The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Animal Care di Hamamatsu University of School of Medicine. 1. Preparazione del MCMV (ceppo Smith) e ricombinante M32-enhanced proteina fluorescente verde (EGFP) -MCMV <ol><li> Generare ricombinante M32-EGFP-MCMV secondo il metodo come segue (1,2 - 1.9) e come precedentemente descritto 8. </li><li> Utilizzare i virus ricombinanti derivati ​​dal ceppo Smith di wild-type MCMV (numero adesione: U68299). Inserire EGFP (4.361 coppie di basi; bp) tra 37.089 e 41.450 bp (M32 - M31 locus) nel genoma MCMV per ricombinazione omologa. </li><li> Amplifica per reazione a catena della polimerasi del MCMV M32 (41.450 - 39.286 bp, a sinistra fiancheggiante sequenza e M31 (37.089 - 39.246 bp, fiancheggiante destra gene sequenza loci utilizzando i seguenti primer: M32, 5&#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(primer forward), 5 &#39;-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3 &#39;(Primer reverse); M31, 5&#39;-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3&#39; (primer forward), 5&#39;-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3 &#39;(primer reverse). </li><li> Inserire il locus M32 nel vettore EGFP che esprimono utilizzando NheI e BamHI siti di restrizione. Inserire il locus M31 nella M32-EGFP -recombinant plasmide utilizzando siti AflII e XbaI. Fendere l&#39;M32 - EGFP - sequenza M31 con NheI e AflII dalla M32 - EGFP - M31 ricombinazione plasmide e sciogliere in H 2 O. </li><li> Trasfezione il costrutto spaccati in nuclei di MCMV (Smith ceppo) -infected cellule NIH3T3 24 ore dopo l&#39;infezione (HPI), utilizzando un sistema di elettroporazione per indurre ricombinazione omologa. </li><li> A 3 giorni dopo l&#39;infezione, co-coltura le cellule con il mouse non infetti fibroblasti embrionali (MEF) in un rapporto di 1 / 1.000 in sei pozzetti e schermo per focolai EGFP che esprimono delle cellule infette. </li><li> harvest il surnatante contenente il virus, dai pozzetti contenenti fuochi fluorescente verde e diluire dieci volte. Per la depurazione, scegliere pozzi che visualizzano singoli focolai fluorescenti verdi. </li><li> Quando tutto focolai derivante dalla limitazione diluizione visualizzazione infezione espressione EGFP, la preparazione virus è puro, che indica che nessun virus wild-type rimane. Quantificare il virus con il metodo placca-test come descritto in precedenza 17. </li><li> Trattare MCMV in cappe di sicurezza biologica certificata a livello di biosicurezza 2 indossando guanti e maschera. </li><li> Passaggio MCMV (Smith ceppo) e MCMV ricombinante in MEF preparati da 12 giorni di età embrioni di topo ICR come precedentemente descritto 17. </li><li> Rimuovere le cellule dai supernatanti delle colture infette MEF per centrifugazione a 3.000 × g per 20 minuti a 16 ° C. </li><li> Ultracentrifuga il surnatante per 40 min a 70.000 × g. Risospendere il pellet contenenti virioni in 1 ml di soluzione salina tamponata con Tris e trasferire su una s lineare preformatoorbitol pendenza (25% - 70%). Ultracentrifuga di nuovo a 70.000 x g per 60 min 18. </li><li> Raccolto il gruppo virione contenente con una siringa. Pellet virioni raccolte da un passo ultracentrifugazione supplementare a 70.000 g per 40 min. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) e conservare a -80 ° C fino agli esperimenti di infezione. </li><li> Quantificare il titolo del virus dal metodo placca test come descritto in precedenza 19. </li><li> Visualizza l&#39;espressione EGFP delle particelle MCMV ricombinanti (eccitazione a 489 nm, emissione a 508 nm) mediante microscopia a fluorescenza (Figura 1A) e la struttura delle particelle mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 8 (Figura 1B). </li></ol> 2. Preparazione di microperle Nile Red fluorescenti <ol><li> Acquisto carbossilico fluorescente Nilo microsfere rosso e posto 500 ml di microsfere in tubi in base al diametro (0,04- 0,06 micron, circa 3,63 × 10 12 particelle; 0,1 - 0,3 mm, circa 5,75 × 10 10 particelle; e 1,7-2,2 micron, circa 6,85 × 10 7 particelle). </li><li> Trattare perline con 500 ml di 0,1 M NaOH per circa 1 giorno per rimuovere eventuali endotossine e risospendere le sfere in acqua sterile a temperatura ambiente. </li><li> Adsorbire le perline O / N con siero di topo 10% ottenuta da topi C57BL / 6 a RT prima dell&#39;uso. </li><li> Per separare gli aggregati, vortice le perline e sonicare bene prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. ICV Iniezione di MCMV e fluorescenti microperle in topi neonati <ol><li> Mantenere normali topi in gravidanza ICR in un impianto a temperatura controllata nell&#39;ambito di un ciclo di 12 ore luce / buio. I neonati sono designati come P 0,5 il giorno della nascita. </li><li> Sterilizzare una siringa da 10 microlitri e un ago 27 G con il 70% di alcol. </li><li> Caricare la soluzione di iniezione (5 ml) contenente MCMV o micro fluorescentein perle dell&#39;ago tirando con attenzione lo stantuffo della siringa. </li><li> Trattenere il mouse neonatale (P 0.5) mettendo il mouse sul ghiaccio per 3 - 4 minuti. Una volta che l&#39;animale è sotto anestesia, utilizzare il metodo di risposta toe-pinch per determinare la profondità dell&#39;anestesia. </li><li> Mark il sito di iniezione con una penna di laboratorio non tossico in una posizione circa 0,7 - 1,0 millimetri lateralmente alla sutura sagittale e 0.7 - 1,0 millimetri caudale dalla neonatale bregma (Figura 2A). </li><li> Inserire l&#39;ago 2 mm di profondità, perpendicolare alla superficie del cranio al sito di iniezione marcata. Per riferimento, segnare 2 mm dalla punta dell&#39;ago con un produttore non tossico. </li><li> Lentamente iniettare 5 ml di MCMV (circa 5 × 10 5 PFU) nel ventricolo laterale senza aprire il cuoio capelluto (Figura 2B). </li><li> In un altro gruppo di topi, iniettare una soluzione 5 ml contenente microsfere fluorescenti (0,1 - 0,3 mm, circa 5,75 × 10 8 particelle) dalo stesso metodo. </li><li> Lentamente rimuovere l&#39;ago 10 - 20 secondi dopo aver sospeso il movimento del pistone per impedire il riflusso. </li><li> Per recuperare, mantenere i topi per 5 - 10 minuti in un contenitore caldo fino a quando il movimento e la reattività generale vengono ripristinati. </li><li> Raccolto il cervello come descritto nella sezione 5 in una serie di punti di tempo (3, 12, 24, 48, e 72 ore) dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 4. IV Iniezione di MCMV o fluorescenti microperle in topi neonati <ol><li> Trattenere il mouse neonatale (P 0.5) mettendo il mouse sul ghiaccio per 3 - 4 minuti. </li><li> Utilizzare una siringa da 1 ml con un ago 35 G per eseguire l&#39;iniezione endovenosa di MCMV in P 0,5 neonati. </li><li> Utilizzare un transilluminatore (vena finder) per visualizzare il temporale vena superficiale (del viso). Prima dell&#39;iniezione, fissare il neonato al transilluminatore con del nastro chirurgico (Figura 2C). </li><li> Mentre indossa lenti d&#39;ingrandimento (1.5X), infondere lentamente 50 ml di MCMV (circa 5,45 ×; 10 9 particelle) o microsfere fluorescenti (0,04 - 0,06 micron, circa 3,63 × 10 11 particelle; 0,1 - 0,3 micron, circa 5,75 × 10 9 particelle e 1,7 - 2,2 micron, circa 6,85 × 10 6 particelle) nella vena temporale superficiale (Figura 2D). </li><li> Dopo aver rimosso l&#39;ago, usare una garza contenente il 70% di alcool per esercitare una pressione al sito di iniezione fino a quando l&#39;emorragia cessa. </li><li> Dare il neonato di circa 5 minuti in un contenitore caldo per recuperare prima di tornare alla gabbia. </li><li> Raccogliere il cervello come descritto nel capitolo 5 in una serie di punti di tempo (3, 12, 24, e 72 hr) dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 5. Cervello preparazione dei tessuti del campione per le sezioni di paraffina <ol><li> Mettere i neonati iniettati in un piccolo piatto di plastica su ghiaccio tritato. </li><li> Una volta che l&#39;animale è sotto