Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Das Protokoll unten beschreibt die Herstellung von C57BL / 6 und C3H / He (retinally degeneriert) Maus neuronalem Gewebe, aber ähnliche Techniken können auf andere Arten angewendet werden. Alle Tiere gesund und Umgang mit Standardbedingungen von Temperatur, Feuchtigkeit, 12 h Hell / Dunkel-Zyklus, den freien Zugang zu Futter und Wasser waren, und ohne beabsichtigte Stressreize. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den westlichen Sydney University Animal Care und Ethikkommission und nach der Nutzung von Tieren und Pflegerichtlinien (Animal Research Authority # A9452, # A10396 und # A8967) genehmigt und durchgeführt. 1. Gehirn Scheibe Vorbereitung <ol><li> Anesthetize das Tier durch Inhalation von Isofluran (5%) und enthaupten ein Nagetier Guillotine verwenden. Entfernen Sie schnell das Gehirn, wie zuvor 9 beschrieben und legen Sie sie in eiskalter physiologischer Lösung (aCSF) enthält (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25NaHCO 3, 25 Dextrose und gesättigt mit Carbogen (95% O 2/5% CO 2 -Gemisch; 310 mOsm, pH 7,4). </li><li> Schneiden Sie Hirnschnitten, in der Region von Interesse, 300 &amp; mgr; m dick mit einem vibrierenden Mikrotom. </li><li> Übertragen Scheiben zu einem speziell angefertigten Inkubationssystems , die eng überwacht und steuert pH - Werte (pH 7,2 bis 7,4), Carbogen Strömung und Temperatur wie zuvor 10 beschrieben, 11. </li><li> Eingestellten Anfangskammertemperatur auf 35 ° C für 15 - 30 min, und dann reduzieren langsam auf 15 - 16 ° C , wie in 1C gezeigt. Dann inkubieren Scheiben in Inkubationssystems bis sie benötigt werden, entweder für die Elektrophysiologie oder Bildgebung. HINWEIS: Wenn Scheiben werden für Calcium-Bildgebung verwendet werden, unter Schritte folgen, bevor Gewebe unterhalb RT abgekühlt wird. </li></ol> 2. Retinal Wholemount Vorbereitung und Membrana limitans Removal <ol><li> Bereiten Sie retinalen wholemounts entweder unter normalenLaborlichtverhältnissen oder schwach rot / Infrarot-Licht. </li><li> Euthanize Tier durch Genickbruch und sofort enucleate Augen. Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Ora serrata und Ort entweder in Ames Medien oder aCSF enthält (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 Glucose, 0,5 L-Glutamin und sättigen mit Carbogen (95% O 2/5% CO 2 -Gemisch; ~ 300 mOsm, pH 7,4) bei RT. </li><li> Entfernen Sie unverzüglich die Hornhaut, Linse und Glaskörper durch entlang der Ora serrata mit einer kleinen Schere schneiden und die Linse und Glaskörper mit einer Pinzette entfernen. Platzieren Gewebe im Inkubationssystem bei RT. HINWEIS: Retinal Gewebe kann in der Augenbecher, nach langsamer Temperaturabsenkung bis 15 gehalten werden - 16 ° C, für&gt; 24 h in Inkubationssystems bis benötigt. </li><li> Um die ILM entfernen, übertragen Sie die Augenmuschel die Netzhaut zu einem kleinen Glas mit 30 U / ml Papain, 1 mM L-Cystin, 0,5 mM EDTA und 0,005% DNase in Earl&#39;s- enthältBalanced Salt Solution (BSS) bei 37 ° C für 20 min. Anwenden 95% O 2/5% CO 2 in die Lösung durch den Deckel , aber nicht Blase. Wenn Gewebe von jungen Tieren (&lt;6 Wochen) verwenden, verdünnen die