </li><li> kesit için, önceden soğutulmuş kriyostat chuck üzerinde dondurulmuş doku bloğunu takın. Bir kriyostat bölmesinde halinde ayna dondurulmuş doku transferi ve -10 ila -20 ° C sıcaklık daha düşük ve yaklaşık 8 dilimlemek - 23 10 um kalınlığındadır. </li><li> püskürterek cytofixative (izopropil alkol ve polietilen glikol karışımı) olan bölümlerin tespit edin. Hava derhal püskürtmeden sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bölümler kuru ve saklayın - sonraki kullanıma kadar 80 ° C. </li><li> Lütfen, oda sıcaklığına kadar bölümler dengelenmesi ve üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> G ile konjüge edilmiş flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile bölümleri Leke1 bir konsantrasyonda, 100 oda sıcaklığında PBS içinde 10 dakika boyunca (Şekil 5) ya da PE-konjuge CD31 antikoru ile: riffonia 1 bir konsantrasyonda B4 isolectin simplicifolia 100 oda sıcaklığında PBS içinde 30 dakika boyunca (Şekil 6). </li><li> PBS ile üç kez bölümleri yıkayın. </li><li> Yıkama işleminden sonra, hücre, çekirdeklerini görselleştirmek için 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bölümleri leke. EGFP (489 nm uyarma, 508 nm emisyon) (345 nm, 455 nm emisyon uyarma), anti-solmaya reaktif ve görüntü DAPI bölümleri mount ve Nil kırmızı (553 nm uyarma, 637 nm emisyon) bir fluoresan mikroskobu ile (Şekil 3, 5, 6). </li></ol> Parafin Gömülü Bölüm in situ Hibridizasyon (FISH) 7. Floresan <ol><li> Bütün MCMV DNA gen ihtiva eden bir bakteriyel suni kromozom kullanılarak çentik translasyonu ile in situ hibridizasyon DNA florofor ile doğrudan işaretlenmiş FISH probu hazırlanmasıOMe (pSM3fr) 19. BALIK prob konsantrasyonu 0.1 ug / ml. </li><li> Deparaffinize enfekte beyinleri 22 slaytlar rehydrate ve. </li><li> viral DNA tespit etmek için RNase (PBS içinde 100 ug / ml) ile doku bölümleri tedavi edin. </li><li> 20 dakika boyunca 98 ° C -% 0.05 NP40, 95 0.01 M sitrat tampon maddesi (pH 6.0) ile antijen alımı gerçekleştirmek. 20 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar aşağı kayar soğutun. </li><li> cam Coplin boyama kavanoz, 2 dakika, her seferinde saf suda üç defa slaytlar yıkayın. Bir% 0.06 pepsin, 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 0.01 N HCI çözeltisi ile ek bir antijen alma aşamasını gerçekleştirir. </li><li> Yıkama, 2 dakika için bir cam Coplin boyama kavanoz her saf suda üç defa açılır. </li><li> % 85 etanol, ardından% 100 etanol,% 70 etanol ile slaytlar aktarma yeniden doku bölümleri kurutmak. </li><li> Hibridizasyon tamponu 10 ml hazırlamak için, in situ hibridizasyon tuzları (3 M NaCI, 100 mM Tris içinde 1.25 ml karıştırın-HCI PH 8.0, 5 ml deiyonize formamid ile 100 mM sodyum fosfat pH 6.8, 50 mM EDTA), 2.5 ml% 50 Dekstran sülfat, 250 ul 50x Denhardt çözeltisi, 125 | il 100 mg / ml tRNA ve 875 ul H2O </li><li> doğrudan melezleme tamponu rastgele bütün MCMV genomunu tanıyan fluorophores etiketli DNA probu sulandırmak. Nihai hacim 10 ul (7 ul hibridizasyon tamponu, 1 ul prob (0.1 ug / ml) ve 2 ul damıtılmış su) olması gerekir. </li><li> Her slayta prob karışımı (10 ul) ekleyin ve bir lamel (15 × 15 mm) ile kaplayın. lastik çimento ile lamel mühür. 85 ° C&#39;de 5 dakika boyunca prob karışımı denatüre ve 42 ° C&#39;de hibridizasyon, basamak O / N doldurun. </li><li> 2 dakika boyunca 73 ° C&#39;de% 0.3 NP40, 0.4x SSC ile slaytlar yıkayın; % 0.1 NP40, 1 dakika boyunca 73 ° C&#39;de 0.4x SSC ile; ve 2x SSC ile iki kez. </li><li> DAPI (10 ng / ml) ve bir lamel ile slayt kapağı ile çekirdekleri Counterstain. </li><li> dağbir floresan mikroskobu (Şekil 4), anti-solma reaktif ve görüntü DAPI (345 nm&#39;de eksıtasyonla 455 nm&#39;de emisyon) ve EGFP (489 nm&#39;de eksıtasyonla 508 nm&#39;de emisyon) bölümler. </li></ol>

