Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging at JoVE.com

We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

protokol aşağıda C57BL / 6 ve C3H / He (retinally dejenere) Fare nöronal doku hazırlanmasını tarif, ancak benzer teknikler diğer türlere uygulanabilir. Bütün hayvanlar, sağlıklı ve standart sıcaklık koşulları, nem, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde, yiyecek ve suya serbest erişim ile ele ve herhangi bir amacıyla güç uyaran olmadan. Bütün deneyler onaylanmış ve Batı Sydney Üniversitesi Hayvan Bakım ve Etik komitesi göre yapılan ve hayvan kullanımı ve bakımı ana hatları (Hayvancılık Araştırma Kurumu # A9452, # A10396 ve # A8967) göre edildi. 1. Beyin Dilim Hazırlık <ol><li> izofluran (% 5) inhalasyon yoluyla hayvan anestezisi ve bir kemirgen giyotin kullanarak başını kesmek. Daha önce 9 tarif edildiği gibi hızlı bir şekilde beyin çıkarın ve buz gibi soğuk fizyolojik çözelti (ACSF) (mM olarak) içine yerleştirin: 125 NaCl, MgCl2, 1.25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25 2.5 KCI, 1NaHCO 3, 25 dekstroz ve karbojen ile doyurulmuş (% 95 O 2/5% CO2 karışımı 310 mOsm, pH 7.4). </li><li> titreşimli mikrotom ile 300 mikron kalınlığında, ilgilenilen bölgede, beyin dilimleri kesin. </li><li> Daha önce 10, 11 açıklandığı gibi, carbogen akışı ve sıcaklık - yakından izler ve pH düzeyini (7.4 pH 7.2) kontrol eden bir özel inşa kuluçka sistemi dilim aktarın. </li><li> 15 ila 35 ° C, ilk reaktör sıcaklığı ayarlama - 30 dakika, ve daha sonra yavaş yavaş 15 azaltmak - Şekil 1C&#39;de gösterildiği gibi, 16 ° C. kadar gerekli sonra ya elektrofizyoloji veya görüntüleme için, kuluçka sisteminin dilimleri kuluçkaya yatmaktadır. NOT: dilimleri kalsiyum görüntüleme için kullanılacak ise, RT altında doku soğutmadan önce aşağıdaki adımları izleyin. </li></ol> 2. Retina Wholemount Hazırlama ve İç Limitan Membran Soyulması <ol><li> Ya normal koşullarda retina wholemounts hazırlayınlaboratuvar aydınlatma koşulları veya loş kırmızı / kızıl ötesi ışık. </li><li> servikal dislokasyon ve hemen aydınlatmak gözler hayvan Euthanize. Ames ortam veya ACSF içeren ya küçük ora serrata&#39;dan boyunca kesilmiş ve yer (mM) sağlayın: 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCI, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glukoz, 0.5 L-glutamin ve karbojen ile doyurun (2/5,% CO2 karışımı% 95 O, ~ 300 mOsm, pH 7.4) ilave edilir. </li><li> Hemen küçük bir makas ile ora serrata boyunca kesme ve forseps ile lens ve vitrözü ile kornea, lens ve vitrözü çıkarın. Oda sıcaklığında inkübasyon sistemi doku yerleştirin. Not: retinal doku 15 yavaş sıcaklık azaltma sonra, göz fincan korunabilir - ihtiyaç kadar inkübasyon sistemine&gt; 24 saat boyunca, 16 ° C. </li><li> Earl&#39;s- 30 U / ml papain, 1 mM L-sistin, 0.5 mM EDTA ve% 0.005 DNaz içeren küçük bir cam kavanoza retina içeren göz fincan transfer ILM kaldırmak için20 dakika için 37 ° C &#39;de dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS). Kapaktan çözüm% 95 O 2 /% 5 CO 2 uygulayın, ancak kabarcık yok. Genç hayvanların (&lt;6 hafta) doku kullanılırsa, yarı gücü seyreltilir. <ol><li> Earl BSS 10 dakika süreyle bir ovomukoid (10 mg / ml) ve BSA (10 mg / ml) çözelti içinde doku yerleştirerek, enzimatik sindirim durdurun. 