Name: intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles and fluorescent microbeads into the neonatal brain
Uploaded: 2016-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain at JoVE.com

The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.

Bütün deneysel protokoller Tıp Fakültesi Hamamatsu Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. MCMV (Smith ve soyu) ve rekombinan hazırlanması 1. M32-gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) -MCMV <ol><li> Ve daha önce tarif edilen 8 - (1.9 1.2), aşağıdaki yönteme göre rekombinant M32-EGFP-MCMV oluşturur. </li><li> Vahşi tip MCMV (: U68299 erişim sayısı) Smith soyundan türetilen yeniden birleştirici virüsleri kullanın. Ekle EGFP (4361 baz çifti; bp) 37.089 ve 41.450 bp arasında - homolog rekombinasyon yoluyla MCMV genomunda (M32 M31 lokus). </li><li> M32, 5&#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(ileri doğru primer), 5: polimeraz zincir reaksiyonu ile MCMV M32 yükseltin (41.450 - hemen aşağıdaki primerler kullanılarak dizisi gen lokusu kuşatan, 39.246 BP - 39286 bp dizisi ve M31 (37.089 eteklenen kalan &#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT3 &#39;(ters primer), M31, 5&#39;-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39; (ileri doğru primer) 5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;(ters primer). </li><li> Nhel ve BamHI sınırlama bölgeleri kullanılarak EGFP ifade vektörüne M32 lokusu yerleştirin. Afili ve Xbal siteleri kullanarak plazmit -recombinant M32-EGFP içine M31 odağı yerleştirin. EGFP - - M32 dan Nhel ve Afili ile M31 dizisi - EGFP - M32 tutunmaya M31 rekombinasyon plazmid ve H 2 O çözülür </li><li> MCMV (Smith suşu) çekirdekleri içine bölünmüş yapı transferinde homolog rekombinasyon ikna etmek için bir elektroporasyon sistemi kullanılarak NIH3T3 hücreler 24 saat sonrası enfeksiyon (hpi) ile enfekte. </li><li> 3 gün sonra enfeksiyon, enfekte olmuş hücrelerin EGFP ifade odaklar için altı oyuklu plakalar içinde 1 / 1.000 oranına ve ekranda enfekte edilmemiş fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) ile birlikte kültür hücreleri de. </li><li> harveYeşil floresan odakları içeren kuyulardan st virüs içeren süpernatantlar ve on kat sulandırmak. Saflaştırma için, tek yeşil flüoresan odakları görüntüler kuyuları seçin. </li><li> Tüm odaklar sınırlayıcı seyreltme enfeksiyonu görüntüleme EGFP ifade kaynaklanan zaman, virüs preparasyonu Resim vahşi tip virüs kalmasını gösteren saftır. Daha önce 17 açıklandığı gibi plak tahlil yöntemi ile virüs ölçmek. </li><li> eldiven ve maske takıyor biyogüvenlik seviye 2 sertifikalı biyogüvenlik dolaplarında mcmv davranın. </li><li> 12 günlük ICR fare embriyoları hazırlanan MEFS Passage MCMV (Smith suşu) ve rekombinant MCMV daha önce 17 nitelendirdi. </li><li> 16 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile enfekte MEF kültürlerin yüzer hücreleri çıkarmak. </li><li> Ultrasantrifüj işlemi 70.000 x g&#39;de 40 dakika boyunca süpernatanlar. Tris-tamponlu tuzlu su, 1 ml virionlar içeren pelet yeniden süspanse edin ve önceden oluşturulmuş bir lineer S üzerine aktarmakorbitol gradyanı (% 25 -% 70). 60 dakika için 18 Ultracentrifuge yine de 70,000 x g. </li><li> bir şırınga ile viryon içeren grup hasat. 40 dakika boyunca 70.000 x g&#39;de ek ultrasantrifüj aşamasından sonra hasat virionlar Pelet. </li><li> enfeksiyon deneyler kadar -80 ° C&#39;de fosfat tamponlu salin (PBS) ve mağaza 1 ml pelletini. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 19 plak deneyi yöntemi ile virüs titresi ölçmek. </li><li> Floresan mikroskobu (Şekil 1 A) ve transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) 8 (Şekil 1B) partikül yapısı (489 nm, 508 nm emisyon uyarma) rekombinant MCMV parçacıkların EGFP ifade görselleştirme. </li></ol> Nil Kırmızı Floresan mikro-boncuk 2. Hazırlık <ol><li> Satınalma karboksil floresan Nil kırmızı mikroboncuklar ve çapına göre tüpler içine mikro-500 ul koyun (0.04- Yaklaşık 0.06 um, 3.63 x 10 ila 12 parçacıkları; 0.1 - yaklaşık 5.75 x 10 10 parçacıkların 0.3 um; ve 1,7-2,2 um, yaklaşık 6.85 x 10 7 parçacıkları). </li><li> Herhangi bir endotoksin çıkarın ve oda sıcaklığında steril su içinde yeniden süspanse boncuklar yaklaşık 1 gün için 0.1 M NaOH ve 500 ul boncuk tedavi edin. </li><li> kullanımdan önce, oda sıcaklığında, C57BL / 6 farelerinden elde edilen,% 10, fare serumu ile boncuk O / N adsorbe eder. </li><li> agrega, girdap boncuk ayırmak ve kullanmadan önce iyice sonikasyon. </li></ol> Yenidoğan Farelerde içine MCMV ve Floresan mikro boncuklar 3. ICV enjeksiyon <ol><li> 12 saat ışık / karanlık döngüsü altında sıcaklık kontrollü bir tesiste normal gebe ICR farelerine koruyun. yenidoğanların doğum gününde P 0.5 olarak belirlenmiştir. </li><li> 10 ul şırınga ve% 70 alkol ile 27 G iğne sterilize edin. </li><li> MCMV veya floresan mikro içeren enjeksiyon çözeltisi (5 ul) yükdikkatle şırınga pistonu çekerek iğne içine boncuk. </li><li> 4 dakika - 3 buz üzerinde fare koyarak yenidoğan fare (P 0.5) kısıtlamaktadır. hayvan anestezi altına alındıktan sonra, anestezi derinliğini belirlemek için ayak tutam yanıt yöntemini kullanın. </li><li> Mark yaklaşık 0,7 bir yerde toksik olmayan bir laboratuvar kalemle enjeksiyon sitesi - 1,0 mm sagital sütür ve 0.7 yanal - yenidoğan Bregma (Şekil 2A) 1.0 mm kaudal. </li><li> iğne işaretli enjeksiyon yerinde kafatası yüzeye dik derin 2 mm, yerleştirin. Referans olarak, bir toksik-olmayan makinesi ile iğne ucu 2 mm işaretleyin. </li><li> Yavaş yavaş kafa derisi (Şekil 2B) açmadan lateral ventrikül içine MCMV (yaklaşık 5 × 10 5 PFU) 5 ul enjekte edilir. </li><li> (- Yaklaşık 5.75 0.3 um x 10 8 parçacıklar 0.1) farelerin başka bir grubunda, floresan mikroboncukları ihtiva eden bir 5 ul çözelti enjekteaynı yöntem kullanılır. </li><li> geri akışı önlemek için piston hareketini kestikten sonra 20 sn - Yavaşça iğne 10 kaldırın. </li><li> Kurtarmak için 5 fareler tutmak için - hareket ve genel tepki restore kadar sıcak bir kap içinde 10 dakika. </li><li> zaman noktalarında (3, 12, 24, 48 ve 72 saat), enjeksiyon sonrası bir aralığında bölüm 5&#39;de tarif edilen şekilde beyin hasat. </li></ol> Yenidoğan Farelerde içine MCMV veya Floresan mikro boncuklar 4. IV Enjeksiyon <ol><li> 4 dakika - 3 buz üzerinde fare koyarak yenidoğan fare (P 0.5) kısıtlamaktadır. </li><li> P 0.5 yenidoğan MCMV intravenöz enjeksiyon yapmak için 35 g bir iğne ile bir 1 ml şırınga kullanın. </li><li> Yüzeyel temporal (yüz) ven görselleştirmek için bir transilluminator (damar bulucu) kullanın. Enjeksiyon öncesinde, cerrahi bant (Şekil 2C) kullanarak transilluminator&#39;de yenidoğan sabitleyin. </li><li> (1.5x) büyüteç giyerek, yavaş yavaş MCMV (yaklaşık 5,45 × 50 ul demlenmeye; 10 9 parçacıklar) veya floresan