anestesia, utilizzare il metodo di risposta in punta pizzico per determinare la profondità di anesthesia. </li><li> Fare uno tagli centrali o due estremità orizzontali estremità attraverso la gabbia toracica per aprire la cavità toracica. </li><li> Fare un taglio nell&#39;atrio con forbici affilate. Infondere 4% paraformaldeide soluzione (PFA) nell&#39;atrio. Smettere di perfusione quando si osservano movimento spontaneo (PFA danza) e alleggerito-colore del fegato. Non Exsanguinate. </li><li> Sezionare il neonato (come descritto in precedenza 20) rimuovendo prima testa con un paio di forbici. </li><li> Effettuare una incisione sulla linea mediana lungo il tegumento dal collo al naso per esporre il cranio. </li><li> Posizionare la punta di un paio di forbici iris nel foro occipitale su un lato, con attenzione scorrevole lungo la superficie interna del cranio. </li><li> Fare un taglio che si estende fino al margine posteriore della superficie posteriore del cranio, e fare un taglio identico sul lato controlaterale. Sgombrare il cranio intorno al cervelletto. </li><li> sbucciare indietro con cautela il cranio su un lato per evitare danni al cervello. ripetere questaprocedura sull&#39;altro lato del cervello. </li><li> Utilizzando una spatola, recidere i bulbi olfattivi e connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello. </li><li> separare delicatamente il cervello dalla testa, tagliare qualsiasi dura che collegano ancora il cervello al cranio con le forbici, e rimuovere il cervello. </li><li> Posizionare il cervello in una fiala di fissativo contenente 4% PFA almeno 10 volte il volume del cervello per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Disidratare il tessuto attraverso una serie di bagni di etanolo graduate per spostare l&#39;acqua, e poi infiltrarsi paraffina, formando un blocco. Tagliare il blocco di paraffina con un microtomo fettine 4 micron di spessore 21. </li><li> Deparaffinare e reidratare le diapositive dei cervelli infetti 22. Procedere alla ibridazione in situ per le sezioni paraffina. </li></ol> 6. Cervello preparazione dei tessuti campione per sezioni congelate <ol><li> Rimuovere il cervello seguendo la procedura descritta in 5,1-5,11. </li><li> Per osservare le microsfere fluorescenti e M32-EGFP-MCMV, posizionare il cervello asportato il cryomolds fondo piatto. Aggiungere mezzo di inclusione per coprire completamente i campioni cervello. Snap congelare i cryomolds in n esano pre-raffreddata (-80 ° C), con pinze per tenere il bordo delle cryomolds prima di collegarlo al mandrino. </li><li> Per il sezionamento, collegare il blocco di tessuto congelato sul mandrino criostato pre-raffreddata. Trasferire il tessuto congelato con il mandrino in una camera criostato e abbassare la temperatura fra -10 e -20 ° C, e tagliare le fette di circa 8 - 10 micron di spessore 23. </li><li> Fissare le sezioni con cytofixative (miscela di alcool isopropilico e polietilenglicole) mediante spruzzatura. Far asciugare le sezioni per 30 minuti a temperatura ambiente subito dopo la spruzzatura, e conservarli a - 80 ° C fino a nuovo uso. </li><li> Equilibrare sezioni torna a RT e lavare tre volte con PBS. </li><li> Macchiare le sezioni con fluoresceina isotiocianato (FITC) coniugata Griffonia simplicifolia isolectin B4 ad una concentrazione di 1: 100 per 10 minuti in PBS a RT (Figura 5) o con l&#39;anticorpo CD31 PE-coniugato ad una concentrazione di 1: 100 per 30 minuti in PBS a RT (Figura 6). </li><li> Lavare le sezioni con PBS per tre volte. </li><li> Dopo il lavaggio, macchiare sezioni con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per visualizzare nuclei cellulari. Montare le sezioni in anti-sbiadimento reagente e immagine DAPI (eccitazione a 345 nm, emissione a 455 nm), EGFP (eccitazione a 489 nm, emissione a 508 nm), e del Nilo rosso (eccitazione a 553 nm, emissione a 637 nm) con un microscopio a fluorescenza (figure 3, 5, 6). </li></ol> 7. ibridazione in situ fluorescente (FISH) per paraffina Sezioni <ol><li> Preparare la sonda FISH etichettato direttamente con fluoroforo per il DNA ibridazione in situ da traduzione nick utilizzando un cromosoma artificiale batterico contenente l&#39;intero DNA MCMV genome (pSM3fr) 19. La concentrazione della sonda FISH è di 0,1 mg / mL. </li><li> Deparaffinare e reidratare le diapositive dei cervelli infetti 22. </li><li> Trattare le sezioni di tessuto con RNasi (100 ug / ml in PBS) per rilevare il DNA virale. </li><li> Eseguire recupero dell&#39;antigene con un NP40 0,05%, 0,01 M tampone citrato (pH 6,0) a 95 - 98 ° C per 20 min. Raffreddare le diapositive fino a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> In una vaschetta di colorazione di vetro Coplin, lavare i vetrini in acqua pura tre volte per 2 minuti ogni volta. Eseguire un passo antigene recupero supplementare con un pepsina 0,06%, 0,01 soluzione N HCl per 5 min a 37 ° C. </li><li> Sciacquare i vetrini tre volte in acqua pura per 2 minuti ogni volta in un barattolo di pittura su vetro Coplin. </li><li> Disidratare le sezioni di tessuto nuovo trasferendo i vetrini dal 70% di etanolo, 85% di etanolo, e poi a 100% di etanolo. </li><li> Per la preparazione di 10 ml di tampone di ibridazione, mescolare 1,25 ml di sali di ibridazione in situ (3 M di NaCl, 100 mM Tris-HCl PH 8.0, 100 mM sodio fosfato pH 6,8, 50 mM EDTA) con 5 ml formammide deionizzata, 2,5 ml 50% di solfato di destrano, 250 microlitri 50x soluzione di Denhardt, 125 microlitri di 100 mg / ml tRNA, e 875 microlitri H 2 O. </li><li> Diluire la sonda di DNA marcata direttamente con fluorofori che riconoscono l&#39;intero genoma MCMV casualmente nel buffer di ibridazione. Il volume finale deve essere di 10 microlitri (tampone di ibridazione 7 microlitri, sonda 1 ml (0,1 mg / mL), e 2 ml di acqua distillata). </li><li> Aggiungere il mix di sonda (10 ml) per ogni diapositiva e coprire con un coprioggetto (15 × 15 mm). Sigillare il coprioggetto con mastice. Denaturare il mix della sonda per 5 minuti a 85 ° C, e completare la fase di ibridazione O / N a 42 ° C. </li><li> Lavare i vetrini con lo 0,3% NP40, SSC 0.4x a 73 ° C per 2 min; con 0,1% NP40, 0.4x SSC a 73 ° C per 1 min; e con 2x SSC due volte. </li><li> Controcolorare i nuclei con DAPI (10 ng / ml) e coprire il vetrino con un coprioggetto. </li><li> Montaresezioni a anti-sbiadimento reagente e DAPI immagine (eccitazione a 345 nm, emissione a 455 nm) e EGFP (eccitazione a 489 nm, emissione a 508 nm) con un microscopio a fluorescenza (Figura 4). </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cardiomyocyte+development+using+immunofluorescence+in+embryonic+mouse+heart.">Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+and+intravenous+deliveries+are+not+comparable+in+terms+of+drug+efficacy+and+cell+distribution+in+neonatal+mice+with+hypoxia-ischemia.">Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia.</a> Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).</li><li>Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebroventricular+viral+injection+of+the+neonatal+mouse+brain+for+persistent+and+widespread+neuronal+transduction.">Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction.</a> J Vis Exp. (91), e51863 (2014).</li><li>Glascock, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+therapeutic+agents+through+intracerebroventricular+(ICV)+and+intravenous+(IV)+injection+in+mice.">Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In modelli animali, ICV, intraperitoneale, placentare diretta e infezioni IV sono stati utilizzati per studiare la patogenesi di encefalite virale. Ci siamo concentrati sui modelli ICV ed iniezione IV di topi neonatale per la semplicità delle procedure e il beneficio di iniezione diretta di particelle nella regione di destinazione. Anche se l&#39;infezione intraperitoneale è un metodo facile, particelle virali diffuse sistemica attraverso un processo indiretto 5,24. un&#39;infezione placentare Direct è un ...