16 ° C - Yıkama doku iyice aCSF ile inkübasyon sistemine aktarılmadan önce ve 15 sıcaklığını düşürmek. </li></ol></li><li> ihtiyaç kadar göz fincan retina dokusu korumak. mikroskop transfer için, göz bardaktan retina izole ve bir traş bıçağı ile 4 parçalar halinde kesilmiş. Tüm retina gerekiyorsa, düz yalan izin vermek için retinanın periferinde dört küçük kesikler yapın. NOT: görüntüleme deneyleri, kuluçka sistemine aktarılmadan önce kalsiyum boya ile yük için aşağıya bakın. </li></ol> 3. enkubatörde Doku bakımı <ol><li&gt; PH ve sıcaklık ölçümleri için sondaları (Şekil 1A, B) içeren ana odasında Yeri doku. </li><li> Çözelti içinde kayan bakteri saçmak için (5W / 2P sterilizatör UV lambası, 254 nm), ana bölmeden izole edilmiş ve UVC ışığı B 1.1 maruz (daha önce tarif edildiği gibi 12 inşa UVC odası), bir ikinci bölme ile aCSF sirküle (Şekil 1A). aCSF aşırı ısınmayı önlemek için 30 dakika - her 15 dk 15 ila 26 değişen zamanlarda ON döner rastgele özelliğini kullanarak programlanabilir zamanlayıcı ile kontrol UVC ışığı zamanlama. </li><li> 12 ml UVC odasında akış hızını ayarlamak / dk önce olduğu gibi 12 bildirdiler. nöronal dokulara zarar verebilir odasının dışında UVC aydınlatma önlemek için alüminyum folyo ile UVC odasına örtün. NOT: koyu adapte retina dokusunun için, ışık dışlamak için ana odaya ısmarlama kapak uygulayın. </li><li> Sirkü bir peristaltik pompa kullanmakte iki odaları aracılığıyla çözüm (CSF) ve 0 aralığında istenilen sıcaklıklara serin veya ana odayı ısıtmak birine soğutucu Peltier termoelektrik soğuk plaka - 50 ° C. Uzun vadeli canlılığı için 16 ° C - Optimum doku inkübasyon için, 15 kullanın. </li></ol> 4. Kalsiyum Boya Yükleme <ol><li> Bireysel araştırmacının tercihine göre kalsiyum boyalar seçin. Burada Fura-2AM, Flu-8 am veya Flu-4 am kullanın. Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda, diğer boyalar için uygulanabilir: 1 mM solüsyonu ve% 1 blok kopolimerleri DMSO içinde kalsiyum boyalar çözülür (örneğin, pluronik asit 127), 10 dakika boyunca son bir 50 uL hacmi ve sonikasyon. </li><li> Retina 10 uM, beyin kesitleri% 0.01 blok kopolimerleri ve 20 uM (retina),% 0.02 blok kopolimerleri nihai konsantrasyona aCSF çözüm ekleyin. F; 37 ° C (Fura-02:00) ya da oda sıcaklığında (Fluo-4 AM genç hayvanlarda, 45 dakika için banyo yükten retinae (papain muamele edilmiş) ve beyin dilimleriluo-08:00). <ol><li> yetişkin hayvanların, (&gt; 12 haftalık) için doğrudan beyin dilimleri üzerine boyalar (50 uL) pipet ve derin katmanlarına boyanın daha iyi nüfuz izin vermek için 75 dakika boyunca muhafaza edilir. </li><li> Boya inkübasyon sırasında su altı dilim yeterli oksijen sağlamak için, aCSF 2.5 mL içinde seyreltilmiş kalsiyum boyalar ile kapalı bir kapak (çap 2.5 cm, dairesel kavanoz, 3,5 cm yükseklik) olan bir cam yükleme bölmesine hazırlar. % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile sürekli oksijen. kabarcık etmeyin. </li></ol></li><li> Deneysel kullanıma kadar 16 ° C - boya yükleme sonrasında yavaş yavaş 15 sıcaklığını düşürmek, kuluçka sisteminin aCSF ve transfer ile doku yıkayın. </li></ol> 5. Elektrofizyolojik Kayıtlar ve Görüntüleme <ol><li> mikroskop altında dalgıç bir kayıt odasına doku yerleştirin ve 4 bir akış oranında oksijenli ACSF serpmek - RT (~ 22 ° C) ya da fizyolojik sıcaklıkta 5 mL / dakika, ya (~ 35 ° C). Holgerilir ve altın veya platin tel U şeklinde bir parça üzerinde yapıştırılmış bir naylon veya altın parçacıkları imal &#39;harp&#39; özel yapılmış kullanılarak yerine D dokusudur. </li><li> elektrofizyoloji için: <ol><li> 5-6 MQ nihai direncini elde etmek için bir mikropipet çektirmenin kullanarak 1.5 mm (1.19 mm ID) borosilikat cam kayıt pipetler hazırlayın. </li><li> Daha önce 13 açıklandığı gibi iç çözümü 4 mcL ve bir CCD kamera kullanarak kızılötesi Diferansiyel Girişim Kontrast (IR-DIC) altında hücrelerin görselleştirmek - 3 pipet doldurun. Hücre içi çözüm dikkatlice deneysel sonuçlar elde etmek için her bir deney uygun olmalıdır. </li><li> Pozisyon pipet, pozitif basınç korurken bir micromanipulator kullanarak bir hücre zarında yer alan, pipet tutucu bir emme portu aracılığıyla başvurdu. ILM retina kaldırıldı beri, önceden zar kazıma gereklidir. Pipet hücre üzerinde sonra, nazik negatif uygulamakpipet basınç gigaohm mühür elde etmek. Daha sonra bir negatif basınç kısa bir miktarı ile, hücre zarı yırtılabilir. </li><li> uygun şekilde standart teknikler kullanılarak bütün hücre akım-veya voltaj-kelepçe kayıtları sağlayın. </li></ol></li><li> Kalsiyum-görüntüleme: <ol><li> Fura-2 oran ölçer görüntüleme için, 340 nm ve 380 nm düzeyindeki uyarıcı dalga uzunluklannda sağlamak için bir ultra-yüksek hızlı dalga değiştiriciyi kullanın. 510 ± 20 nm emisyon filtresi aracılığıyla tek tek hücrelerin yayılan ışığı geçirin ve bir yüksek hassasiyet, yüksek hızlı dijital kamera ile yakalamak. </li><li> 550 nm bant geçiren filtre - Bir 515 ile 490 nm bant geçiren filtre ve yayılan ışık - Flu-4, filtre uyarma 460 ışığın tek bir dalgaboyu için. En hızlı ve en hassas kayıt için böyle bir yüksek hızlı dijital fotoğraf makinesi kullanın. gerektiği gibi görüntü kazanır. </li><li> zamanın bir fonksiyonu ya tek bir dalga boyunda (Fluo-4) ya da dalgaboyu oranı kullanılarak floresan değişiklikleri ölçmekyöntemi (Fura-2), daha önce, 14 8 hazırlanır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3.">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves.">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li><li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina.">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396 (2014).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina.">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588 (2015).</li><li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells.">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li><li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue.">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li><li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons.">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li><li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braincubator:+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology.">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li><li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Device+for+storing+a+tissue+sample.">Device for storing a tissue sample.</a> WIPO Patent. , (2015).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li><li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices.">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