mikro boncuk (0.04 - yaklaşık 0.06 mikron, 3.63 × 10 11 parçacıklar 0.1 - yaklaşık 0,3 um, 5.75 × 10 9 parçacıkları ve 1,7-2,2 mikron, yaklaşık 6.85 × 10 6 parçacıklar) yüzeysel temporal ven içine (Şekil 2B). </li><li> iğneyi çıkardıktan sonra, kanama geçene kadar enjeksiyon yerinde baskı uygulamak için% 70 alkol içeren gazlı bez kullanın. </li><li> Yenidoğan sıcak konteyner kafesine dönmeden önce kurtarmak için yaklaşık 5 dakika verin. </li><li> zaman noktalarında (3, 12, 24 ve 72 saat) enjeksiyon sonrası bir aralığında bölüm 5&#39;de tarif edilen şekilde beyin hasat. </li></ol> Parafin Bölüm 5. Beyin Dokusu Numune Hazırlama <ol><li> ezilmiş buz üzerinde küçük bir plastik tabak enjekte yenidoğanlar yerleştirin. </li><li> hayvan anestezi altına alındıktan sonra, anesthes derinliğini belirlemek için ayak tutam yanıt yöntemini kullanınia. </li><li> göğüs boşluğu açmak için göğüs kafesi üzerinden bir merkezi ya da iki uç yatay uç kesim yapmak. </li><li> keskin bir makas ile atrium bir kesim olun. atrium içine% 4 paraformaldehid (PFA) çözümü demlenmeye. Karaciğerin spontan hareket (PFA dansı) ve hafifletilmiş renkli gözlenen zaman perfüzyon durdurun. asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​etmeyin. </li><li> İlk bir makas kullanarak kafa kaldırarak (daha önce 20 tarif) yenidoğan teşrih. </li><li> kafatası açığa çıkarmak için burun boyundan kabuklarıyla birlikte bir orta hat kesi olun. </li><li> dikkatlice kafatasının iç yüzeyi boyunca kayar, bir tarafta foramen magnum içine iris makas keskin ucunu yerleştirin. </li><li> arka kafatası yüzeyi uzak kenarına kadar uzanan bir kesim yapmak ve karşı tarafta aynı kesim yapmak. beyincik etrafında kafatası kaldırmak. </li><li> Dikkatle beyne zarar görmesini önlemek için bir tarafta kafatasını geri soyma. bu işlemi tekrarlayınbeynin diğer tarafında prosedür. </li><li> Bir spatula kullanarak, beynin ventral yüzeyi boyunca koku ampuller ve sinir bağlantılarını kesmek. </li><li> Yavaşça hala makas kullanarak kafatası beyin bağlayın ve beyin kaldırmak herhangi bir dura kırpma, baş beyin ayırın. </li><li> % 4 PFA, 4 ° C&#39;de 24 saat süre ile, beynin en az 10 katı volüm içeren sabitleştirici bir şişede beyin yerleştirin. </li><li> su yer değiştirmesi için kademeli etanol banyoları, bir dizi doku kurutmak ve daha sonra bir blok oluşturur parafin mumu ile infiltre. 21 4 mikron kalınlığında dilimler halinde bir mikrotom ile parafin blok kesin. </li><li> Deparaffinize enfekte beyinleri 22 slaytlar rehydrate ve. Parafin kesitler için in situ hibridizasyon geçin. </li></ol> Dondurulmuş Bölüm 6. Beyin Dokusu Numune Hazırlama <ol><li> 5.1 özetlenen adımları izleyerek beyin çıkarın - 5.11. </li><li> Floresan mikrobilyeleri ve M32-EGFP-MCMV gözlemlemek, düz dipli cryomolds üzerine rezeke beyin yerleştirin. tamamen beyin örneği kapsayacak şekilde gömme orta ekleyin. Yapış chuck taktıktan önce cryomolds kenarına tutmak için forseps kullanarak, önceden soğutulmuş n-heksan (-80 ºC) içinde cryomolds dondurma. </li><li> kesit için, önceden soğutulmuş kriyostat chuck üzerinde dondurulmuş doku bloğunu takın. Bir kriyostat bölmesinde halinde ayna dondurulmuş doku transferi ve -10 ila -20 ° C sıcaklık daha düşük ve yaklaşık 8 dilimlemek - 23 10 um kalınlığındadır. </li><li> püskürterek cytofixative (izopropil alkol ve polietilen glikol karışımı) olan bölümlerin tespit edin. Hava derhal püskürtmeden sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bölümler kuru ve saklayın - sonraki kullanıma kadar 80 ° C. </li><li> Lütfen, oda sıcaklığına kadar bölümler dengelenmesi ve üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> G ile konjüge edilmiş flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile bölümleri Leke1 bir konsantrasyonda, 100 oda sıcaklığında PBS içinde 10 dakika boyunca (Şekil 5) ya da PE-konjuge CD31 antikoru ile: riffonia 1 bir konsantrasyonda B4 isolectin simplicifolia 100 oda sıcaklığında PBS içinde 30 dakika boyunca (Şekil 6). </li><li> PBS ile üç kez bölümleri yıkayın. </li><li> Yıkama işleminden sonra, hücre, çekirdeklerini görselleştirmek için 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bölümleri leke. EGFP (489 nm uyarma, 508 nm emisyon) (345 nm, 455 nm emisyon uyarma), anti-solmaya reaktif ve görüntü DAPI bölümleri mount ve Nil kırmızı (553 nm uyarma, 637 nm emisyon) bir fluoresan mikroskobu ile (Şekil 3, 5, 6). </li></ol> Parafin Gömülü Bölüm in situ Hibridizasyon (FISH) 7. Floresan <ol><li> Bütün MCMV DNA gen ihtiva eden bir bakteriyel suni kromozom kullanılarak çentik translasyonu ile in situ hibridizasyon DNA florofor ile doğrudan işaretlenmiş FISH probu hazırlanmasıOMe (pSM3fr) 19. BALIK prob konsantrasyonu 0.1 ug / ml. </li><li> Deparaffinize enfekte beyinleri 22 slaytlar rehydrate ve. </li><li> viral DNA tespit etmek için RNase (PBS içinde 100 ug / ml) ile doku bölümleri tedavi edin. </li><li> 20 dakika boyunca 98 ° C -% 0.05 NP40, 95 0.01 M sitrat tampon maddesi (pH 6.0) ile antijen alımı gerçekleştirmek. 20 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar aşağı kayar soğutun. </li><li> cam Coplin boyama kavanoz, 2 dakika, her seferinde saf suda üç defa slaytlar yıkayın. Bir% 0.06 pepsin, 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 0.01 N HCI çözeltisi ile ek bir antijen alma aşamasını gerçekleştirir. </li><li> Yıkama, 2 dakika için bir cam Coplin boyama kavanoz her saf suda üç defa açılır. </li><li> % 85 etanol, ardından% 100 etanol,% 70 etanol ile slaytlar aktarma yeniden doku bölümleri kurutmak. </li><li> Hibridizasyon tamponu 10 ml hazırlamak için, in situ hibridizasyon tuzları (3 M NaCI, 100 mM Tris içinde 1.25 ml karıştırın-HCI PH 8.0, 5 ml deiyonize formamid ile 100 mM sodyum fosfat pH 6.8, 50 mM EDTA), 2.5 ml% 50 Dekstran sülfat, 250 ul 50x Denhardt çözeltisi, 125 | il 100 mg / ml tRNA ve 875 ul H2O </li><li> doğrudan melezleme tamponu rastgele bütün MCMV genomunu tanıyan fluorophores etiketli DNA probu sulandırmak. Nihai hacim 10 ul (7 ul hibridizasyon tamponu, 1 ul prob (0.1 ug / ml) ve 2 ul damıtılmış su) olması gerekir. </li><li> Her slayta prob karışımı (10 ul) ekleyin ve bir lamel (15 × 15 mm) ile kaplayın. lastik çimento ile lamel mühür. 85 ° C&#39;de 5 dakika boyunca prob karışımı denatüre ve 42 ° C&#39;de hibridizasyon, basamak O / N doldurun. </li><li> 2 dakika boyunca 73 ° C&#39;de% 0.3 NP40, 0.4x SSC ile slaytlar yıkayın; % 0.1 NP40, 1 dakika boyunca 73 ° C&#39;de 0.4x SSC ile; ve 2x SSC ile iki kez. </li><li> DAPI (10 ng / ml) ve bir lamel ile slayt kapağı ile çekirdekleri Counterstain. </li><li> dağbir floresan mikroskobu (Şekil 4), anti-solma reaktif ve görüntü DAPI (345 nm&#39;de eksıtasyonla 455 nm&#39;de emisyon) ve EGFP (489 nm&#39;de eksıtasyonla 508 nm&#39;de emisyon) bölümler. </li></ol>