Studiando encefalite virale, la distribuzione iniziale di particelle virali è molto importante per comprendere patogenesi della malattia e per identificare bersagli virali nel cervello. Maggior parte dei virus variano in dimensioni da 20 a 300 nm, sebbene il pandoravirus è superiore a 700 nm di dimensione 1. La distribuzione delle particelle virali in fase acuta dell&#39;infezione può dipendere dalla dimensione delle particelle, la distribuzione dei recettori cellulari, o l&#39;affinità dei recettori cellulari di virus. In modelli animali, intracerebroventricolare (ICV), intraperitoneale, placentari diretta, e per via endovenosa (IV) le infezioni sono state usate per studiare la patogenesi di encefalite virale. ICV inoculazione con il virus viene spesso utilizzato per stabilire le infezioni del sistema nervoso centrale (CNS) nei topi. Gli studi che utilizzano questa tecnica riportano infezione diffusa, in particolare delle cellule nelle zone periventricolari e nelle regioni del cervello in diretto contatto con il liquido cerebrospinale (CSF), similar agli effetti ventriculoencephalitis virale. Le piccole dimensioni del virus adeno-associato (AAV) particelle (20 - 25 nm di diametro) facilita la loro diffusione in tutto il cervello nelle infezioni ICV 2-4. Intraperitoneale 5, placentari diretta 6, e IV iniezioni 7 rappresentano la somministrazione sistemica hematogenic. La penetrazione delle particelle virali attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) ​​consente di raggiungere il parenchima cerebrale neonatale, rappresentando diffuse noduli microgliali 8,9. Citomegalovirus (CMV) è un virus comune che appartiene alla famiglia herpes virus. Negli Stati Uniti, il 50% - 80% delle persone hanno avuto infezione da CMV per età 40. infezioni da CMV raramente sono dannosi, ma possono causare malattie nei pazienti immunocompromessi e feti. Di tutte le consegne, 0,2% - 2% sono nati con CMV 10, con conseguente sintomi gravi, come la microcefalia, calcificazioni periventricolare, ipoplasia cerebellare, microftalmia, e del nervo ottico atrofia 11,12. Inoltre, il ritardo mentale, sordità neurosensoriale, difetti visivi, convulsioni ed epilessia si verificano in circa il 10% dei non-fatalmente neonati CMV-infettati 13,14. CNS erettile è il sintomo caratteristico più comune di CMV anomalia congenita. Più i bambini sono permanentemente disabilitati ogni anno da CMV congenito che da sindrome di Down, la sindrome alcolica fetale, o spina bifida 15. Non ci sono vaccinazioni contro CMV disponibile al momento attuale, chiedendo la necessità di un vaccino sicuro ed efficace. Studiando l&#39;interazione di particelle CMV con i loro recettori nella primissima fase di infezione è importante capire l&#39;effetto della vaccinazione. Ventriculoencephalitis e noduli microgliali diffuse sono le due principali caratteristiche patologiche di CMV Encefalite 16. E &#39;stato chiaro come le particelle CMV (150 - 300 nm) diffondono attraverso il cervello nella fase acuta dell&#39;infezione unnd come la distribuzione dei recettori cellulari e la loro affinità per i virus contribuiscono alla diffusione virale. Kawasaki et al. Hanno valutato ICV e IV infezioni dal punto di vista della distribuzione delle particelle e dei loro recettori (β1 integrine) nella fase più antica di infezione. Abbiamo scoperto che la diffusione di particelle CMV e l&#39;espressione di β1 integrina sono ben correlata nella primissima fase di infezione sia ICV e le infezioni IV 8. infezione ICV è un modello di ventriculoencephalitis e l&#39;infezione IV è un modello di noduli microgliali diffuse. Studiando le dinamiche di particelle virali o fluorescenti darebbe utili informazioni sull&#39;effetto della dimensione delle particelle, interazioni virali con recettori cellulari, e il meccanismo di penetrazione BBB nel cervello. Il seguente protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare qualsiasi infezione virale e vettore virale nel SNC.