<ol>
	<li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+(AAV1)+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice.">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li><li>McLean, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+neuron-specific+transgene+expression+in+brain+and+spinal+cord+following+synapsin+promoter-driven+AAV9+neonatal+intracerebroventricular+injection.">Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection.</a> Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).</li><li>Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cytomegalovirus+displays+selective+infection+of+cells+within+hours+after+systemic+administration.">Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration.</a> J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).</li><li>Sakao-Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+fetal+macrophage/microglial+reactions+to+cytomegalovirus+infection.">Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection.</a> Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).</li><li>Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injections+in+neonatal+mice.">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J Vis Exp. (93), e52037 (2014).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+initiates+infection+selectively+from+high-level+beta1+integrin-expressing+cells+in+the+brain.">Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).</li><li>Rahim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+AAV2/9+to+the+fetal+and+neonatal+mouse+leads+to+differential+targeting+of+CNS+cell+types+and+extensive+transduction+of+the+nervous+system.">Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system.</a> FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).</li><li>Cannon, M. J., Davis, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Washing+our+hands+of+the+congenital+cytomegalovirus+disease+epidemic.">Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic.</a> Bmc Public Health. 5, (2005).</li><li>Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+eye+abnormalities+associated+with+congenital+cytomegalovirus+infection.">Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection.</a> Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).</li><li>Becroft, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+cytomegalovirus+infection:+epidemiology,+pathology+and+pathogenesis.">Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis.</a> Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).</li><li>Conboy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intellectual+development+in+school-aged+children+with+asymptomatic+congenital+cytomegalovirus+infection.">Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection.</a> Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).</li><li>Fowler, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+congenital+cytomegalovirus+infection+in+relation+to+maternal+antibody+status.">The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status.</a> N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).</li><li>Cannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+cytomegalovirus+(CMV)+epidemiology+and+awareness.">Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness.</a> J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).</li><li>Grassi, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+nodular+encephalitis+and+ventriculoencephalitis+due+to+cytomegalovirus+infection+in+patients+with+AIDS:+two+distinct+clinical+patterns.">Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns.</a> Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).</li><li>Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporine+inhibits+mouse+cytomegalovirus+infection+via+a+cyclophilin-dependent+pathway+specifically+in+neural+stem/progenitor+cells.">Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells.</a> J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).</li><li>Britt, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).</li><li>Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+stem+cells+inhibit+murine+cytomegalovirus+infection+through+a+multi-step+process.">Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process.</a> PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+sections+of+paraffin-embedded+tissues.">Cutting sections of paraffin-embedded tissues.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry:+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs.">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. (8), e308 (2007).</li><li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart.">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+and+intravenous+deliveries+are+not+comparable+in+terms+of+drug+efficacy+and+cell+distribution+in+neonatal+mice+with+hypoxia-ischemia.">Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia.</a> Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863 (2014).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(ICV)+and+intravenous+(IV)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hayvan modellerinde, ICV, intraperitoneal, doğrudan plasental ve IV enfeksiyonları, viral ensefalit hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılmıştır. Biz prosedürlerin basitlik ve hedef bölgeye partiküllerin direkt enjeksiyon yararına yenidoğan farelerin ICV ve IV enjeksiyon modelleri üzerinde duruldu. Karın içi enfeksiyon kolay bir yöntem olmasına rağmen, viral partiküller dolaylı süreç 5,24 üzerinden sistematik yayıldı. Doğrudan plasental enfeksiyon embriyonik sistemik enfeksiyon...