<ol>
	<li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandoraviruses:+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes.">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+(AAV1)+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice.">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo.">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).</li><li>McLean, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+neuron-specific+transgene+expression+in+brain+and+spinal+cord+following+synapsin+promoter-driven+AAV9+neonatal+intracerebroventricular+injection.">Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection.</a> Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).</li><li>Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cytomegalovirus+displays+selective+infection+of+cells+within+hours+after+systemic+administration.">Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration.</a> J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).</li><li>Sakao-Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+fetal+macrophage/microglial+reactions+to+cytomegalovirus+infection.">Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection.</a> Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).</li><li>Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+injections+in+neonatal+mice.">Intravenous injections in neonatal mice.</a> J Vis Exp. (93), e52037 (2014).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+initiates+infection+selectively+from+high-level+beta1+integrin-expressing+cells+in+the+brain.">Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).</li><li>Rahim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+administration+of+AAV2/9+to+the+fetal+and+neonatal+mouse+leads+to+differential+targeting+of+CNS+cell+types+and+extensive+transduction+of+the+nervous+system.">Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system.</a> FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).</li><li>Cannon, M. J., Davis, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Washing+our+hands+of+the+congenital+cytomegalovirus+disease+epidemic.">Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic.</a> Bmc Public Health. 5, (2005).</li><li>Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+eye+abnormalities+associated+with+congenital+cytomegalovirus+infection.">Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection.</a> Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).</li><li>Becroft, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+cytomegalovirus+infection:+epidemiology,+pathology+and+pathogenesis.">Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis.</a> Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).</li><li>Conboy, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intellectual+development+in+school-aged+children+with+asymptomatic+congenital+cytomegalovirus+infection.">Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection.</a> Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).</li><li>Fowler, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+congenital+cytomegalovirus+infection+in+relation+to+maternal+antibody+status.">The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status.</a> N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).</li><li>Cannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+cytomegalovirus+(CMV)+epidemiology+and+awareness.">Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness.</a> J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).</li><li>Grassi, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+nodular+encephalitis+and+ventriculoencephalitis+due+to+cytomegalovirus+infection+in+patients+with+AIDS:+two+distinct+clinical+patterns.">Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns.</a> Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).</li><li>Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporine+inhibits+mouse+cytomegalovirus+infection+via+a+cyclophilin-dependent+pathway+specifically+in+neural+stem/progenitor+cells.">Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells.</a> J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).</li><li>Britt, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus:+propagation,+quantification,+and+storage.">Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).</li><li>Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+stem+cells+inhibit+murine+cytomegalovirus+infection+through+a+multi-step+process.">Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process.</a> PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+sections+of+paraffin-embedded+tissues.">Cutting sections of paraffin-embedded tissues.</a> CSH Protoc. , (2008).</li><li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry:+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs.">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. (8), e308 (2007).</li><li>Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart.">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+and+intravenous+deliveries+are+not+comparable+in+terms+of+drug+efficacy+and+cell+distribution+in+neonatal+mice+with+hypoxia-ischemia.">Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia.</a> Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863 (2014).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(ICV)+and+intravenous+(IV)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hayvan modellerinde, ICV, intraperitoneal, doğrudan plasental ve IV enfeksiyonları, viral ensefalit hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılmıştır. Biz prosedürlerin basitlik ve hedef bölgeye partiküllerin direkt enjeksiyon yararına yenidoğan farelerin ICV ve IV enjeksiyon modelleri üzerinde duruldu. Karın içi enfeksiyon kolay bir yöntem olmasına rağmen, viral partiküller dolaylı süreç 5,24 üzerinden sistematik yayıldı. Doğrudan plasental enfeksiyon embriyonik sistemik enfeksiyon çalışmak için iyi bir yöntemdir. Ancak, bu yöntem istikrarlı sonuçlar elde etmek için özel eğitim gerektiren ve düşük başarı oranına sahiptir. Enfeksiyon yöntemi de plasenta aracılığıyla dolaylı işlem olup, her bir deneme 6 fetusun içine enjeksiyon miktarını kontrol etmek zordur. yenidoğan fare CMV gibi virüslere karşı çok duyarlı olduğu için, bu çalışmada, çok erken PHA viral parçacıkların dağılımı ve enfekte olmuş hücrelerin bu karşılaştırabilirsinizenfeksiyonun örn. IV enfeksiyon modeli BBB ile virüsün etkileşimi dahil olmak üzere doğal enfeksiyon benzeyen bir sistemik enfeksiyon modeli ise ICV enjeksiyon modeli, BBB 25 atlar enfeksiyon davranışlarını incelemek için faydalıdır. ICV enjeksiyon yöntemi ile, derin kafatası içine en az 2 mm nüfuz emin yaptı. Ventriküllerden 26&#39;dan akışı önlemek için 20 sn - İğne yaklaşık 10 serebral ventriküller içinde tutuldu. Dikkatle Bittiğinde, ICV enjeksiyon hızlı ve in vivo yönteminde kolay bir olduğunu. Ancak, istenmeyen backflow veya meydana gelebilecek beyin iğne derin / sığ penetrasyon dahil bazen yanlış enjeksiyonlar. Dikkatli prosedürler ve gözlemler sonrası enjeksiyon başarıyla bu protokolü gerçekleştirmek için gereklidir. Enjeksiyon hatalarını göz önüne alındığında, biz sadece parçacıkların ve nicelik değil dağıtım desenleri üzerinde duruldu ve ilacın tedavi etkisi gözlenmediS ya da Çalışmamızda fonksiyonel antikorlar. Böyle yüzeysel zamansal damarlar, dış juguler ven ve retro-orbital sinüs gibi çeşitli siteleri aracılığıyla fare yenidoğan IV enjeksiyonu, gerçekleştirmek için çeşitli prosedürler vardır. yenidoğanın yüzeysel zamansal ven kolayca transillüminator ve büyütme merceği ile görüntülenmiştir. Enjeksiyon rate.We IV enjeksiyon yerinde olarak yüzeysel zamansal ven seçti yüksek başarı ile tek bir tecrübeli kişi tarafından tamamlanabilir. IV enjeksiyon yöntemi, yenidoğan fare ve enjeksiyon prosedürü konumlandırma gibi bazı eğitim gerektirir. Temporal ven üst ve düz olmak üzere yenidoğan fare baş bandı ile yerleştirilmelidir. 35 G iğne iğne ucu tamamen gemi ile çevrili olduğunu yeterince damar içine sokulmalıdır. Bir transillüminator ve büyütücü gözlük açıkça küçük damarları görselleştirmek için yararlı araçlardır. kadar 100 büyük hacimli enjeksiyonul içeriğinin akışını onaylamak için yavaş yavaş infüzyon yoluyla uygulanmalıdır. İlk çalışmada, enjeksiyon arızalanması durumunda, temporal ven diğer tarafında başka bir deneme için kullanılabilir. Enjeksiyondan sonra, yavrular en az sıkıntı yaşamaya ve hızla iyileşir. bir 20 üzerinden yavruların ortalama büyük sıkıntı yaşarsınız ve kurtarmak değil neden belli değildir. Ancak, bu olayın minimal hasar bütün deneysel tasarım gerçekleşme oranı düşük. IV enjeksiyon yöntemi yüksek başarı oranına (% 80&#39;den fazla) olduğu gibi, biz ve bu tür ilaçların veya fonksiyonel antikorlar gibi sistemik tedaviler olmadan dağılım biçimini karşılaştırabilirsiniz. Biz daha önce yenidoğan fareler yenidoğan farelerin yüzeysel temporal ven içine (20 ug / g 50 ul) ya da izotop kontrol antikorları (20 ug / g 50 ul), anti-β1 fonksiyonel engelleme antikorlar integrin enjekte edildi bir deney yaptık. Bir saat sonra antikor enjeksiyonu, 5 × 10MCMV 6 PFU (50 ul) temporal ven diğer tarafında infüze edildi. Hamster anti-fare CD29 için birim MCMV-pozitif hücrelerin sayısı izotip antikor ile tedavi edilen beyin 8 bununla karşılaştırırken enjekte edilmiş, beyin düşüktü (ß1 integrin zincirine, Ha2 / 5 klon). sonraki araştırmalarda, aynı yöntem kullanılarak, virüslere karşı ilaçlar ya da nötralize edici antikorların etkileri, viral parçacıklar ve enfekte olan hücrelerin dağılımı gözlenmesiyle belirlenebilir.

