Bu protokol, bir araştırmacının erken embriyogenez sırasında mutant deniz anemonları tespit etmesini sağlar, böylece post-embriyonik gelişimsel fenotip analiz edilebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hayvanın hayatından ödün vermeden tek tek deniz anemonları genotipli olarak ontojenin erken dönemlerinde kullanılabilmesidir. Bu prosedürü gösteren Miguel Silva, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.
Indüksiyon yumurtlamadan bir gün önce, anemon nematostella vectensis'i sıcaklık ve ışık kontrollü bir kuluçka makinesine yerleştirin, böylece hayvanlar 25 santigrat derecede sekiz saatlik ışığa maruz kalmıştır. Ertesi gün, kuvöz hayvanları çıkarın ve aşağıdaki bir buçuk ila iki saat içinde meydana gelecek yumurtlama izin vermek için ışık açık oda sıcaklığında bir bank üst üzerinde bırakın. İpucu bir transfer pipet kullanın bir sperm içeren erkek konteyner içine kadın konteyner yumurta paketleri yerleştirmek için açılış büyütmek için kesilir ve döllenme için izin vermek için en az 15 dakika erkek kabında bırakın.
Döllenmeden sonra, yumurta paketlerini dejelly için, bir cam Petri kabına % 3 sistein içeren deniz suyuna yerleştirin ve hafifçe 12 dakika çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Sonra plastik bir pipet ile kümeleri kırmak ve tamamen dejellied kadar başka bir 2-3 dakika boyunca ajitasyon devam. Döllenmiş yumurtaları aynı çanakta 16 derecede veya oda sıcaklığında saklayın.
Ertesi gün, el yazmasıaçıklandığı gibi DNA çıkarma tamponu hazırlayın, girdap ile iyice karıştırın ve her tüpe 20 mikrolitre ekleyerek PCR tüpleri içine aliquot. Deniz suyunda % 1 agarose çözün, alt kapsayacak şekilde bir Petri kabına dökün, ve bir jel yatak yapmak için bir tezgah üst üzerinde serin. Jel yatağını tatlı deniz suyuyla kaplayın.
24 saatlik döllenme sonrası embriyoları bir pipet kullanarak agarose jel yatak içeren Petri kabına aktarın. Bir ihtiyaç tutucu içine bir tungsten iğne takın ve alkol onun ucunu daldırma ve alkol yakmak için alev yerleştirerek sterilize. Bir diseksiyon mikroskop altında, manipüle edilecek bir embriyo büyüklüğünde yüzey agarose bir parça kaldırmak için tungsten iğne kullanarak agarose bir depresyon yapmak.
Sonra, tungsten iğne kullanarak, mikrocerrahi için embriyo hareketini kısıtlamak için aşağı bakan lateral tarafı ile depresyon içine embriyo yerleştirin. Başarılı bir ameliyat yapabilmek için embriyonun hareketini kısıtlamak çok önemlidir. Tungsten iğne ile, cerrahi oral aboral ekseni boyunca aboral doku bir parça kaldırmak, oral blastoporal açılış karşısında bulunan.
P20 pipetile izole aboral dokuyu 20 mikrolitre DNA ekstraksiyon tamponu içeren bir PCR tüpüne aktarın. Ameliyat sonrası embriyoyu en az 500 mikrolitre tatlı deniz suyu içeren 24 kuyuluk bir kuyuya aktarın. Ve ameliyat sonrası embriyoiçeren plakayı genotipleme tamamlanana kadar 16 derecede bir kuvöze yerleştirin.
Tek embriyolardan genomik DNA elde etmek için, ilk olarak dna çıkarma tamponu ve izole embriyonik dokuları içeren PCR tüplerini mini bir santrifüj kullanarak aşağı doğru döndürün. Daha sonra tüpleri 55 derecede üç saat kuluçkaya yatırın ve hücre kümelerinin dağılmasıve hücre liklerinin arttırılması için her 30 dakikada bir 30 saniye girdap atın. Proteinaz K'yi 4 dakika boyunca 95 santigrat derecede etkisiz hale getirmekten sonra, çıkarı alan çekirgeyi güçlendirmek için şablon olarak çıkarılan genomik DNA'yı kullanarak bir PCR reaksiyonu ayarlayın.
Tasarım el yazması açıklandığı gibi astar lar. 20 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın. PCR tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerinin boyutunu ve varlığını veya yokluğunu belirlemek için agarose jel elektroforezçalıştırın, PCR ürünlerinin beklenen boyutuna bağlı olarak agarose jel elektroforezdurumunu ayarlamak için emin olun.
Her ameliyat sonrası embriyoya bir genotip atamak ve embriyoları genotiplerine göre sıralamak için boyutu ve varlığı veya yokluğu veya PCR ürünleri yle ilgili PCR sonuçlarını kullanın. Nematostella genomunda nöropeptid, GLWamide için öncüprotein kodlayan tek bir lokus vardır. Locus'ta üç nakavt mutant alel daha önce bildirilmiştir.
A nakavt alel taşıyan heterozigot bir kadın ile C nakavt alel taşıyan heterozigot erkekler arasında f1 çaprazının soyundan gelen rastgele örneklenmiş embriyolardan elde edilen PCR sonuçları farklı genotipler gösterir. Embriyolar bir ve iki a nakavt alel beklenen boyutu karşılık gelen tek bir PCR bant göstermektedir. Embriyolar üç ve altı nakavt aleller A ve C.Embriyolar dört, yedi ve sekiz için beklenen boyutlarda iki PCR bantları göstermek tek bir PCR bant C nakavt alel beklenen boyutuna karşılık gelen gösterir.
Embriyo 5 hiçbir bant gösterir, astar bağlama eksikliği düşündüren. Genomik DNA çıkarma arızası olasılığını ekarte etmek için, başka bir PCR vahşi tip diziye bağlanabilen bir ters astar kullanılarak çalıştırıldı. Beklenen boyutta bir PCR ürünü tespit edildiği yerde genomik DNA ekstraksiyonu başarılı oldu.
Oysa hiçbir ürün çıkarma da bir hata önerdi. Bu protokol deniz anemon embriyoları için tasarlanmış olsa da, bu yöntemi genomik bilgi ve embriyoların erişebildiği mercanlar ve denizanaları gibi diğer cnidarians'a uygulamak mümkün olabilir. Bu prosedürütaki gelişimsel fenotipi değerlendirmek için tanımlanan mutantlar kullanılır.
Örneğin, immünboyama gibi histolojik teknikler morfolojideki kusurları değerlendirmek için kullanılabilirken, yerinde hibridizasyonda, gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR ve RNA-seq gen ekspresyonundaki kusurları değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, canlı görüntüleme larvalar veya erken polipler gibi post-embriyonik gelişim sırasında davranış kusurları değerlendirmek için kullanılabilir.