Viral ensefalit okuyan zaman viral parçacıkların ilk dağıtım hastalık patogenezi anlamak ve beyinde viral hedefleri tespit etmek çok önemlidir. Pandoravirus büyüklüğü 1 fazla 700 nm, ancak çok virüs, 20 ila 300 nm arasında boyutu değişir. akut dönemdeki viral partiküllerin dağılım parçacıklarının büyüklüğü, hücresel reseptörlere dağılımı ya da virüs hücresel reseptörlerin afinite ile bağlı olabilir. Hayvan modellerinde, intraserebroventriküler (ICV), intraperitonal, doğrudan plasental ve damar içi (IV) enfeksiyonları, viral ensefalit hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılmıştır olarak. virüs ICV aşılama genellikle farelerde, merkezi sinir sistemi (CNS) enfeksiyonları kurmak için kullanılır. Bu teknik kullanılarak yapılan çalışmalar, özellikle periventriküler bölgelerinde hücre ve beyin omurilik sıvısı (CSF), Simila ile doğrudan temas halinde beyin bölgelerinde yaygın bir enfeksiyon raporViral ventriculoencephalitis etkilerine R. Adeno-ilişkili virüs (AAV) parçacıklar, küçük boyutlu (20 - çapı 25 nm) ICV enfeksiyonlar 2-4 beyin boyunca yayılmasını kolaylaştırır. İntraperitoneal 5, direkt plasental 6, ve IV enjeksiyonlar 7 hematojenik sistemik yönetimini temsil etmektedir. Kan-beyin bariyerinin (KBB) viral parçacıkların penetrasyon onları yaygın mikroglial nodüller 8,9 temsil yenidoğan beyin parankimi ulaşmasını sağlar. Sitomegalovirüs (CMV), herpes virüsü ailesine ait ortak bir virüstür. Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde,% 50 - insanların% 80 40. CMV enfeksiyonları nadiren zararlı ama immün sistemi baskılanmış hastalarda ve fetuslarda hastalıklara neden olabilir yaş CMV enfeksiyonu vardı. Tüm doğumların% 0.2 -% 2 gibi mikrosefali, periventriküler kalsifikasyon, serebellar hipoplazi, MICR gibi şiddetli semptomlar sonuçlanan CMV 10 ile doğarlaroftalmi ve optik sinir atrofisi 11,12. Ayrıca, mental retardasyon, işitme kaybı, görme kusurları, nöbet ve epilepsi olmayan ölümcül CMV ile enfekte bebeklerin 13,14 yaklaşık% 10&#39;unda görülür. MSS disfonksiyonu CMV konjenital anomali en sık görülen karakteristik belirtidir. Daha çocuk kalıcı olarak Down sendromu, fetal alkol sendromu veya spina bifida 15 tarafından daha doğuştan CMV tarafından her yıl devre dışıdır. güvenli ve etkili bir aşı ihtiyacı için çağrıda, şu anda CMV ye karşı hiçbir aşı mevcut. enfeksiyonun erken fazında reseptörleriyle CMV parçacıkların etkileşimi incelemek aşılamanın etkisini anlamak önemlidir. Ventriculoencephalitis ve yaygın mikroglial nodüller CMV iki ana patolojik özellikleri 16 ensefalit vardır. (- 300 nm 150) enfeksiyonu a akut fazında beynin yoluyla yayılan CMV parçacıkları nasıl belirsiz olmuşturnd nasıl hücresel reseptörlerin dağılımı ve virüsler için kendi afinite viral yayılmasına katkıda bulunur. Kawasaki vd. ICV ve parçacıklar ve enfeksiyon en erken aşamasında reseptörleri (β1 integrin) dağılımı açısından IV enfeksiyonları değerlendirilmiştir. CMV parçacıkları ve β1 integrin ekspresyonu yayılması de ICV, IV enfeksiyonlar 8 hem de enfeksiyon en erken aşamasında ilişkili olduğunu bulmuşlardır. ICV enfeksiyonu ventriculoencephalitis bir modeldir ve IV enfeksiyonu yaygın mikroglial nodüllerin bir modeldir. Viral veya floresan parçacıkların dinamiği incelenmesi parçacık boyutu, hücresel reseptörlere viral etkileşimleri ve beyinde BBB penetrasyon mekanizması etkisi hakkında yararlı bilgi verir. Aşağıdaki protokol CNS&#39;de bir viral enfeksiyon ve viral vektör araştırmak için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="690">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T-6791</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H-1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-N1 vector&#160;</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">D-sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06</td>
			<td>Spherotech, Inc.</td>
			<td>FP-00556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3</td>
			<td>Spherotech, Inc.</td>
			<td>FP-0256-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2</td>
			<td>Spherotech, inc.&#160;</td>
			<td>FP-2056-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% mouse serum</td>
			<td>DAKO&#160;</td>
			<td>X0910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C57BL/6 mouse</td>
			<td>SLC, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ICR mouse</td>
			<td>SLC, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Modified Microliter Syringes (7000 Series)</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35-gauge needle</td>
			<td>Saito Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A Wee Sight Transilluminator</td>
			<td>Phillips Healthcare</td>
			<td>1017920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O.C.T.Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet(R) P-40</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>25223-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">citrate buffer (pH6) x10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C9999-100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pepsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>dojindo</td>
			<td>N001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>TCI</td>
			<td>F0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>42867-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Denhardt&#39;s Solution (50X)</td>
			<td>ThermoFishcer sceintific</td>
			<td>750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast tRNA (10 mg/mL)</td>
			<td>ThermoFishcer sceintific</td>
			<td>AM7119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SSC x20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>ThermoFishcer sceintific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Hexane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superfrost plus glass</td>
			<td>ThermoFishcer sceintific</td>
			<td>12-55-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytokeep II</td>
			<td>Nippon Shoji Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4</td>
			<td>Vector laboratories, Inc.</td>
			<td>L1104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>12-0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong&#160; Gold</td>
			<td>ThermoFishcer sceintific</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BIOREVO</td>
			<td>KEYENCE</td>
			<td style="width:80px;">BZ-9000E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles and fluorescent microbeads into the neonatal brain