Lösung auf halber Stärke. <ol><li> Stoppen enzymatischen Verdau, durch das Gewebe in einer Ovomucoid Plazieren (10 mg / ml) und BSA (10 mg / ml) -Lösung für 10 min in Earl BSS. Wash Gewebe gründlich mit aCSF vor dem Transfer zum Inkubationssystems und reduzieren Temperatur auf 15 - 16 ° C. </li></ol></li><li> Pflegen Netzhautgewebe im Auge Schale, bis sie benötigt. Für die Übertragung an das Mikroskop, isolieren die Netzhaut aus dem Auge-Tasse und schneiden in 4 Stücke mit einer Rasierklinge. Wenn die gesamte Netzhaut erforderlich ist, machen vier kleine Schnitte in der Peripherie der Netzhaut, es zu ermöglichen, flach zu liegen. HINWEIS: Für die Bildgebung Experimente, Belastung mit Calcium-Farbstoffe vor dem Transfer zum Inkubationssystems, siehe unten. </li></ol> 3. Erhaltung von Gewebe im Inkubator <ol><li&gt; Platz Gewebe in der Hauptkammer Sonden für pH und Temperaturmessungen (1A, B) enthält. </li><li> Zirkulieren aCSF durch eine zweite Kammer (UVC Kammer, aufgebaut wie zuvor 12 beschrieben) , isoliert aus der Hauptkammer und ausgesetzt zu 1,1 W UVC - Licht (254 nm, 5W / 2P Sterilisator UV - Lampe), um Bakterien zu eradiate in der Lösung schwebenden (Abbildung 1A). Steuer UVC Licht Timing über einen programmierbaren Zeitgeber ein zufälliges-Funktion, die zu Zeiten schaltet variierend zwischen 15 und 26 min alle 15 - 30 min eine übermäßige Erwärmung des aCSF zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit in der Kammer UVC bis 12 mL / min , wie zuvor berichtet , 12. Decken Sie die UVC-Kammer mit Aluminiumfolie zu UVC Beleuchtung außerhalb der Kammer zu verhindern, die das neuronale Gewebe schädigen können. HINWEIS: Für die dunkeladaptierten Netzhautgewebe, tragen Sie eine maßgeschneiderte Abdeckung mit der Hauptkammer Licht auszuschließen. </li><li> Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe zu Circulate die Lösung (aCSF) durch die beiden Kammern und eine Platte thermo kalten Peltier-Kühler entweder kühlen oder die Hauptkammer im Bereich von 0 bis die gewünschten Temperaturen erhitzen - 50 ° C. Für eine optimale Gewebe Inkubation verwenden 15 - 16 ° C für die langfristige Rentabilität. </li></ol> 4. Calcium Farbstoffbeladung <ol><li> Wählen Calcium Farbstoffe basierend auf der Präferenz des einzelnen Forscher. Hier verwenden wir Fura-02.00, Fluo-08.00 Uhr oder Fluo-04.00. Jedoch kann dieses Verfahren auf andere Farbstoffe verwendet werden wie auch: Man löst Calcium Farbstoffe in DMSO auf eine 1 mM - Lösung und 1% Blockcopolymere (beispielsweise Pluronsäure-127) bis zu einem Endvolumen von 50 ul und beschallen für 10 min. </li><li> Hinzufügen Lösung aCSF bis zu einer Endkonzentration von 10 uM, 0,01% Blockcopolymere für Hirnschnitten und 20 uM (Netzhaut), 0,02% Blockcopolymere für die Netzhaut. In Retinae (Papain behandelt) und Hirnschnitten von jungen Tieren, Last auf das Bad für 45 min bei 37 ° C (Fura-2 AM) oder bei RT (Fluo-04.00; Fluo-08.00 Uhr). <ol><li> Für erwachsene Tiere, (&gt; 12 Wochen) pipettieren die Farbstoffe (50 ul) direkt auf die Hirnschnitten und pflegen 75 min eine bessere Durchdringung des Farbstoffs in die tiefen Schichten zu ermöglichen. </li><li> Um eine ausreichende Sauerstoffversorgung