Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging at JoVE.com

We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

프로토콜은 아래의 C57BL / 6 및 C3H / 그는 (retinally 퇴화) 마우스의 신경 조직의 제조 방법을 설명하지만, 유사한 기술들이 다른 종에도 적용 할 수있다. 모든 동물은 건강하고 표준 온도 조건, 습도, 12 시간 조명 / 어두운주기, 음식과 물을 무료로 이용할 취급했고, 어떤 의도 스트레스 자극없이. 모든 실험 승인 및 웨스턴 시드니 대학 동물 관리 및 윤리위원회에 따라 수행하고 동물 사용 및 관리 지침 (동물 연구 기관 # A9452, # A10396 및 #의 A8967)에 따라되었다. 1. 뇌 조각 준비 <ol><li> 이소 플루 란 (5 %)의 흡입에 의해 동물을 마취 및 설치류 단두대를 사용하여 목을 벨. 이전 9 설명한대로, 신속하게 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 생리 솔루션 (ACSF) (단위 : mm)를 포함 넣 : 125 염화나트륨,의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2를 25 2.5의 KCl, 1NaHCO3을 25 덱 스트로스 carbogen 포화 (95 % O 2 / 5 % CO 2 혼합물 310 mOsm하여 pH 7.4). </li><li> 진동 마이크로톰 300 μm의 두께, 관심 영역에서 뇌 조각을 잘라. </li><li> 이전 10 11 바와 같이 carbogen 흐름 및 온도 - 밀접하게 모니터링하여 pH 수준 (7.4의 pH 7.2)을 제어 주문품 배양 시스템 슬라이스 전송. </li><li> 15 ~ 35 ° C로 초기 챔버 온도를 설정 - 30 분, 천천히 15로 감소 - 그림 1C에서와 같이 16 ° C. 필요할 때까지 다음 중 전기 생리학 또는 이미징, 배양 시스템에서 슬라이스를 품어. 참고 : 슬라이스가 칼슘 이미징에 사용하는 경우, RT 아래 조직을 냉각하기 전에 다음 단계를 수행합니다. </li></ol> 2. 망막 Wholemount 준비 및 내부 경계 막 제거 <ol><li> 두 정상에서 망막 wholemounts을 준비실험실 조명 조건이나 어두운 레드 / 적외선 빛. </li><li> 자궁 경부 전위 즉시 명백히하다 눈으로 동물을 안락사. 에임스 미디어, 또는 ACSF 포함하는 하나의 작은 오라 세라 따라 잘라 내기, 장소 (MM) 확인 : (125)의 NaCl을, 25의 NaHCO3, 3의 KCl, 2 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2, 10 글루코스, 0.5 L 글루타민, 및 carbogen로 포화 (2 / 5 % CO 2 혼합물을 95 % O; ~ 300 mOsm하여 pH 7.4)에서 RT. </li><li> 즉시 작은 가위로 오라 세라 따라 절단 집게로 렌즈와 유리체를 제거하여 각막, 렌즈 및 유리체를 제거합니다. 실온에서 배양 시스템에서 조직을 놓습니다. 