viral ensefalit patogenezinde çalışmada, enfeksiyon yöntemi önemlidir. beyne iki enfeksiyon güzergah birinci endotel hücreleri ve beynin perisitlerin tarafından enfekte kan yoluyla yoldur. İkinci intraserebroventriküler (ICV) yoldur. Bir kez merkezi sinir sistemi (MSS) dahilinde, virüsler beyin omurilik sıvısı yoluyla subaraknoid, meninkslerin ve koroid pleksus yayılabilir. deneysel modellerde, MSS viral dağıtım erken aşamaları iyi karakterize değildir ve sadece belirli hücreler başlangıçta enfekte olup olmadığı bilinmemektedir. Burada, enfeksiyonun akut fazında sitomegalovirüs (CMV) parçacıkların dağılımını analiz ettik, yenidoğan fare beyninin içine ICV veya damar içi (IV) enjeksiyonu takiben, birincil viremi olarak adlandırılan. ICV püskürtme modelinde, fare CMV (MCMV) ya da flüoresan mikro-5 ul midpoi yanal ventrikül içine enjekte edilmiştirnt 27 G iğne ile 10 ul şırınga kullanarak kulak ve göz arasındaki. IV enjeksiyonu modelinde, 35 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanıldı. Bir transillüminator yenidoğan fare yüzeysel zamansal (yüz) damar görselleştirmek için kullanıldı. Biz yüzeysel temporal ven içine MCMV veya floresan mikro-50 ul aşılamıştır. Brain farklı zaman noktalarında Enjeksiyondan sonra toplandı. MCMV genomları in situ hibridizasyon yönteminde kullanılarak tespit edildi. Rekombinant MCMV parçacıkları ifade Floresan mikro-veya yeşil floresan proteini flüoresans mikroskopisi ile tespit edilmiştir. Bu teknikler, ensefalit patogenezini araştırmak için diğer patojenlere uygulanabilir.