Viral ensefalit okuyan zaman viral parçacıkların ilk dağıtım hastalık patogenezi anlamak ve beyinde viral hedefleri tespit etmek çok önemlidir. Pandoravirus büyüklüğü 1 fazla 700 nm, ancak çok virüs, 20 ila 300 nm arasında boyutu değişir. akut dönemdeki viral partiküllerin dağılım parçacıklarının büyüklüğü, hücresel reseptörlere dağılımı ya da virüs hücresel reseptörlerin afinite ile bağlı olabilir. Hayvan modellerinde, intraserebroventriküler (ICV), intraperitonal, doğrudan plasental ve damar içi (IV) enfeksiyonları, viral ensefalit hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılmıştır olarak. virüs ICV aşılama genellikle farelerde, merkezi sinir sistemi (CNS) enfeksiyonları kurmak için kullanılır. Bu teknik kullanılarak yapılan çalışmalar, özellikle periventriküler bölgelerinde hücre ve beyin omurilik sıvısı (CSF), Simila ile doğrudan temas halinde beyin bölgelerinde yaygın bir enfeksiyon raporViral ventriculoencephalitis etkilerine R. Adeno-ilişkili virüs (AAV) parçacıklar, küçük boyutlu (20 - çapı 25 nm) ICV enfeksiyonlar 2-4 beyin boyunca yayılmasını kolaylaştırır. İntraperitoneal 5, direkt plasental 6, ve IV enjeksiyonlar 7 hematojenik sistemik yönetimini temsil etmektedir. Kan-beyin bariyerinin (KBB) viral parçacıkların penetrasyon onları yaygın mikroglial nodüller 8,9 temsil yenidoğan beyin parankimi ulaşmasını sağlar. Sitomegalovirüs (CMV), herpes virüsü ailesine ait ortak bir virüstür. Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde,% 50 - insanların% 80 40. CMV enfeksiyonları nadiren zararlı ama immün sistemi baskılanmış hastalarda ve fetuslarda hastalıklara neden olabilir yaş CMV enfeksiyonu vardı. Tüm doğumların% 0.2 -% 2 gibi mikrosefali, periventriküler kalsifikasyon, serebellar hipoplazi, MICR gibi şiddetli semptomlar sonuçlanan CMV 10 ile doğarlaroftalmi ve optik sinir atrofisi 11,12. Ayrıca, mental retardasyon, işitme kaybı, görme kusurları, nöbet ve epilepsi olmayan ölümcül CMV ile enfekte bebeklerin 13,14 yaklaşık% 10&#39;unda görülür. MSS disfonksiyonu CMV konjenital anomali en sık görülen karakteristik belirtidir. Daha çocuk kalıcı olarak Down sendromu, fetal alkol sendromu veya spina bifida 15 tarafından daha doğuştan CMV tarafından her yıl devre dışıdır. güvenli ve etkili bir aşı ihtiyacı için çağrıda, şu anda CMV ye karşı hiçbir aşı mevcut. enfeksiyonun erken fazında reseptörleriyle CMV parçacıkların etkileşimi incelemek aşılamanın etkisini anlamak önemlidir. Ventriculoencephalitis ve yaygın mikroglial nodüller CMV iki ana patolojik özellikleri 16 ensefalit vardır. (- 300 nm 150) enfeksiyonu a akut fazında beynin yoluyla yayılan CMV parçacıkları nasıl belirsiz olmuşturnd nasıl hücresel reseptörlerin dağılımı ve virüsler için kendi afinite viral yayılmasına katkıda bulunur. Kawasaki vd. ICV ve parçacıklar ve enfeksiyon en erken aşamasında reseptörleri (β1 integrin) dağılımı açısından IV enfeksiyonları değerlendirilmiştir. CMV parçacıkları ve β1 integrin ekspresyonu yayılması de ICV, IV enfeksiyonlar 8 hem de enfeksiyon en erken aşamasında ilişkili olduğunu bulmuşlardır. ICV enfeksiyonu ventriculoencephalitis bir modeldir ve IV enfeksiyonu yaygın mikroglial nodüllerin bir modeldir. Viral veya floresan parçacıkların dinamiği incelenmesi parçacık boyutu, hücresel reseptörlere viral etkileşimleri ve beyinde BBB penetrasyon mekanizması etkisi hakkında yararlı bilgi verir. Aşağıdaki protokol CNS&#39;de bir viral enfeksiyon ve viral vektör araştırmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&amp;nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% mouse serum</td><td>DAKO&amp;nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICR mouse</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modified Microliter Syringes (7000 Series)</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35-gauge needle</td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer (pH 6) x 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution (50x)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA (10 mg/ml)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glass</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4</td><td>Vector laboratories, Inc.</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&amp;nbsp; Gold</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles and fluorescent microbeads into the neonatal brain