des untergetauchten Scheibe während der Farbstoff Inkubation sicherzustellen, bereiten eine Glasladeraum mit einem geschlossenen Deckel (Kreis Glas mit einem Durchmesser von 2,5 cm, 3,5 cm Höhe) mit Calcium-Farbstoffe, verdünnt in 2,5 ml aCSF. Oxygenat kontinuierlich mit 95% O 2/5% CO 2. Nicht Blase. </li></ol></li><li> Nach Farbstoffbeladung, waschen Sie die Gewebe mit aCSF und Transfer zum Inkubationssystems, reduzieren die Temperatur langsam auf 15 - 16 ° C bis zum experimentellen Einsatz. </li></ol> 5. Recordings und Imaging Elektrophysiologische <ol><li> Platzieren Gewebe in einem untergetauchten Aufnahmekammer unter einem Mikroskop und perfundieren mit oxygeniertem aCSF mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 - 5 ml / min entweder bei RT (~ 22 ° C) oder physiologischer Temperatur (~ 35 ° C). Hold das Gewebe an Ort und Stelle durch Verwendung eines benutzerdefinierten gemacht &#39;&#39; Harfe &#39;&#39;, aus Nylon oder Goldfäden gestreckt und über ein U-förmiges Stück Gold oder Platindraht geklebt. </li><li> Für die Elektrophysiologie: <ol><li> Bereiten Sie Aufnahme Pipetten von 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilicatglas mit einer Mikro Abzieher mit einem Endwiderstand von 5-6 MOhm zu erreichen. </li><li> Füllen Sie die Pipette mit 3 bis 4 &amp; mgr; l der internen Lösung wie zuvor 13 beschrieben und zu visualisieren Zellen unter Infrarot - Differential - Interferenz - Kontrast (IR-DIC) mit einer CCD - Kamera. Die intrazelluläre Lösung sollte sorgfältig jedem Experiment zugeschnitten werden experimentelle Ergebnisse zu erzielen. </li><li> Position Pipette, während positive Druck aufrechterhalten wird aufgebracht durch eine Ansaugöffnung auf der Pipettenhalter an der Membran einer Zelle eines Mikromanipulators verwenden. Da die ILM von der Netzhaut entfernt wurde, keine vorherige Membran Abschaben erforderlich ist. Sobald die Pipette auf die Zelle ist, gelten sanft negativDruck auf die Pipette eine Gigaohm Dichtung zu erreichen. Dann reißt die Zellmembran mit einer kurzen Menge von Unterdruck. </li><li> Machen Sie mit ganzen Zellen Strom- oder Spannungs-Clamp Messungen mit Standardtechniken als angemessen. </li></ol></li><li> Calcium-Bildgebung: <ol><li> Für ratiometrisch Bildgebung von Fura-2, eine Ultrahochgeschwindigkeits-Wellenlängenumschalter verwenden, um Anregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm bereitzustellen. Passieren emittierte Licht von einzelnen Zellen durch ein Emissionsfilter von 510 ± 20 nm, und erfassen mit einer hohen Empfindlichkeit, Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera. </li><li> Für einen einzelnen Anregungswellenlänge von Fluo-4, Filteranregungslicht durch einen 460-490 nm Bandpassfilter und emittiert Licht durch eine 515-550 nm Bandpassfilter. Für die schnellste und empfindlichste Aufnahme eine so hohe Geschwindigkeit Digitalkamera verwenden. Erwerben Sie Bilder nach Bedarf. </li><li> Messung der Veränderungen in der Fluoreszenz als Funktion der Zeit entweder bei einer einzigen Wellenlänge (Fluo-4) oder der Wellenlängen-Verhältnis unter Verwendung vonVerfahren (Fura-2), wie zuvor beschrieben , 8, 14. </li></ol></li></ol>