<table><tbody><tr><td>Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6791</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1758</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 vector&amp;nbsp;</td><td>Clontech</td><td>#6085-1</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1876</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04 - 0.06</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-00556-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1 - 0.3</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>FP-0256-2</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7 - 2.2</td><td>Spherotech, inc.&amp;nbsp;</td><td>FP-2056-2</td><td></td></tr><tr><td>10% mouse serum</td><td>DAKO&amp;nbsp;</td><td>X0910</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICR mouse</td><td>SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modified Microliter Syringes (7000 Series)</td><td>Hamilton company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35-gauge needle</td><td>Saito Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A Wee Sight Transilluminator</td><td>Phillips Healthcare</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet(R) P-40</td><td>Nacalai</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer (pH 6) x 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>dojindo</td><td>N001</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>TCI</td><td>F0045</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867-5G</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution (50x)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>750018</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA (10 mg/ml)</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>SSC 20x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus glass</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>12-55-18</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeep II</td><td>Nippon Shoji Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4</td><td>Vector laboratories, Inc.</td><td>L1104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE</td><td>ebioscience</td><td>12-0311</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&amp;nbsp; Gold</td><td>ThermoFishcer sceintific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>BIOREVO</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000E</td><td></td></tr></tbody></table>

intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles and fluorescent microbeads into the neonatal brain

