Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

O protocolo que se segue descreve a preparação de ratinhos C57BL / 6 e C3H / He (retinally degenerar) tecido neuronal de rato, mas técnicas semelhantes podem ser aplicados a outras espécies. Todos os animais eram saudáveis ​​e manipulados com as condições padrão de temperatura, humidade, 12 h ciclo claro / escuro, livre acesso a comida e água, e sem quaisquer estímulos de estresse pretendidos. Todos os experimentos foram aprovados e realizados de acordo com o comitê Animal Care Universidade Western Sydney e Ética e de acordo com o uso de animais e orientações de cuidados (Animal Research Autoridade # A9452, # A10396 e # A8967). 1. Cérebro Slice Preparação <ol><li> Anestesiar os animais por inalação de isoflurano (5%) e decapitar utilizando uma guilhotina roedor. Remover o cérebro rapidamente, tal como descrito anteriormente 9 e colocá-lo em solução fisiológica gelada (aCSF) contendo (em mM): NaCl 125, KCl 2,5, MgCl2 1, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25De NaHCO 3, 25 dextrose, e saturada com carbogéneo (95% O2 / 5% de mistura de CO 2; 310 mOsm; pH 7,4). </li><li> Corte fatias de cérebro, na região de interesse, 300 mm de espessura em micrótomo vibrando. </li><li> Transfira as fatias a um sistema de incubação personalizado construído que estreitamente monitora e controla os níveis de pH (pH 7,2-7,4), o fluxo de carbogênio e temperatura, como descrito anteriormente 10, 11. </li><li> Ajuste da temperatura inicial da câmara para 35 ° C durante 15 - 30 min, e em seguida reduzir-se lentamente a 15-16 ° C como mostrado na Figura 1C. Em seguida, incubar fatias no sistema de incubação até ser necessário, seja para eletrofisiologia ou imagem. NOTA: Se as fatias estão a ser utilizados para o cálcio-imagem, siga os passos abaixo antes de arrefecimento do tecido abaixo RT. </li></ol> 2. Preparação da retina Wholemount e Inner Limitando remoção da membrana <ol><li> Prepare wholemounts da retina quer em regime normal,condições de iluminação laboratoriais ou luz vermelha / infra-vermelho escuro. </li><li> Eutanásia de animais por deslocamento cervical e os olhos imediatamente enuclear. Fazer um pequeno corte ao longo da ora serrata e o lugar em ambos os meios de Ames, ou aCSF contendo (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 de KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 de glicose, 0,5 de L-glutamina, e saturar com carbogénio (95% O 2 mistura / 5% de CO 2; ~ 300 mOsm; pH 7,4), à TA. </li><li> Remover imediatamente a córnea, cristalino e vítreo cortando ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena e remover a lente e vítreo com uma pinça. Colocar o tecido no sistema de incubação à TA. NOTA: tecido retiniano pode ser mantida na de taça do olho, após a redução da temperatura lento a 15-16 ° C, durante&gt; 24 h no sistema de incubação até serem necessários. </li><li> Para remover o ILM, transferir a taça de olho contendo a retina para um pequeno frasco de vidro contendo 30 U / mL de papaína, 1 mM L-cistina, EDTA 0,5 mM e 0,005% de DNase em Earl&#39;s-Solução Salina Equilibrada (BSS) a 37 ° C durante 20 min. Aplicar 95% de O2 / 5% de CO 2 para a solução através da tampa, mas não fazer espuma. Se usando tecido de animais jovens (&lt;6 semanas), dilui-se a solução a meia-força. <ol><li> Parar a digestão enzimática, através da colocação do tecido numa solução de ovomucóide (10 mg / mL) e BSA (10 mg / mL) durante 10 min em BSS de Earl. tecido Lavar bem com aCSF antes da transferência para o sistema de incubação e reduzir a temperatura a 15-16 ° C. </li></ol></li><li> Manter o tecido da retina no olho de taça até ser necessário. Para transferência para o microscópio, isolar a retina do olho-cup e cortada em 4 pedaços com uma lâmina de barbear. Se a retina inteira é necessário, fazer quatro pequenos cortes na periferia da retina para lhe permitir ficar na posição horizontal. NOTA: Para experimentos com imagens, carga com cálcio-corantes antes da transferência para o sistema de incubação, veja abaixo. </li></ol> 3. Manter Tissue na Incubadora <ol><li&gt; Tecido Lugar na câmara principal contendo sondas para medições de pH e de temperatura (Figura 1A, B). </li><li> Circular aCSF através de uma segunda câmara (câmara UVC, construído como anteriormente descrito 12) isolado a partir da câmara principal e exposto a 1,1 W de luz UVC (254 nm, lâmpada UV 5W / 2P esterilizador), a fim de eradiate bactérias que flutuam na solução (Figura 1A). Controle UVC tempo de luz através de um timer programável usando um recurso aleatório que liga às vezes variando entre 15 e 26 min a cada 15-30 minutos para evitar o aquecimento excessivo do aCSF. </li><li> Definir a taxa de fluxo na câmara UVC a 