viral ensefalit patogenezi ile ilgili çalışmalarda, enfeksiyon yöntemi önemlidir. ICV rota akut enfeksiyon, subaraknoid uzayda BOS yoluyla yayılan meninkslerde ve koroid pleksus ulaşan temsil ederken hematojen yol, endotel hücreleri ve beyin perisitlerin akut enfeksiyon temsil eder. MCMV genom ve M32-EGFP-MCMV parçacıklar veya floresan mikro-doğrudan gözlem tespit in situ hibridizasyon akut ensefalit partiküllerin ilk dağılımını analiz etmek için kullanıldı....

Watch this Scientific Journal Video about Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain at JoVE.com

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

intracerebroventricular-intravascular-injection-viral-particles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.2K Görüntüleme.  Hamamatsu University School of Medicine. Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization. 

Video: Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Nörobilim

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Lisolesitin Odak Enjeksiyon Deneysel Demyelizasyon ve Kemirgen Omurilik remiyelinizasyon

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Intracerebroventricular Injection of Amyloid-&#946; Peptides in Normal Mice to Acutely Induce Alzheimer-like Cognitive Deficits

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of A&#946; oligomers and plaques is observed. Such A&#946; abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of A&#946; levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an A&#946;-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the A&#946; into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of A&#946;. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of A&#946;, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of A&#946; abnormalities.

The amyloid-&#946; (A&#946;)-injected animal model enables the administration of a defined quantity and species of A&#946; fragments and reduces individual differences within each study group. This protocol describes the intracerebroventricular (ICV) injection of A&#946; without stereotactic instruments, enabling the production of Alzheimer-like behavioral abnormalities in normal mice.

Normal Farelerde Amiloid-β Peptitler intraserebroventriküler enjeksiyon Akut Alzheimer gibi Bilişsel Açıkları tetikleyebilecek

Amyloid-&#946; (A&#946;) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer's disease (AD). In the brains of AD patients, ...

Intracerebroventricular Treatment with Resiniferatoxin and Pain Tests in Mice

The transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), a thermosensitive cation channel, is known to trigger pain in the peripheral nerves. In addition to its peripheral function, its involvement in brain functions has also been suggested. Resiniferatoxin (RTX), an ultrapotent TRPV1 agonist, has been known to induce long-term desensitization of TRPV1, and this desensitization has been an alternative approach for investigating the physiological relevance of TRPV1-expressing cells. Here we describe a protocol for intracerebroventricular (i.c.v.) treatment with RTX in mice. Procedures are described for testing nociception to peripheral TRPV1 stimulation (RTX test) and mechanical stimulation (tail pressure test) then follow. Although the nociceptive responses of mice that had been administered RTX i.c.v. were comparable to those of the control groups, RTX-i.c.v.-administered mice were insensitive to the analgesic effect of acetaminophen, suggesting that i.c.v. RTX treatment can induce supraspinal-selective TRPV1 desensitization. This mouse model can be used as a convenient experimental system for studying the role of TRPV1 in brain/supraspinal function. These techniques can also be applied to studies of the central actions of other drugs.

The transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1) in the supraspinal region has been suggested to play some roles in the brain function. Described here is a protocol for intracerebroventricular injection of resiniferatoxin for supraspinal TRPV1 desensitization in mice. Procedures for some pain tests are also presented.

Farelerde Resiniferatoksin ve Ağrı Testleri ile İntracerebroventriküler Tedavi

The transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), a thermosensitive cation channel, is known to trigger pain in the peripheral nerves. In ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...