viral ensefalit patogenezinde çalışmada, enfeksiyon yöntemi önemlidir. beyne iki enfeksiyon güzergah birinci endotel hücreleri ve beynin perisitlerin tarafından enfekte kan yoluyla yoldur. İkinci intraserebroventriküler (ICV) yoldur. Bir kez merkezi sinir sistemi (MSS) dahilinde, virüsler beyin omurilik sıvısı yoluyla subaraknoid, meninkslerin ve koroid pleksus yayılabilir. deneysel modellerde, MSS viral dağıtım erken aşamaları iyi karakterize değildir ve sadece belirli hücreler başlangıçta enfekte olup olmadığı bilinmemektedir. Burada, enfeksiyonun akut fazında sitomegalovirüs (CMV) parçacıkların dağılımını analiz ettik, yenidoğan fare beyninin içine ICV veya damar içi (IV) enjeksiyonu takiben, birincil viremi olarak adlandırılan. ICV püskürtme modelinde, fare CMV (MCMV) ya da flüoresan mikro-5 ul midpoi yanal ventrikül içine enjekte edilmiştirnt 27 G iğne ile 10 ul şırınga kullanarak kulak ve göz arasındaki. IV enjeksiyonu modelinde, 35 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanıldı. Bir transillüminator yenidoğan fare yüzeysel zamansal (yüz) damar görselleştirmek için kullanıldı. Biz yüzeysel temporal ven içine MCMV veya floresan mikro-50 ul aşılamıştır. Brain farklı zaman noktalarında Enjeksiyondan sonra toplandı. MCMV genomları in situ hibridizasyon yönteminde kullanılarak tespit edildi. Rekombinant MCMV parçacıkları ifade Floresan mikro-veya yeşil floresan proteini flüoresans mikroskopisi ile tespit edilmiştir. Bu teknikler, ensefalit patogenezini araştırmak için diğer patojenlere uygulanabilir.