Bu makale, böylece deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvan sayısının azaltılması, görüntüleme ve elektrofizyolojik deneyler için akut nöronal doku canlılığını uzatmak için bir kuluçka yöntem açıklanır. İki ana süreçleri zamanla nöronal doku bozulmasını yöneten: i) artan bakteri düzeyleri ve serbest bakteriyel endotoksin eşlik eden artış ve travmatik dilimleme işlemi 10 aşağıdaki ii) eksitotoksi. Akut nöronal doku çevre savunmasız olduğundan, pH,...

Elektrofizyoloji ve fonksiyonel görüntüleme (kalsiyum, gerilim duyarlı boyalar) nörobilim alanında en sık kullanılan deneysel teknikler ikisidir. Beyin dilim hazırlıkları ve burada ele alınacaktır retina wholemount, anestezik veya kas gevşeticiler gelen kirlenme olmadan elektrofizyolojik özellikleri ve sinaptik bağlantı inceleme olanağını sağlamaktadır. Beyin dilimleri ve retina belli devreler ve beyin ağları 1 çalışma sağlayan kültürlerin veya hücre homojenatları farklı olarak, yapısal bütünlüğünü muhafaza wholemount. İzole doku Kayıtlar kalp atışı ve solunum ile ilişkili hareketler olarak in vivo kayıtları üzerinde avantajları ortadan kalkar var. Ayrıca, doğrudan görselleştirme hedef hücre spesifik sınıfları ve farmakolojik araçlar 2, 3 lokal uygulamaya izin verir. Patch-kelepçe kayıtları ve kalkyum-yükleme boyası retina wholemount Retina Ganglion Hücre (RGC) katmanı kapsar ve hücrelere doğrudan erişimi engeller Membran (ILM), Sınırlama İç varlığı ile karmaşık. Tipik haliyle, bu membran, tek bir hücre üzerindeki bir gigaohm contanın bir yama pipet ve oluşum doğrudan uygulamaya izin vermek için bir cam pipet ile kazınarak. Buna ek olarak, küvet uygulanan kalsiyum boyalar ILM geçmez ve ya retrograd optik sinir 5 aşağıdaki enjeksiyon taşınan veya dokuya 6 boyunca elektroporasyon, bu zarın 4 altından enjekte edilmelidir. Retinitis pigmentosa kemirgen modeli kullanılırken Dahası, rd / rd fare, ILM daha kalın ve daha aşılmaz olduğunu. Burada, yama-kelepçe recordi için retina ganglion hücrelerinin her yerde kalsiyum boya yükleme ve doğrudan erişim hem de izin vermek, enzimatik sindirim 7 ile ILM kaldırmak için bir tekniği kullanırNGS 8. beyin dilimleri veya retina wholemount birinden başarılı kayıtları diseksiyon ve canlı nöronal doku inkübasyon bağlıdır. Tipik olarak, doku, deney sabahı ekstre edilir ve kayıt için kullanılana kadar yapay serebrospinal akışkan (CSF) &#39;de inkübe edilmiştir. Bu zaman penceresinde aşağıdaki önemli ölçüde bozulma ile, 8 saat - Genellikle, doku 6 canlı kalır. Ancak, beyin dilimleri ve wholemount retinae hazırlıkları hem genelde bu kısa süre içinde kaydedilebilir daha fazla doku üretir. Sonuç olarak, bağ, genellikle gün sonunda atılır ve diseksiyon sonraki günlerde daha tamamlanır. Bu, başka bir hayvan kullanılmıştır ve kurulum ve diseksiyon / tekrarlanan boyama ~ 2 saat demektir. Aşağıdaki protokol kullanılmaktadır daha az hayvan anlamına fazla 24 saat boyunca, nöronal dokuda ömrünü uzatmak için bir yöntem tarif eder, ve daha çok deneysel kez mevcuttur. Doku canlılığını Welektrofizyolojik özellikleri ve kalsiyum dinamikleri kayıt yoluyla değerlendirilir ve bu özellikleri &lt;4 saat ve&gt; 24 saat postdissection arasındaki ayırt olduğu gibi. Bu sonuçlar, uzun inkübasyondan sonra tek hücre özellikleri bozulmamış ve işlevsel değil sadece gösteriyor, ancak kalsiyum görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar ile değerlendirilen ağ etkinliği, 24&gt; değişmeden saat postdissection olduğunu. Ayrıca, kalsiyum boyalar herhangi bir zararlı etkiye neden olmadan uzun süreli dönemler için hücrelerde kalır olduğunu göstermektedir. Bu protokolün uygulanması dış çevre yüksek düzenlenir sonra akut nöronal dokuda nöronların fonksiyonel aktivitesi, uzun süreler boyunca muhafaza edilebileceğini göstermektedir. Doku canlılığı nedeniyle farklı inkübasyon protokolleri laboratuarlar arasında büyük farklılıklar Dahası, bu yöntem akut neu sağlığı değişkenliği azaltmak için uygulanması gereken ideal bir parametre için bir altın standardı belirlerronal dokusu.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