참고 : 망막 조직이 15 느린 온도 감소 후, 눈 컵에서 유지 될 수있다 - 필요할 때까지 배양 시스템에서&gt; 24 시간 동안 16 ° C. </li><li> Earl&#39;s- 30 U / mL의 파파인, 1 MM의 L - 시스틴, 0.5 mM의 EDTA와 0.005 %의 DNase의를 포함하는 작은 유리 항아리에 망막을 포함한 눈 컵을 전송의 ILM을 제거하려면20 분 동안 37 ° C에서 균형 소금 용액 (BSS). 뚜껑을 통해 용액에 95 % O 2 / 5 % CO 2를 적용하지만 거품하지 않습니다. 젊은 동물 (&lt;6 주)에서 조직을 사용하는 경우, 반 강도 솔루션을 희석. <ol><li> 얼 BSS에서 10 분 동안 ovomucoid (10 ㎎ / ㎖) 및 BSA (10 ㎎ / ㎖) 용액에 조직을 배치하여, 소화 효소를 중지. 16 ° C - 워시 조직을 철저하게 ACSF와 배양 시스템에 전송하기 전에 15에 온도를 줄일 수 있습니다. </li></ol></li><li> 필요할 때까지 눈 컵에서 망막 조직을 유지한다. 현미경에 전송, 눈 컵에서 망막을 분리하고 면도칼 4 조각으로 잘라. 전체 망막이 필요한 경우에는 평평 할 수 있도록 망막의 주위에 4 개의 작은 상처를 만든다. 참고 : 이미징 실험, 배양 시스템에 전송하기 전에 칼슘 염료와 부하 내용은 아래를 참조하십시오. </li></ol> 3. 인큐베이터에서 조직을 유지 <ol><li&gt; pH와 온도 측정 용 프로브 (그림 1A, B)를 포함하는 메인 챔버에 넣어 조직. </li><li> 용액에 떠있는 박테리아를 방사하다하기 위해 (5W / 2P 살균기 UV 램프, 254 ㎚) 주 챔버로부터 분리 및 UVC 빛 W 1.1에 노출 (이전 12 설명한 바와 같이 내장, UVC 실) 두 번째 챔버를 통해 ACSF를 순환 (그림 1A). ACSF의 과열을 방지하기 위해 30 분 - 15 분마다 15 사이에 26 다양한 시간에 ON이 임의의 기능을 사용하여 프로그램 타이머를 통해 제어 UVC 빛 타이밍. </li><li> 12 mL의에 UVC 챔버 내의 유량을 설정 / 분으로 12 이전보고 하였다. 신경 조직을 손상시킬 수있는 챔버, UVC 외부 조명을 방지하는 알루미늄 호일로 UVC 챔버 커버. 주 : 어두운 적응 망막 조직의 경우, 빛을 제외 할 주요 챔버로 맞춤 커버를 적용합니다. </li><li> circula하는 연동 펌프를 사용하여TE 두 챔버를 통해 용액 (ACSF)와 0의 범위 내의 원하는 온도로 냉각 또는 주 챔버를 가열하거나 냉각 기능 펠티에 열전 냉각 판 - 50 ° C. 장기 생존을위한 16 ° C - 최적의 조직 배양를 들어, 15을 사용합니다. </li></ol> 4. 칼슘 염료로드 <ol><li> 개별 연구자의 선호도에 따라 칼슘 염료를 선택합니다. 여기에서 우리는의 Fura-오전 2시, FLUO-오전 8시 또는 FLUO-오전 4시를 사용합니다. 그러나,이 방법은 또한 다른 염료에 적용될 수있다 : 1 mM의 용액 및 1 %의 블록 공중 합체에 DMSO 칼슘 염료를 용해 (예를 들어, 플루로 닉 산 (127))를 10 분 동안 최종 50 μL의 부피 및 초음파 처리한다. </li><li> 망막 10 μM, 뇌 조각 0.01 %의 블록 공중 합체, 및 20 μM (망막), 0.02 %의 블록 공중 합체의 최종 농도로 용액 ACSF 추가. F 37 ° C (의 Fura-2 AM) 또는 실온에서 (FLUO-4를 오전 젊은 동물, 45 분 동안 화장실에 부하로부터 망막 (파파인 치료) 및 뇌 조각에서루오-8 AM). <ol><li> 성인 동물 (&gt; 12 주)에 대한 직접 뇌 조각 위에 염료 (50 μL)를 피펫, 그리고 깊은 층에 염료를 더 잘 침투 할 수 있도록 75 분 동안 유지한다. </li><li> 염료 배양 동안 침수 슬라이스의 충분한 산소를 보장하기 위해, ACSF 2.5 mL에 희석 칼슘 염료와 닫힌 뚜껑 (직경 2.5 cm의 원형 항아리, 3.5 cm 높이)와 유리 로딩 챔버를 준비합니다. 95 % O 2 / 5 % CO 2으로 연속적 네이트. 거품하지 마십시오. </li></ol></li><li> 실험 사용할 때까지 16 ° C - 염료로드를 따라 천천히 15 온도를 감소 배양 시스템에 ACSF 및 전송과 조직을 씻는다. </li></ol> 5. 전기 생리 녹음 및 이미지 <ol><li> 현미경 침수 기록 챔버 내에서 조직을 배치하고, (4)의 유량으로 산화 된 ACSF으로 관류 - RT (~ 22 ° C) 또는 생리적 온도에서 5 mL / 분 중 (~ 35 ° C). 홀리신장과 금 또는 백금 와이어의 U 자 모양의 조각을 통해 접착 나일론 골드 스레드로 만든 &#39;하프&#39; &#39;만든 사용자 정의를 사용하여 장소에 D 조직. </li><li> 전기 생리학의 경우 : <ol><li> 5-6 MΩ의 최종 저항을 달성하기 위해 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 1.5 mm (1.19 mm의 ID) 붕규산 유리에서 기록 피펫을 준비합니다. </li><li> 이전 13 설명 된 바와 같이 내부 솔루션의 4 μL와 CCD 카메라를 사용하여 적외선 미분 간섭 대비 (IR-DIC)에서 세포를 시각화 - 3 피펫을 입력합니다. 세포 내 용액을주의 깊게 실험 결과를 달성하기 위해 각각의 실험에 맞게 조정되어야한다. </li><li> 위치 피펫 양압을 유지하면서 미세 조작기를 이용하여 세포막에 피펫 홀더 흡입구를 통해서 주어지는. ILM이 망막에서 제거 된 이후, 더 이전에 막 스크래핑 필요가 없습니다. 피펫은 셀되면, 부드러운 음을 적용피펫에 압력이 기가 옴 밀봉을 달성했다. 이어서 부압 짧은 양의 세포막을 파열. </li><li> 해당 표준 기술을 사용하여 전체 셀 전류 또는 전압 클램프 녹음을합니다. </li></ol></li><li> 칼슘 이미징 : <ol><li> 의 Fura-2의 비율 적 이미징, 340 nm 내지 380 nm 인 여기 파장을 제공하는 초고속 파장 스위처를 사용한다. 510 ± 20 ㎚의 방출 필터를 사용하여 각 셀로부터 방출 된 광을 전달하고 고감도, 고속 디지털 카메라로 촬영. </li><li> 550 nm의 대역 통과 필터 - 515 내지 490 nm의 대역 통과 필터 및 출사 광 - FLUO-4, 필터의 여기 광 460 내지 단일 여기 파장. 가장 빠르고 가장 민감한 녹화 등의 고속 디지털 카메라를 사용합니다. 필요에 따라 이미지를 획득. </li><li> 시간의 함수 중 어느 하나의 파장 (FLUO-4) 또는 파장 비율을 이용로 형광의 변화를 측정방법은 (는 Fura-2), 미리 14 8 바와 같이. </li></ol></li></ol>