viral ensefalit patogenezi ile ilgili çalışmalarda, enfeksiyon yöntemi önemlidir. ICV rota akut enfeksiyon, subaraknoid uzayda BOS yoluyla yayılan meninkslerde ve koroid pleksus ulaşan temsil ederken hematojen yol, endotel hücreleri ve beyin perisitlerin akut enfeksiyon temsil eder. MCMV genom ve M32-EGFP-MCMV parçacıklar veya floresan mikro-doğrudan gözlem tespit in situ hibridizasyon akut ensefalit partiküllerin ilk dağılımını analiz etmek için kullanıldı. Rekombinant MCMV Generation (M32-EGFP-MCMV) protokol M32-GFP-MCMV oluşturulan nasıl rekombinant göstermektedir. EGFP, homolog rekombinasyon ile MCMV genomunda 37.089 ve 41.450 bp&#39;lik (M32-M31 lokus) arasına yerleştirilmiştir. Bir EGFP protein viral protein (M32) ile birleştirilir ve EGFP viral parçacıklar içinde ifade edildi. sınırlayıcı seyreltme enfeksiyonundan kaynaklanan tüm odakları, vahşi tip virüs kaldığını gösteren EGFP ifade görüntülendiğinde, homolog rekombinasyon sonra, virüs preparasyonu saf olarak kabul edildi. Bu rekombinant virüs saflaştırmak için birden fazla seyreltme prosedürlerinin alabilir. Şekil 1A saflaştırılmış rekombinant MCMV (M32-EGFP-MCMV) ait EGFP sinyallerini ve Şekil 1B, viral çekirdek virüs genomunu içeren M32-EGFP-MCMV partiküllerin bir TEM görüntüsü gösterilmektedir . Intraserebroventriküler enjeksiyonu ve damar içi enjeksiyonu Şekil 2 virüs ya da microbeads ICV rota veya IV yoldan enjekte edildi neonatal fare (P 0.5) enjeksiyon siteleri gösterir. ICV, enjeksiyon yeri arasındaki orta olanbir yerde kulak ve göz, yaklaşık 0,7 - Yenidoğan bregma (Şekil 2A) den 1,0 mm kaudal - 1,0 mm sagital sütür ve 0.7 lateral. İğne kafatası yüzeyi (Şekil 2B). Şekil 2C ve 2D dik derin 2 mm, MCMV ve mikro-neonatal farelerde zamansal yüz damar içine enjekte edilir olduğunu göstermektedir yan ventrikül içine enjekte edilmelidir. Bir transillüminator ve büyütücü gözlük açıkça küçük damarları görselleştirmek için yararlı araçlardır. Viral Parçacıklar / Genomlarının ve Floresan mikro boncuklar Dağılımı Aşağıdaki şekiller, viral parçacık / genomları ve akut faz içinde flüoresan mikro-dağılımını göstermektedir. 3 beyin Dondurulmuş kesitlerin mikroboncuk sinyallerini göstermektedir. Şekil 3a ve 3b0.1 dağılımı -., marjinal bölgede 0.3 mikron floresan Nil kırmızısını mikro-(MA) (Şekil 3A) ve koroid pleksus ve subventriküler bölge 2 saat sonra ICV enjeksiyonundan (SVZ) (Şekil 3B) Şekil 3C ve 3D dağılım gösterir 2 saat sonra IV enjeksiyonundan MA ve damar alanı (Şekil 3C) ve koroid pleksus ve SVZ&#39;unda (Şekil 3D) 0,3 mikron floresan Nil kırmızı mikro-- 0.1. ICV, IV enjeksiyonu takiben, partiküller hemen parankimi boyunca eşit olarak yayılmamış, olasıdır. Aksine, onlar akut enfeksiyon aşamasında SVZ&#39;unda, MA, ve vasküler bölgede kaldı. Parçacıkların büyüklüğü ICV ve IV enjeksiyonu takiben akut dönemde beyinde dağılımlarını etkileyen başlıca faktördür. 4 beynin parafin kesitlerinde MCMV genomunun FISH göstermektedir. MCMV genomu (yeşil noktalar) tespit edildi3 saat sonrası ICV enjeksiyonundan SVZ (Şekil 4B). MCMV genomları (yeşil noktalar) 3 saat sonrası IV enjeksiyon (Şekil 4C) de MA ve damar alanda tespit edildi. MCMV (Şekil 4) ve mikro boncuklar (Şekil 3) dağılımı oldukça benzerdir. 5 IV enjeksiyonu takiben beynin donmuş bölümlerinde mikro-boyut-bağımlı dağılım desenleri göstermektedir. 2.2 um (Şekil 5B), 0.1 - - 0.3 um (Şekil 5D) ve 0.04 - çapları 1.7 ile mikro-0.06 um (Şekil 5E), gösterilmiştir. Küçük mikroboncuklarının parenkimde damar alanı dışında ekstravaze gereken bir eğilim vardı. 6 Şekil beynin donmuş bölümlerinde M32-EGFP-MCMV parçacıkların dağılımını göstermektedir. GFP nokta sinyalleri (M32-EGFP-MCMV partiküller) esas olarak, MA (Şekil 6A) gözlenen edildi ve koroid pleksus ve SVZ ( <stro<html> ng&gt; 2 saat sonrası ICV enjeksiyonundan Şekil 6B). MCMV parçacıkları içinde ve parankiminde (Şekil 6C) ve koroid pleksus ve SVZ (Şekil 6D) vasküler alanı dışında bulundu. M32-EGFP-MCMV parçacıklar, vasküler alanın dışına extravagation oranı MA ve koroid pleksus damarları oranla daha geçirgen olduğunu belirten menenjlerin ve beyin parankimi daha koroid pleksus yüksekti parankim. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54164/54164fig1.jpg" /> Şekil 1:. Rekombinant M32-EGFP-MCMV (A) ultra santrifüje M32-EGFP-MCMV partiküllerin üretimi flüoresan mikroskopi ile yeşil noktalar olarak görülmektedir. Ölçü bar:. 