12 mL / min conforme relatado anteriormente 12. Cubra a câmara UVC com papel alumínio para evitar UVC iluminação no exterior da câmara, o que pode danificar o tecido neuronal. NOTA: Para o tecido da retina de adaptação ao escuro, aplique uma capa feita sob medida para a câmara principal para eliminar a luz. </li><li> Use uma bomba peristáltica para Circulate a solução (aCSF) através das duas câmaras e uma placa fria termoeléctrico refrigerador Peltier para refrigeração ou o aquecimento, quer a câmara principal para as temperaturas desejadas na gama de 0 - 50 ° C. Para a incubação de tecido óptima, usar 15-16 ° C durante a viabilidade a longo prazo. </li></ol> 4. O cálcio corante de carregamento <ol><li> Selecione corantes de cálcio com base na preferência do pesquisador individual. Aqui usamos Fura-02:00, Fluo-08:00 ou Fluo-04:00. No entanto, este método pode ser aplicado a outros corantes, bem como: dissolver corantes de cálcio em DMSO a uma solução de copolímeros de 1 mM e 1% de bloco (por exemplo, ácido-127 plurónico) para um volume final de 50 mL e sonicado durante 10 minutos. </li><li> Adicionar a solução de aCSF a uma concentração final de 10 uM, copolímeros em bloco 0,01% de fatias cerebrais, e 20 uM (retina), copolímeros em bloco 0,02% para a retina. Na retina (papaína tratados) e fatias de cérebro de animais jovens, de carga para o banho durante 45 minutos a 37 ° C (Fura-2 AM) ou à TA (Fluo-4 AM; FLuo-08:00). <ol><li> Para animais adultos, (&gt; 12 semanas), pipetar os corantes (50 ul) directamente sobre as fatias de cérebro, e manter por 75 min para permitir uma melhor penetração do corante nas camadas profundas. </li><li> Para garantir uma oxigenação adequada do fatia submersa durante a incubação corante, preparar uma câmara de carga de vidro com uma tampa fechada (frasco circular de 2,5 cm de diâmetro, 3,5 centímetros de altura) com corantes de cálcio diluída em 2,5 mL de aCSF. Oxigenar continuamente com 95% O2 / 5% de CO 2. não bolha. </li></ol></li><li> Após carga de corante, lavar o tecido com aCSF e transferência para o sistema de incubação, reduzir-se lentamente a temperatura a 15-16 ° C até à sua utilização experimental. </li></ol> 5. As gravações eletrofisiológicas e imagem <ol><li> Colocar o tecido numa câmara de registo submersa sob um microscópio, e perfundir com aCSF oxigenado a um caudal de 4-5 ml / min, quer à TA (~ 22 ° C) ou à temperatura fisiológica (~ 35 ° C). hold o tecido no seu lugar por um feito usando &#39;&#39; harpa &#39;&#39;, feito de fios de nylon ou de ouro esticada e colada através de uma peça em forma de U, de ouro ou de fio de platina. </li><li> Para eletrofisiologia: <ol><li> Prepare pipetas de gravação de 1,5 mm (1,19 milímetros ID) vidro de borosilicato usando um extrator micropipeta para conseguir uma resistência final dos 5-6 mohms. </li><li> Encha a pipeta com 3-4 mL de solução interna como descrito anteriormente 13 e visualizar células sob infravermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC) usando uma câmera CCD. A solução intracelular devem ser cuidadosamente adaptado para cada experimento para alcançar resultados experimentais. </li><li> Posição pipeta, enquanto se mantém a pressão positiva aplicada através de uma porta de sucção no suporte da pipeta, sobre a membrana de uma célula utilizando um micromanipulador. Uma vez que a ILM foi removido a partir da retina, sem raspagem membrana prévia é necessária. Uma vez que a pipeta está na célula, aplicar negativo suavepressão para a pipeta para obter uma vedação gigaohm. Em seguida, ruptura da membrana celular com uma breve quantidade de pressão negativa. </li><li> Fazer gravações de observação de correntes ou de tensão-clamp de células inteiras usando técnicas padrão, conforme apropriado. </li></ol></li><li> Cálcio-imaging: <ol><li> Para geração de imagens raciométrica de Fura-2, use um comutador de comprimento de onda ultra-alta velocidade para proporcionar a comprimentos de onda de excitação de 340 nm e 380 nm. Passar a luz emitida a partir de células individuais através de um filtro de emissão de 510 ± 20 nm, e capturar com uma sensibilidade elevada, a câmara digital de alta velocidade. </li><li> Para um único comprimento de onda de excitação de Fluo-4, luz de excitação do filtro através de um 460 - banda nm filtro passa-490 e luz emitida através de um 515 - filtro passa banda nm 550. Para a gravação mais rápida e mais sensível usar uma câmera digital de alta velocidade tal. Adquirir imagens conforme necessário. </li><li> Medir alterações na fluorescência como uma função do tempo, quer a um único comprimento de onda (Fluo-4) ou utilizando o rácio de comprimento de ondamétodo (Fura-2), tal como descrito anteriormente 8, 14. </li></ol></li></ol>