Nello studio sulla patogenesi di encefalite virale, il metodo infezione è critica. La prima delle due principali vie infettive al cervello è la via ematogena, che coinvolge l&#39;infezione delle cellule endoteliali e periciti del cervello. Il secondo è il intracerebroventricolare (ICV) percorso. Una volta all&#39;interno del sistema nervoso centrale (CNS), i virus possono diffondersi nello spazio subaracnoideo, meningi, e plesso coroideo attraverso il fluido cerebrospinale. In modelli sperimentali, le prime fasi di distribuzione virale del sistema nervoso centrale non sono ben caratterizzati, e non è chiaro se solo alcune cellule infettate sono inizialmente. Qui, abbiamo analizzato la distribuzione del citomegalovirus (CMV) particelle durante la fase acuta dell&#39;infezione, chiamato viremia primaria, seguendo ICV o intravascolare (IV) iniezione nel cervello neonatale mouse. Nel modello di iniezione ICV, 5 ml di murino CMV (MCMV) o microsfere fluorescenti sono stati iniettati nel ventricolo laterale al midpoint tra l&#39;orecchio e l&#39;occhio utilizzando una siringa da 10 microlitri con un ago 27 G. Nel modello di iniezione IV, è stata utilizzata una siringa da 1 ml con un ago 35 G. Un transilluminatore stato usato per visualizzare temporale (facciale) vena superficiale del mouse neonatale. Abbiamo infuso 50 ml di MCMV o microsfere fluorescenti nella vena temporale superficiale. Brains sono state raccolte in diversi momenti dopo l&#39;iniezione. Genomi MCMV sono stati rilevati utilizzando il metodo di ibridazione in situ. microsfere fluorescenti o proteina verde fluorescente che esprimono particelle MCMV ricombinanti sono stati osservati al microscopio a fluorescenza. Queste tecniche possono essere applicate a molti altri patogeni per studiare la patogenesi di encefalite.