2.4 um (B), transmisyon elektron mikroskopisi M32-EGFP-MCMV parçacıklar tipik virüs yapısına sahip olduklarını ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu: 77 nm.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54164/54164fig2.jpg" /> Şekil 2: Yenidoğan fare enjeksiyon siteler. 5 ul MCMV (yaklaşık 5 × 10 5 PFU) ya da (yaklaşık 5.75 × 10 9 parçacıklar) 5 ul mikro boncuklar (A, B) ICV enjeksiyonu. (A) enjeksiyon yerinde de (kulak ve göz arasındaki orta noktada olduğunu 1,0 mm sagital sütür ve 0.7 yanal - - ​​yaklaşık 0,7 bir konum. yenidoğan bregmadan 1,0 mm kaudal) (B) 10-ul şırınga ile 27 G iğne, lateral ventrikül içine enjeksiyon için 2 mm derinliğinde kullanılır kafatası yüzeyi dik. (C, D) MCMV ve mikro-neonatal farelerde zamansal yüz damarına enjekte edilir. (C) </strong&gt; transillüminator (ven bulucu) yüzeysel zamansal (yüz) ven görselleştirmek için kullanılır. 35 G iğne ile (D) A 1 ml&#39;lik şırınga MCMV IV enjeksiyonu gerçekleştirmek için kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54164/54164fig3.jpg" /> . Şekil 3: Beyindeki Floresan Nile Red mikro-görselleştirilmesi (A, B) 0.1 - (kırmızı) 2 saatte MA (A) ve koroid pleksus ve SVZ&#39;unda (B) gözlenen 0.3 mikron floresan Nil kırmızısını mikro-sinyalleri Mesajı ICV enjeksiyonu (C, D) 0,1 -. 2 saat sonra enjeksiyonda IV enjeksiyon yoluyla yenidoğan fare beyninin içine 0.3 mikron floresan Nil kırmızı mikroboncuklar. Nil kırmızı mikroboncuklarının inci gözlenmektedire MA ve damar alanı (C) ve koroid pleksus ve SVZ (D). Beyaz kare (D) sağ üst genişlemiş prospektüste büyütülmüş (A, C) Ölçek çubuğu:. 50 mikron (B, D) Ölçek çubuğu:. 150 mikron. Oklar Nil kırmızı mikrobilyeleri gösteriyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54164/54164fig4.jpg" /> Şekil 4: ICV Enjeksiyon ve IV Enjeksiyon sonrasında Fare Beyin MCMV Genom Dağılımı (A) alt büyütme görünümü.. Büyütülmüş görüntü (B) yakalandı nerede beyaz kare gösterir. (B) MCMV genom (yeşil noktalar) ilk 3 saat sonrası ICV enjeksiyonundan SVZ&#39;unda tespit edilir. DAPI (4 &#39;,, 6-diamidino-2-fenilindol) Nükleer asit (nükleer) boyama için kullanılır. Ölçek çubuğu:. 30 mikron (C) MCMV genom (yeşil noktalar) 12 saat sonrası IV enjeksiyon damar alan ve meninkslerde tespit edilir. DAPI çekirdek asit boyama için kullanılır. Ölçek çubuğu: 30 mikron. Oklar temsilcisi MCMV genomunu (yeşil noktalar) göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54164/54164fig5.jpg" /> Şekil 5:. Mikro boncuklar Çapı ve mikro boncuklar Dağılımı Arasındaki İlişki Floresan Nil kırmızı mikro boncuk (50 ul) IV enjeksiyonu ile yenidoğan fare beyinleri sokulur. Dondurulmuş bölümlerde ve vascul etrafında gözlenmektedir 2 saat sonrası enjeksiyon (oklarla gösterilen kırmızı) Nil kırmızı sinyaller hazırlananparankim ar alanı. . Vasküler alan floresan lektin (yeşil) (A, B) 1,7 ile lekeli -. 2.2 mikron mikro boncuklar (A) alt büyütme görünümü. Beyaz kare büyütülmüş görüntü (B) yakalandı nerede olduğunu gösterir (B) beyaz kare (B) sağ üst genişlemiş insert olarak büyütülür (C, D) 0,1 -... 0.3 mikron mikro boncuk (C) alt büyütme görünümü. Beyaz kare büyütülmüş görüntü (D) yakalandı nerede olduğunu gösterir (D) beyaz kare (D) sağ üst genişlemiş insert olarak büyütülür (E, F) 0.04 -... 0.06 mikron mikro boncuk (E) alt büyütme görünümü. Beyaz kare büyütülmüş görüntü (F) yakalandı nereye gösterir. (F) beyaz kare sağ üst genişlemiş insert olarak büyütülür <strong&gt; (F). Ölçek çubuğu: 8 mikron. Oklar temsilcisi mikrobilyeleri (kırmızı lekeler) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54164/54164fig6.jpg" /> Şekil 6: Akut Enfeksiyon Aşamada Virüs Parçacıkların Gözlem. (A, B) EGFP nokta sinyalleri (M32-EGFP-MCMV partiküller) esas MA gözlenmiştir (oklarla gösterilen A), koroid pleksus ve SVZ (oklarla gösterilen, B) 2 saat post ICV enjeksiyonundan. Beyaz kareler (A) ve (B) sağ üst genişlemiş ekler olarak büyütülmüş. Ölçü bar:. 20 uM (C, D) 3 saat sonra, IV enjeksiyonu olarak, (oklarla gösterilen yeşil) MCMV parçacıklar vasküler alanı içinde ve dışında bulunanparankima (C), koroid pleksus ve SVZ (d) (kırmızı: CD31-pozitif hücreler). Beyaz kareler (C) ve (D) sağ üst genişlemiş ekler olarak büyütülmüş. Ölçek çubuğu:. 20 mikron <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54164/54164fig6large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain at JoVE.com