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	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3.">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves.">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li><li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina.">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396 (2014).</li><li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Ca2++dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina.">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588 (2015).</li><li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells.">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li><li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue.">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li><li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons.">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li><li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braincubator:+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology.">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li><li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Device+for+storing+a+tissue+sample.">Device for storing a tissue sample.</a> WIPO Patent. , (2015).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+viability+of+acute+brain+slices.">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li><li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices.">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

Este artigo descreve um método de incubação para estender a viabilidade do tecido neuronal aguda para geração de imagens e eletrofisiológicos experimentos, reduzindo assim o número de animais necessários para completar objetivos experimentais. Dois processos principais governam a deterioração do tecido neuronal ao longo do tempo: i) aumento dos níveis de bactérias, eo aumento de acompanhamento endotoxina bacteriana lançado, e ii) excitotoxicidade que segue o procedimento de corte traumática <sup class="xre...

Eletrofisiologia e imagens funcionais (cálcio, tensão corantes sensíveis) são duas das técnicas experimentais mais comumente usados ​​em neurociência. preparações fatia do cérebro e da retina wholemount, que será analisada aqui, fornecer um meio de examinar propriedades eletrofisiológicas e conectividade sináptica sem contaminação de anestésicos e relaxantes musculares. Fatias de cérebro e da retina Wholemount manter a sua integridade estrutural, ao contrário de culturas ou homogeneizados celulares, permitindo o estudo de circuitos específicos e redes cerebrais 1. Gravações de tecido isolado têm vantagens sobre em gravações vivo como os movimentos associados ao batimento cardíaco e respiração são eliminados. Além disso, a visualização direta permite que classes específicas de células a serem alvejados e aplicação local de ferramentas farmacológicas 2, 3. gravações de patch-clamp e calcio-corante de carga em wholemount retina é complicado devido à existência da membrana interna limitante (ILM), que cobre a camada de células ganglionares da retina (RGC) e impede o acesso directo às células. Tipicamente, esta membrana é raspada com uma pipeta de vidro para permitir a aplicação directa de uma pipeta de adesivo e a formação de uma vedação gigaohm numa única célula. Além disso, os corantes de cálcio aplicado-banho não atravessar a ILM e quer deve ser injetado sob essa membrana 4, transportado retrogradamente a seguir à injecção no nervo óptico 5 ou electroporadas através do tecido 6. Além disso, quando se utiliza um modelo de roedor de retinite pigmentosa, o rato rd / rd, a ILM é mais espessa e mais impenetrável. Aqui, usamos uma técnica para remover a ILM com a digestão enzimática 7, para permitir que tanto o cálcio onipresente corante de carregamento, e acesso directo à células ganglionares da retina para patch-clamp recordiNGS 8. gravações bem sucedidas a partir de qualquer fatias cerebrais ou da retina wholemount depender de dissecção e de incubação de tecido neuronal viável. Tipicamente, o tecido é extraído na manhã da experiência e incubada em fluido cerebrospinal artificial (aCSF) até que seja usada para gravações. Geralmente, o tecido permanece viável durante 6 - 8 h, com uma degradação significativa após esta janela de tempo. No entanto, ambas as fatias de cérebro e preparações retinae wholemount costumam produzir mais tecido do que pode ser gravado a partir de dentro deste período de tempo curto. Consequentemente, o tecido é muitas vezes descartados no final do dia e a dissecção é completada novamente nos dias subsequentes. Isso significa que um outro animal é utilizado e ~ 2 h de configuração e dissecção / coloração repetida. O protocolo seguinte descreve um método para aumentar a vida útil do tecido neuronal durante mais de 24 h, o que significa que menos animais são utilizados, e mais tempo experimental está disponível. Tissue viabilidade wcomo avaliado por meio de gravação propriedades eletrofisiológicas e dinâmica do cálcio, e essas propriedades eram indistinguíveis entre &lt;4 h e&gt; 24 h postdissection. Estes resultados indicam que não só são propriedades de uma única célula intacta e funcional após incubação prolongada, mas a atividade da rede, tal como avaliado por cálcio e de imagiologia e registos electrofisiolicos, mantém-se inalterado&gt; 24 h postdissection. Além disso, mostramos que os corantes de cálcio pode permanecer nas células durante períodos prolongados, sem causar quaisquer efeitos prejudiciais. A aplicação deste protocolo demonstra que a actividade funcional de neurónios no tecido neuronal aguda pode ser mantida por períodos longos, uma vez que o ambiente externo é altamente regulado. Além disso, como a viabilidade do tecido varia muito entre laboratórios devido a diferentes protocolos de incubação, este método estabelece um padrão de ouro para os parâmetros ideais que devem ser aplicadas para reduzir a variabilidade na saúde de neu agudatecido ronal.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