In studi sulla patogenesi di encefalite virale, il metodo infezione è importante. Il percorso ematogena rappresenta un&#39;infezione acuta delle cellule endoteliali e periciti del cervello, mentre il percorso ICV rappresenta un&#39;infezione acuta diffondere attraverso il CSF attraverso lo spazio subaracnoideo, raggiungendo le meningi e del plesso coroide. Per analizzare la prima distribuzione di particelle in encefalite acuta, ibridazione in situ rilevare i genomi MCMV e l&#39...

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Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Intracerebroventricular e intravascolare Iniezione di Viral particelle e fluorescenti microperle nel cervello neonatale

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.2K Views.  Hamamatsu University School of Medicine. Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization. 

Video: Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Ricerca

Neuroscienze

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most often results in failure of potential therapeutics designed for neurodegenerative disorders 1,2. Neurodegenerative diseases such as Spinal Muscular Atrophy (SMA), in which the lower motor neurons are affected, can benefit greatly from introducing the therapeutic agents into the CNS. The purpose of this video is to demonstrate two different injection paradigms to deliver therapeutic materials into neonatal mice soon after birth. One of these methods is injecting directly into cerebral lateral ventricles (Intracerebroventricular) which results in delivery of materials into the CNS through the cerebrospinal fluid 3,4. The second method is a temporal vein injection (intravenous) that can introduce different therapeutics into the circulatory system, leading to systemic delivery including the CNS 5. Widespread transduction of the CNS is achievable if an appropriate viral vector and viral serotype is utilized. Visualization and utilization of the temporal vein for injection is feasible up to postnatal day 6. However, if the delivered material is intended to reach the CNS, these injections should take place while the blood brain barrier is more permeable due to its immature status, preferably prior to postnatal day 2. The fully developed blood brain barrier greatly limits the effectiveness of intravenous delivery. Both delivery systems are simple and effective once the surgical aptitude is achieved. They do not require any extensive surgical devices and can be performed by a single person. However, these techniques are not without challenges. The small size of postnatal day 2 pups and the subsequent small target areas can make the injections difficult to perform and initially challenging to replicate.