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Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

이 문서함으로써 실험 목표를 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄이고, 이미징 및 전기 생리학 실험에 급성 신경 조직의 생존을 연장하는 배양 방법을 설명합니다. 두 가지 방법은 시간에 신경 조직의 열화 관장 : ⅰ) 증가 박테리아 수준 및 방출 박테리아 독소의 동반 증가 및 외상성 슬라이싱 절차 (10)를 다음과 ⅱ) 흥분 독성. 급성 신경 조직 환경 무방비 바와 같이, 산도, 온도,...

전기 생리학 및 기능적 영상 (칼슘, 전압 감응 염료) 신경에 가장 일반적으로 사용되는 실험 기술이있다. 뇌 슬라이스 준비하고 여기에 검사됩니다 망막 wholemount은 마취제 나 근육 이완제에서 오염없이 전기 생리 특성과 시냅스 연결을 검사하는 방법을 제공합니다. 뇌 슬라이스와 망막의 특정 회로 뇌 네트워크 (1)의 연구를 허용, 문화 또는 세포 균질 달리 구조적 무결성을 유지 wholemount. 격리 된 조직에서 녹음은 심장 박동 및 호흡과 관련된 운동으로 생체 내 녹음을 통해 이점을 제거해야합니다. 또한, 직접 시각화 대상이되는 세포의 특정 클래스 및 약리 도구 2, 3의 로컬 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 패치 클램프 녹음 및 CALCIUM은 로딩 염료 망막 wholemount에는 망막 신경절 세포 (RGC) 층을 포함하고, 세포에 직접 액세스를 방지 멤브레인 (ILM)를 제한 이너의 존재에 의해 복잡하다. 일반적으로이 멤브레인은 하나의 셀에 기가 옴 씰의 패치 피펫 및 형성의 직접 적용 할 수 있도록 유리 피펫으로 긁어된다. 또한, 목욕 적용 칼슘 염료는 ILM을 통과하지 않고 하나 역행 시신경 5에서 다음 주사를 운반 또는 조직 (6)를 통해 전기 천공,이 멤브레인 (4) 아래에 주입해야합니다. 색소 성 망막염의 설치류 모델을 사용하는 경우 또한,의 RD / RD 마우스는 ILM은 두껍고 더 꿰 뚫을 수있다. 여기서는 패치 클램프 recordi 대한 망막 신경절 세포에 편재 칼슘 염료 로딩 및 직접 액세스를 모두 허용하는 효소 소화 7과 ILM을 제거하는 방법을 사용하여NGS 8. 뇌 조각 또는 망막 wholemount 중 하나에서 성공적인 녹음 해부하고 가능한 신경 조직의 배양에 따라 달라집니다. 통상적으로, 조직을 실험의 아침 추출하고,이 기록을 위해 사용될 때까지 인공 뇌척수액 (ACSF)에서 배양 하였다. 이 시간 창 다음 중요한 저하, 8 시간 - 일반적으로 조직은 6 가능한 남아있다. 그러나, 뇌 조각 wholemount 망막 제제 모두는 일반적으로 짧은 시간주기 내에서 기록 될 수있는 것보다 더 많은 조직을 생성한다. 결과적으로, 조직은 종종 일의 마지막 폐기 및 박리 후속 일 다시 종료된다. 이것은 또 다른 동물 사용 및 설치 및 해부 / 반복 염색 ~ 2 시간을 의미합니다. 다음 프로토콜이 이용되는 소수의 동물을 의미 이상을 24 시간 동안 신경 조직의 수명을 연장하는 방법을 설명하고, 실험적인 시간이 가능하다. 조직의 생존 w전기 생리 특성과 칼슘 역학을 기록을 통해 평가하고, 이러한 속성은 &lt;4 시간과&gt; 24 시간 postdissection 사이의 구별 할 수 있었다있다. 이러한 결과는 장기간 배양 후 하나의 셀 속성은 그대로하고 기능뿐만 아니라 나타냅니다 만, 칼슘 이미징 및 전기 생리 녹음에 의해 평가로 네트워크 활동은, 24&gt; 변경 시간 postdissection입니다. 또한, 우리는 칼슘 염료가 어떤 해로운 영향을주지 않고 장기간 세포에 남아있을 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜의 적용은 외부 환경이 고도로 조절되면 급성 신경 조직에서 신경 세포의 기능 활성이 장기간 유지 될 수 있음을 보여준다. 조직 생존 인해 상이한 배양 프로토콜 실험실간에 크게 변화 더욱이,이 방법은 급성 NEU의 상태에서 변화를 줄이기 위해 적용되어야 이상적인 파라미터 금 표준을 확립RONAL 조직.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