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Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

Dieser Artikel beschreibt eine Inkubation Methode, um die Lebensfähigkeit von akuten neuronalen Gewebe für die Bildgebung und elektrophysiologischen Experimenten zu verlängern, wodurch die Anzahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen. Zwei Hauptprozesse regeln die Verschlechterung der neuronalen Gewebe im Laufe der Zeit: i) erhöhte Keimbelastung und die damit einhergehende Erhöhung der bakterielles Endotoxin freigesetzt, und ii) Exzitotoxizität , die das traumatische Slicing ...

Elektrophysiologie und funktionelle Bildgebung (Calcium, spannungsempfindliche Farbstoffe) sind zwei der am häufigsten verwendeten experimentellen Techniken in den Neurowissenschaften. Hirnschnittpräparaten und retinale Wholemount, die hier untersucht werden, ein Mittel zur Prüfung der elektrophysiologischen Eigenschaften und synaptischer Verbindungen ohne Kontamination von Anästhetika oder Muskelrelaxantien. Hirnschnitte und Retina - Wholemount ihre strukturelle Integrität aufrechtzuerhalten, im Gegensatz zu Kulturen oder Zellhomogenisate, so dass die Untersuchung spezifischer Schaltungen und Gehirn Netzwerke 1. Aufnahmen von isolierten Gewebe haben Vorteile gegenüber in vivo Aufnahmen als Bewegungen mit dem Herzschlag und Atmung verbunden sind eliminiert. Darüber hinaus ermöglicht die direkte Visualisierung bestimmte Klassen von Zellen 2, 3 gezielte und lokale Anwendung von pharmakologischen Werkzeugen werden. Patch-Clamp-Aufnahmen und Calcium Farbstoffbeladung in retinalen Wholemount wird durch die Existenz der inneren Grenzmembran (ILM), die deckt die retinalen Ganglienzellen (RGC) Schicht kompliziert und direkten Zugang zu den Zellen verhindert. Typischerweise wird diese Membran mit einer Glaspipette abgeschabt direkte Anwendung eines Patch-Pipette und die Bildung eines Gigaohm Dichtung an einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Darüber hinaus Bade angewendet Kalzium Farbstoffe nicht kreuzen die ILM und müssen entweder unter dieser Membran 4, retrograden Transport nach der Injektion an den Sehnerv 5 oder durch Elektroporation durch das Gewebe 6 injiziert werden. Wenn darüber hinaus ein Nagetiermodell von Retinitis pigmentosa verwendet wird , die rd / rd Maus, ist die ILM dicker und undurchdringlich. Hier verwenden wir eine Technik , um die ILM mit enzymatischen Aufschluss 7 zu entfernen , sowohl allgegenwärtige Calcium - Farbstoff-Beladung und den direkten Zugang zu retinalen Ganglionzellen für Patch-Clamp - recordi zu ermöglichenNGS 8. Erfolgreiche Aufnahmen von beiden Hirnschnitten oder retinalen Wholemount hängen von Präparation und Inkubation von lebenden Nervengewebe. Typischerweise wird Gewebe am Morgen des Experiments entnommen und in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) inkubiert, bis sie für die Aufnahmen verwendet wird. Normalerweise bleibt Gewebe lebensfähig für 6 - 8 h, mit signifikanten Abbau nach diesem Zeitfenster. beide Gehirnscheiben und Präparate jedoch in der Regel Wholemount retinae produzieren mehr Gewebe als kann innerhalb dieser kurzen Zeitspanne aufgezeichnet werden. Folglich wird Gewebe oft am Ende des Tages verworfen und die Präparation wird wieder an den nachfolgenden Tagen abgeschlossen. Das bedeutet, ein anderes Tier wird verwendet, und ~ 2 h Setup und Dissektion / Färbung wiederholt. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensdauer von neuronalem Gewebe für mehr als 24 h, was bedeutet weniger Tiere verwendet werden, und Versuchszeit zur Verfügung steht. Gewebeviabilität wwie beurteilt durch elektrophysiologischen Eigenschaften der Aufnahme und Kalziumdynamik, und diese Eigenschaften waren nicht zu unterscheiden zwischen &lt;4 h und&gt; 24 h postdissection. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur einzelne Zelleigenschaften intakt und funktionsfähig nach längerer Inkubation, aber Netzwerk-Aktivität, wie durch Calcium-Bildgebung und elektrophysiologischen Ableitungen beurteilt, ist unverändert&gt; 24 h postdissection. Darüber hinaus zeigen wir, dass Calcium Farbstoffe in Zellen über einen längeren Zeitraum, ohne dass irgendwelche nachteiligen Effekte bleiben kann. Anwendung dieses Protokolls veranschaulicht, dass die funktionelle Aktivität von Neuronen in akuten neuronalen Gewebe können für lange Zeiträume aufrechterhalten werden, sobald die äußere Umgebung stark reguliert ist. Außerdem ist, wie die Lebensfähigkeit des Gewebes aufgrund unterschiedlicher Inkubationsprotokolle stark zwischen den Labors variiert, stellt dieses Verfahren einen Goldstandard für die idealen Parameter, die Variabilität in der Gesundheit der akuten neu zu reduzieren angewendet werden sollteronal Gewebe.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