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular ICV and Intravenous IV Injection in Mice

This article demonstrates two very different methods of injection: 1) into the brain (intracerebroventricular) and 2) systemic (intravenous) to introduce the therapeutic agents into the central nervous system of neonatal mice.

Consegna di agenti terapeutici attraverso intracerebroventricolare (ICV) e per via endovenosa (ev) nei topi

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most ...

Medicina

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Genetica

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Uso di<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging per monitorare la progressione della Sperimentale mouse infezione da citomegalovirus nei neonati

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Immunologia e infezioni

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly and additional brain abnormalities. However, the mechanism underlying the pathogenesis of ZIKV in the developing brain remains unclear. Intracerebral surgical methods are frequently used in neuroscience research to address questions about both normal and abnormal brain development and brain function. This protocol utilizes classical surgical techniques and describes methods that allow one to model ZIKV-associated human neurological disease in the mouse nervous system. While direct brain inoculation does not model the normal mode of virus transmission, the method allows investigators to ask targeted questions concerning the consequence after ZIKV infection of the developing brain. This protocol describes embryonic, neonatal, and adult stages of intraventricular inoculation of ZIKV. Once mastered, this method can become a straightforward and reproducible technique that only takes a few hours to perform.

Here we describe a method for establishing a model of Zika virus-induced microcephaly in mouse. This protocol includes methods for embryonic, neonatal, and adult-stage intracerebral inoculation of the Zika virus.

Creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da Virus di Zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

Le iniezioni per via endovenosa nel topo neonatale

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Biologia

Un protocollo completo per la somministrazione di iniezioni intratecali nei topi neonatali

Intrathecal Injection of Newborn Mouse for Genome Editing and Drug Delivery

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and treatments. By directly delivering medications and treatments into the cerebrospinal fluid of the central nervous system, this method achieves higher localized drug concentrations while reducing systemic side-effects compared to other routes such as intravenous, subcutaneous, or intramuscular injections. Its importance extends beyond clinical settings, as intrathecal injection plays a vital role in preclinical studies focused on treating neurogenetic disorders in rodents and other large animals, including non-human primates. However, despite its widespread application, intrathecal injection in young, particularly neonatal pups, poses significant technical challenges due to their small size and fragile nature. Successful and reliable administration of intrathecal injections in newborn mice requires meticulous attention to detail and careful consideration of various factors. Thus, there is a crucial need for a standardized protocol that not only provides instructions but also highlights key technical considerations and good laboratory practices to ensure procedural consistency, as well as the safety and welfare of the animals.
To address this unmet need, we present a detailed and comprehensive protocol for performing intrathecal injections specifically in newborn pups on postnatal day 1 (P1). By following the step-by-step instructions, researchers can confidently perform intrathecal injections in neonatal pups, enabling the accurate delivery of drugs, antisense oligos, and viruses for gene replacement or genome editing-based treatments. Furthermore, the importance of adhering to good laboratory practices is emphasized to maintain the well-being of animals and ensure reliable experimental outcomes. This protocol aims to address the technical challenges associated with intrathecal injections in neonatal mice, ultimately facilitating advances in the field of neurogenetic research that aims to develop potential therapeutic interventions.

Autore in primo piano: Iniezione intratecale: un metodo di somministrazione efficiente e affidabile per testare l'efficacia dell'editing genetico nel cervello di topo neonatale

The present protocol outlines step-by-step instructions for performing intrathecal injections in neonatal mice for gene editing and drug delivery.

Iniezione intratecale di topo neonato per l'editing del genoma e la somministrazione di farmaci

Intrathecal injection is a commonly employed procedure in both pediatric and adult clinics, serving as an effective means to administer medications and ...

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