Diseksiyon Aşağıdaki 8 saat - nöronal doku preparatları, beyin kesitleri ve retina wholemount akut, genellikle 6 korunabilir. Bu deneysel zaman sınırlar ve çalışmanın başına kullanılan hayvanların sayısını artırır. Bu tür banyo uygulanan boyalar ile uzun süreli ön inkübasyon gerektiren kalsiyum görüntüleme gibi Bu sınırlama, özellikle etkiler protokolleri. 3 içinde Üstel bakteri üremesi - dilimleme sonra 4 saat sıkı doku sağlığı bir azalma ile ilişkilidir. Bu çalışma, büyüme faktörlerini içeren antibiyotiklere steril prosedürleri ya da doku kültürü ortamı gerek kalmadan zaman uzun süreli (&gt; 24 saat) için geçerli nöronal doku sağlamak için, akut preparasyonlarda bakterilerin üremesini sınırlamak için bir yöntem tarif eder. UV ışınlaması yoluyla dışı sıvıyı bisiklet ve 15 özel tutma odasında doku tutarak - 16 ° C, doku elektrofizyolojik özellikleri, veya kalsiyum si fark gösterir&gt; 24 saat postdissection hücre içi kalsiyum boyalar ile gnaling. Bu yöntemler akut nöronal doku kullananlar için deneysel süresini uzatmak kalmayacak, ama deneysel hedefleri tamamlamak için gereken hayvanların sayısını azaltacak ve akut nöronal doku inkübasyon için bir altın standart ayarlar.

İnkübasyon sırasında aCSF bakteri yükü ve sıcaklık sıkı regülasyonu nöronal doku canlılığını korumak için şarttır. 16 ° C (Şekil 1) - Bu UVC ışığı ile ışınlama ve 15 aCSF sıcaklık muhafaza ile optimize edilebilir. (Şekil 1C APS), takip edildiği takdirde arasındaki değişkenliği azaltacak nöronal doku, kuluçka sırasında böylece parametreler için bir altın standart sunan, çevre koşullarının bir rekor (pH ve s...

Watch this Scientific Journal Video about Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging at JoVE.com

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

8 saat - vücuttan çıkarılır sonra, nöronal doku büyük ölçüde 6 sonra doku nihai bozulmasına sebep çevre koşullarından etkilenir. yakından takip eder ve dokunun hücredışı ortamı düzenleyen benzersiz inkübasyon yöntemi kullanılarak, doku canlılığını önemli ölçüde&gt; 24 saat boyunca uzatılabilir.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

prolonged-incubation-acute-neuronal-tissue-for-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Görüntüleme.  Western Sydney University.  8 saat - vücuttan çıkarılır sonra, nöronal doku büyük ölçüde 6 sonra doku nihai bozulmasına sebep çevre koşullarından etkilenir. yakından takip eder ve dokunun hücredışı ortamı düzenleyen benzersiz inkübasyon yöntemi kullanılarak, doku canlılığını önemli ölçüde> 24 saat boyunca uzatılabilir. 

Video: Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Nörobilim

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Kemirgenler gelen akut Hipokampal Dilimleri kullanarak Synaptic Etiketleme / yakalama ve Çapraz yakalama İncelenmesi

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

Uzun Süreli İnkübasyondan Sonra Bir Fare Beyin Diliminde Nöral Aktivitenin Ölçülmesi

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

For retinal whole mount preparation, immediately enucleate the eyes from a euthanized animal. Make a small cut along the ora serrata, and place the eyes in either Ames Media or aCSF with carbogen supply at room temperature. After that, immediately remove the cornea, lens, and vitreous by cutting along the ora serrata with small scissors, and remove them with forceps. Place the tissue in the incubation system at room temperature.
To remove the inner limiting membrane, transfer the eye cup containing the retina to a small glass jar containing papain, L-cysteine, EDTA, and DNAse at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Apply carbogen to the solution through the lid, but do not bubble. Stop the enzymatic digestion by placing the tissue in an ovomucoid and BSA solution for 10 minutes in Earl&#39;s BSS. Then, wash the tissue thoroughly with aCSF.
Subsequently, transfer the tissue to the incubation system and reduce the temperature to about 15 to 16 degrees Celsius. Following that, transfer the retinal tissue to the microscope; isolate the retina from the eye cup, and cut it into four pieces with a razor blade. If the entire retina is required, make four small cuts in the periphery of the retina to allow it to lie flat.
This tissue can now be transferred to the microscope for electrophysiology, or maintained in the Braincubator. The tissue is maintained in the main chamber containing the probes for pH and temperature measurements. A second chamber is isolated from the main chamber and is exposed to 1.1 watts UVC light in order to irradiate bacteria floating in the solution. Use a peristaltic pump to circulate aCSF through the two chambers, and a Peltier thermoelectric cold plate to either cool or heat the main chamber.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler