Bu protokol, konjenital kalp kusurlarını teşhis etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme verileri üretmek için en yeni yöntemleri özetlemektedir. Kapsamlı KKH tanısı için seri 2D görüntü yığınları ve 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak için nekropsi ile kombine non-invaziv fetal ekokardiyografi ve ardından piskopal konfokal mikroskopi histopatolojisi ile fonksiyonel değerlendirmeler yapıyoruz. Bu yöntem sadece konjenital kalp hastalıklarındaki ayrıntılı anatomik değişiklikleri aydınlatmakla kalmaz, aynı zamanda kraniyal yüz kusurları, uzuv ve iskelet anomalileri gibi diğer organlardaki yapısal doğum kusurlarını, ayrıca beyin ve diğer viseral organların kusurlarını araştırmak için de kullanılabilir.
Bu prosedürleri gösterenler, laboratuvarımızdan tüm araştırmacılar olan Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang ve Benjamin Glennon olacak. Fareyi prosedür için hazırladıktan sonra, ultrason jelini vücut sıcaklığına ısıtın ve görüntüleme alanına cömertçe uygulayın. Ardından dönüştürücüyü yatay bir düzlemde yönlendirilmiş karın üzerine yerleştirin ve ekrandaki mesaneyi tanımlayın.
Mesane tanımlandıktan sonra, mesaneden kraniyal olarak tarayın, fetüsü arayın ve tacı yumru uzunluğuna ölçerek gebelik yaşını belirleyin. Ardından, kalpten kan akışını analiz etmek için renkli doppler'ı kullanın. İç organlara fiksatif penetrasyona izin vermek için, forseps veya diseksiyon makası kullanarak lateral toraks ve karın bölgesinde kesikler yapın ve numunenin soğuk bir odada en az 24 saat boyunca sabitlenmesine izin verin.
Ardından, görüntüleri numunenin tanımlaması, mikroskop büyütmesi ve resmin içeriği de dahil olmak üzere bir adla kaydetmek için yazılımı ayarlayın. Numuneyi bileklerinden ve ayak bileklerinden sabitleyin. Cildi medyan eksen boyunca kuyruğa doğru kesmeden önce, forseps kullanarak boynun ortasındaki cildi kaldırın ve cildi makasla her iki koltuk altına doğru kesin.
Sonra cildi göbek kemiğinden bacaklara doğru kesin. Örnekleri gömdükten sonra, lazer projeksiyon konumunu ekrandaki numunenin merkezine ayarlayın ve yakınlaştırma düğmesini 20x'e ayarlayın. Çözünürlüğü optimize etmek için kazancı 1.250V olarak ayarlayın.
Netleme düğmesini kullanarak mavi alanı en üst düzeye çıkarın ve ardından görüntüleme için kazancı yaklaşık 750V'a sıfırlayın. Ardından, kesme yöntemini otomatik olarak değiştirin. Kalınlığı yaklaşık 50 mikrometreye ayarlayın ve slaytları çalıştırın.
Akciğerler ve hava yolu göründüğünde kesmeyi bırakın. Sekiz ila 10 mikrometre arasında bir kesme kalınlığı seçin ve canlı görüntüyü açık bırakın. Görüntülemeye başlamak için Microtome Communicator'ı açın.
Görüntüleri toplamadan önce geçici depolama klasörünün boş olduğundan emin olun. Sert bir yapı görünmediğinde görüntü koleksiyonunu durdurun. Geçici olarak depolanan dosyaların çıktısını tek bir TIFF görüntü serisine alın.
3D görüntü rekonstrüksiyonu için, görüntü dosyalarını görüntü işleme yazılımına sürükleyip bırakın. Açılır pencere göründüğünde, veritabanına kopyalanacak bağlantıları veya dosyaları seçin. Dosya açıldıktan sonra, araç çubuğundan 2D 3D yeniden yapılandırma araçları menüsüne tıklayın ve 3D MPR'yi seçin.
Piksel X çözünürlüğü ve piksel Y çözünürlüğü için, ECM görüntüleme sırasında kullanılan yakınlaştırmayı vererek görüntü çözünürlüğünü girin. Dilim aralığı için, ECM görüntüleme sırasında kesmek için kullanılan dilim kalınlığını girin. Ardından, pencere genişliğini ve pencere düzeyini ayarlamak için WWWL aracını kullanın.
Görüntü parlaklığını azaltmak için görüntü üzerindeki aracı tıklayıp yukarıya, artırmak için aşağı doğru sürükleyin. Görüntü kontrastını azaltmak için görüntüdeki aracı tıklayıp sağa ve artırmak için sol kelimeye sürükleyin. Kaydırma aracını kullanarak görüntüleri istediğiniz konumlara sürükleyin.
Görüntüyü büyütmek veya küçültmek için yakınlaştırma aracını ve görüntüyü istediğiniz gibi döndürmek için döndürme aracını kullanın. Şimdi, ilk panelin renkli eksenini tıklayıp sürükleyin. Bu ekseni döndürmenin diğer iki panelin yönünü nasıl değiştirdiğine dikkat edin.
Üç panel eksenini, üç panel numunenin koronal, sagital ve enine görünümlerini temsil edene kadar döndürün. Her üç panel de uygun şekilde konumlandırıldıktan sonra, yönlendirildikten ve aydınlatıldıktan sonra, koronal görünümü temsil eden panele tıklayın. Ardından menü çubuğunun sağ tarafındaki Film Dışa Aktarma'ya tıklayın.
Toplu iş'e tıklayın ve tüm ilgi alanını kapsayacak şekilde gelen ve giden kaydırıcıları sürükleyin. Aralık için, kalınlıkla aynı seçeneği belirleyin ve görüntüleme yönünü gösteren videoyu kaydedin. Eko, intraventriküler şant olmadan sağlam bir ventriküler septum ve normal kontrolde ECM ile doğrulanan normal ilişkili büyük arterleri gösterir.
Önden görünüm, hem eko hem de ECM'de LA, RA, LV ve RV arasındaki iletişimi göstererek atriyoventriküler septal defekti düşündürmektedir. Renk akışı, ventriküler septal defekti gösteren LV ve RV boyunca akışı gösterir. Eko ve ECM'de sağ ventrikülün çift çıkışı ve LV ile RV arasında ventriküler septal defekt ve yan yana büyük arterler saptandı.
Kalıcı truncus arteriyozusun ultrason tanısı, LV ve RV arasındaki iletişimi, her iki ventrikülü de geçersiz kılan tek bir çıkış yolu ile gösterir ve ayrıca E14.5 aşamasında ECM tarafından da doğrulanır. ECM histolojisinden toplanan bölümler, immünoboyama, hematoksilin ve eozin boyama ve hatta genotipleme ve transkripsiyonel profilleme için nükleik asit ekstraksiyonu veya proteomik analiz için protein ekstraksiyonu için daha fazla işlenebilir. Üç boyutlu rekonstrüksiyondan elde edilen görüntüler, alan veya hacim gibi nicel çevrelerin değerlendirilmesi için daha fazla işlenebilir.
Kardiyovasküler anatomideki kusurları tanımlamak için doğru fenotipleme, konjenital kalp hastalığının patomekanizmalarını aydınlatmak için konjenital kalp hastalığının genetik olarak tasarlanmış ve mutant fare modellerinin oluşturulması için gereklidir. Bu, konjenital kalp hastalığı olan hastalarda klinik sonucu iyileştirmek için tedaviler ve müdahaleler geliştiren potansiyel fırsatlara yol açabilir.