해부 다음 8 시간 - 신경 조직 준비, 뇌 조각 망막 wholemount 급성, 보통 6 유지 될 수있다. 이 실험 시간을 제한 한 연구에 따라 이용되는 동물의 수를 증가시킨다. 이러한 목욕 적용 염료의 장기간의 사전 배양을 필요로 칼슘 이미징이 제한은 특별히 영향 프로토콜을. (3) 내의 박테리아 성장 지수 - 슬라이싱 후 4 시간 단단히 조직 상태의 감소와 관련된다. 본 연구는 성장 인자를 함유하는 항생제, 멸균 방법, 또는 조직 배양 배지 없이도 시간의 장기간 (&gt; 24 h)에 대한 가능한 신경 조직을 유지하기 위하여, 급성 제제 세균의 증식을 제한하는 방법을 설명한다. UV 조사에 의해 세포 외 유체를 순환 15에서 사용자 지정 유지 챔버 내에서 조직을 유지함으로써 - 16 ° C는, 조직은 전기 생리 특성, 또는 칼슘시의 차이를 보여줍니다&gt; 24 시간 postdissection에서 세포 내 칼슘 염료를 통해 gnaling. 이러한 방법은 급성 신경 조직을 사용하는 사람들에 대한 실험 시간을 연장 할뿐만 아니라, 실험 목적을 완료하는 데 필요한 동물의 수를 줄일 것이고, 급성 신경 조직 배양 용 금 표준을 설정한다.

배양 중에 ACSF의 세균 부하 및 온도의 긴밀한 조절은 신경 조직의 생존을 유지하는 것이 필수적이다. 16 ° C (도 1) - 이는 UVC 광 조사 15에서 ACSF의 온도를 유지 통해 최적화 될 수있다. (도 1C APS), 다음 경우 사이의 변동성을 줄일 신경 조직을 배양 할 때 따라서 매개 변수를위한 황금 표준을 제공하고, 환경 조건의 기록 (pH와 온도.)와 실험자를 제공?...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저&gt; 24 시간 동안 연장 될 수있다.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

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JoVE Journal

Neuroscience

11.9K 조회수.  Western Sydney University.  8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저> 24 시간 동안 연장 될 수있다. 

비디오: Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

연구

신경과학

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

성인 소뇌 슬라이스에 장기 우울증 유도의 평가

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

For retinal whole mount preparation, immediately enucleate the eyes from a euthanized animal. Make a small cut along the ora serrata, and place the eyes in either Ames Media or aCSF with carbogen supply at room temperature. After that, immediately remove the cornea, lens, and vitreous by cutting along the ora serrata with small scissors, and remove them with forceps. Place the tissue in the incubation system at room temperature.
To remove the inner limiting membrane, transfer the eye cup containing the retina to a small glass jar containing papain, L-cysteine, EDTA, and DNAse at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Apply carbogen to the solution through the lid, but do not bubble. Stop the enzymatic digestion by placing the tissue in an ovomucoid and BSA solution for 10 minutes in Earl&#39;s BSS. Then, wash the tissue thoroughly with aCSF.
Subsequently, transfer the tissue to the incubation system and reduce the temperature to about 15 to 16 degrees Celsius. Following that, transfer the retinal tissue to the microscope; isolate the retina from the eye cup, and cut it into four pieces with a razor blade. If the entire retina is required, make four small cuts in the periphery of the retina to allow it to lie flat.
This tissue can now be transferred to the microscope for electrophysiology, or maintained in the Braincubator. The tissue is maintained in the main chamber containing the probes for pH and temperature measurements. A second chamber is isolated from the main chamber and is exposed to 1.1 watts UVC light in order to irradiate bacteria floating in the solution. Use a peristaltic pump to circulate aCSF through the two chambers, and a Peltier thermoelectric cold plate to either cool or heat the main chamber.