8 Stunden nach der Präparation - neuronaler Gewebepräparate Akut, Hirnschnitten und Retina-Wholemount, können in der Regel nur für 6 gehalten werden. Dies begrenzt die Versuchszeit und erhöht die Anzahl der Tiere, die pro Studie verwendet werden. Diese Einschränkung speziell Auswirkungen Protokolle wie Kalzium-Imaging, die verlängerte Vorinkubation erfordern mit Bad aufgetragen Farbstoffe. Exponential Bakterienwachstum in 3 - 4 h nach dem Schneiden ist eng mit einer Abnahme der Gewebegesundheit korreliert. Diese Studie beschreibt ein Verfahren für die Vermehrung von Bakterien in acute Zubereitungen Begrenzung für längere Zeiträume (&gt; 24 h) ohne die Notwendigkeit von Antibiotika, sterile Verfahren oder Gewebekulturmedien, enthaltend Wachstumsfaktoren tragfähige neuronalem Gewebe zu halten. Durch Radfahren Kammer die extrazelluläre Flüssigkeit durch UV-Bestrahlung und halten das Gewebe in einem benutzerdefinierten Halte bei 15 - 16 ° C, zeigt das Gewebe keinen Unterschied in der elektrophysiologischen Eigenschaften, oder Calcium-signaling durch intrazelluläres Calcium Farbstoffe bei&gt; 24 h postdissection. Diese Methoden werden nicht nur verlängern experimentelle Zeit für diejenigen, mit akuten neuronalen Gewebe, sondern die Zahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen, und wird eine Goldstandard für die akute neuronale Gewebe Inkubation gesetzt.

Strenge Regulierung der Bakterienlast und der Temperatur der aCSF während der Inkubation ist wesentlich neuronalem Gewebe Lebensfähigkeit zu erhalten. 16 ° C (Abbildung 1) - dies kann mit UVC - Licht und Aufrechterhalten der Temperatur des aCSF bei 15 durch Bestrahlung optimiert werden. Des Weiteren Parameter der aCSF Stempel (APS; 1C) stellt die Experimentator mit einem Rekord von den Umgebungsbedingungen (pH - Wert und Temperatur.), So dass ein Gold...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich&gt; 24 h ausgedehnt werden.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Aufrufe.  Western Sydney University.  Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich> 24 h ausgedehnt werden. 

Serie: Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

Messung der neuronalen Aktivität in einem Maushirnschnitt nach längerer Inkubation

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

For retinal whole mount preparation, immediately enucleate the eyes from a euthanized animal. Make a small cut along the ora serrata, and place the eyes in either Ames Media or aCSF with carbogen supply at room temperature. After that, immediately remove the cornea, lens, and vitreous by cutting along the ora serrata with small scissors, and remove them with forceps. Place the tissue in the incubation system at room temperature.
To remove the inner limiting membrane, transfer the eye cup containing the retina to a small glass jar containing papain, L-cysteine, EDTA, and DNAse at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Apply carbogen to the solution through the lid, but do not bubble. Stop the enzymatic digestion by placing the tissue in an ovomucoid and BSA solution for 10 minutes in Earl&#39;s BSS. Then, wash the tissue thoroughly with aCSF.
Subsequently, transfer the tissue to the incubation system and reduce the temperature to about 15 to 16 degrees Celsius. Following that, transfer the retinal tissue to the microscope; isolate the retina from the eye cup, and cut it into four pieces with a razor blade. If the entire retina is required, make four small cuts in the periphery of the retina to allow it to lie flat.
This tissue can now be transferred to the microscope for electrophysiology, or maintained in the Braincubator. The tissue is maintained in the main chamber containing the probes for pH and temperature measurements. A second chamber is isolated from the main chamber and is exposed to 1.1 watts UVC light in order to irradiate bacteria floating in the solution. Use a peristaltic pump to circulate aCSF through the two chambers, and a Peltier thermoelectric cold plate to either cool or heat the main chamber.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Zusammenfassung

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