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

intracerebroventricular-intravascular-injection-viral-particles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K Görüntüleme.  Hamamatsu University School of Medicine. Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization. 

Video: Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Nörobilim

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most often results in failure of potential therapeutics designed for neurodegenerative disorders 1,2. Neurodegenerative diseases such as Spinal Muscular Atrophy (SMA), in which the lower motor neurons are affected, can benefit greatly from introducing the therapeutic agents into the CNS. The purpose of this video is to demonstrate two different injection paradigms to deliver therapeutic materials into neonatal mice soon after birth. One of these methods is injecting directly into cerebral lateral ventricles (Intracerebroventricular) which results in delivery of materials into the CNS through the cerebrospinal fluid 3,4. The second method is a temporal vein injection (intravenous) that can introduce different therapeutics into the circulatory system, leading to systemic delivery including the CNS 5. Widespread transduction of the CNS is achievable if an appropriate viral vector and viral serotype is utilized. Visualization and utilization of the temporal vein for injection is feasible up to postnatal day 6. However, if the delivered material is intended to reach the CNS, these injections should take place while the blood brain barrier is more permeable due to its immature status, preferably prior to postnatal day 2. The fully developed blood brain barrier greatly limits the effectiveness of intravenous delivery. Both delivery systems are simple and effective once the surgical aptitude is achieved. They do not require any extensive surgical devices and can be performed by a single person. However, these techniques are not without challenges. The small size of postnatal day 2 pups and the subsequent small target areas can make the injections difficult to perform and initially challenging to replicate.

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular ICV and Intravenous IV Injection in Mice

This article demonstrates two very different methods of injection: 1) into the brain (intracerebroventricular) and 2) systemic (intravenous) to introduce the therapeutic agents into the central nervous system of neonatal mice.

Fare intraserebroventriküler sayesinde Terapötik Ajanlar teslimi (ICV) ve intravenöz (IV) Enjeksiyon

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most ...

Tıp

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Genetik

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Kullanımı<em&gt; In vivo</em&gt; Görüntüleme Yenidoğanlar Deneysel Fare Sitomegalovirüs Enfeksiyon ilerleme Monitör

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly and additional brain abnormalities. However, the mechanism underlying the pathogenesis of ZIKV in the developing brain remains unclear. Intracerebral surgical methods are frequently used in neuroscience research to address questions about both normal and abnormal brain development and brain function. This protocol utilizes classical surgical techniques and describes methods that allow one to model ZIKV-associated human neurological disease in the mouse nervous system. While direct brain inoculation does not model the normal mode of virus transmission, the method allows investigators to ask targeted questions concerning the consequence after ZIKV infection of the developing brain. This protocol describes embryonic, neonatal, and adult stages of intraventricular inoculation of ZIKV. Once mastered, this method can become a straightforward and reproducible technique that only takes a few hours to perform.

Here we describe a method for establishing a model of Zika virus-induced microcephaly in mouse. This protocol includes methods for embryonic, neonatal, and adult-stage intracerebral inoculation of the Zika virus.

İntraserebral enjeksiyon stratejileri kullanarak Zika virüs kaynaklı nörolojik bozukluklar için fare modelleri oluşturma: embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

Yenidoğan Farelerde intravenöz enjeksiyonlar

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Biyoloji

Yenidoğan farelerde intratekal enjeksiyonların uygulanması için kapsamlı bir protokol

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and treatments. By directly delivering medications and treatments into the cerebrospinal fluid of the central nervous system, this method achieves higher localized drug concentrations while reducing systemic side-effects compared to other routes such as intravenous, subcutaneous, or intramuscular injections. Its importance extends beyond clinical settings, as intrathecal injection plays a vital role in preclinical studies focused on treating neurogenetic disorders in rodents and other large animals, including non-human primates. However, despite its widespread application, intrathecal injection in young, particularly neonatal pups, poses significant technical challenges due to their small size and fragile nature. Successful and reliable administration of intrathecal injections in newborn mice requires meticulous attention to detail and careful consideration of various factors. Thus, there is a crucial need for a standardized protocol that not only provides instructions but also highlights key technical considerations and good laboratory practices to ensure procedural consistency, as well as the safety and welfare of the animals.
To address this unmet need, we present a detailed and comprehensive protocol for performing intrathecal injections specifically in newborn pups on postnatal day 1 (P1). By following the step-by-step instructions, researchers can confidently perform intrathecal injections in neonatal pups, enabling the accurate delivery of drugs, antisense oligos, and viruses for gene replacement or genome editing-based treatments. Furthermore, the importance of adhering to good laboratory practices is emphasized to maintain the well-being of animals and ensure reliable experimental outcomes. This protocol aims to address the technical challenges associated with intrathecal injections in neonatal mice, ultimately facilitating advances in the field of neurogenetic research that aims to develop potential therapeutic interventions.

Yazar Spotlight: İntratekal Enjeksiyon - Yenidoğan Fare Beyinlerinde Gen Düzenlemenin Etkinliğini Test Etmek İçin Verimli ve Güvenilir Bir Dağıtım Yöntemi

The present protocol outlines step-by-step instructions for performing intrathecal injections in neonatal mice for gene editing and drug delivery.

Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...

Yenidoğan Beyin içine Viral Parçacıklar ve Floresan mikro boncuklar intraserebroventriküler ve İntravasküler Enjeksiyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Fare intraserebroventriküler sayesinde Terapötik Ajanlar teslimi (ICV) ve intravenöz (IV) Enjeksiyon

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Kullanımı

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

İntraserebral enjeksiyon stratejileri kullanarak Zika virüs kaynaklı nörolojik bozukluklar için fare modelleri oluşturma: embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin

Yenidoğan Farelerde intravenöz enjeksiyonlar

Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu

Genom Düzenleme ve İlaç Dağıtımı için Yenidoğan Farenin İntratekal Enjeksiyonu