Aguda preparações de tecidos neuronais, fatias de cérebro e da retina wholemount, normalmente só pode ser mantida durante 6-8 h após a dissecação. Isto limita o tempo experimental, e aumenta o número de animais que são utilizados por cada estudo. Esta limitação especificamente impactos protocolos como imagem de cálcio que exigem prolongada pré-incubação com corantes aplicados-banho. exponencial do crescimento bacteriano dentro de 3 - 4 h após o corte é fortemente correlacionada com uma diminuição na saúde dos tecidos. Este estudo descreve um método para limitar a proliferação de bactérias em preparações agudas, para manter o tecido neuronal viável durante períodos de tempo prolongados (&gt; 24 h) sem a necessidade de antibióticos, procedimentos de esterilização, ou meios de cultura de tecidos contendo factores de crescimento. E ligando o fluido extracelular por meio de irradiação UV e manter o tecido numa câmara de retenção costume em 15-16 ° C, o tecido não mostra nenhuma diferença de propriedades electrofisiológicas, ou Si cálciognaling através corantes de cálcio intracelular em&gt; 24 h postdissection. Estes métodos não só irá aumentar o tempo experimental para aqueles que utilizam tecido neuronal aguda, mas irá reduzir o número de animais necessários para completar objectivos experimentais, e irá definir um padrão de ouro para a incubação do tecido neuronal aguda.

regulação apertada da carga bacteriana e a temperatura do aCSF durante a incubação é essencial para manter a viabilidade do tecido neuronal. Isto pode ser optimizado por meio de irradiação com luz UVC e mantendo a temperatura do aCSF a 15-16 ° C (Figura 1). Além disso, o aCSF os parâmetros de selo (APS; Figura 1C) fornece o experimentador com um registro das condições ambientais (pH e temperatura.), Oferecendo assim um padrão de ouro para os...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por&gt; 24 h.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K visualizações.  Western Sydney University.  Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por> 24 h. 

Vídeo: Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Neurociência

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

Medindo a atividade neural em uma fatia de cérebro de camundongo após incubação prolongada

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

For retinal whole mount preparation, immediately enucleate the eyes from a euthanized animal. Make a small cut along the ora serrata, and place the eyes in either Ames Media or aCSF with carbogen supply at room temperature. After that, immediately remove the cornea, lens, and vitreous by cutting along the ora serrata with small scissors, and remove them with forceps. Place the tissue in the incubation system at room temperature.
To remove the inner limiting membrane, transfer the eye cup containing the retina to a small glass jar containing papain, L-cysteine, EDTA, and DNAse at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Apply carbogen to the solution through the lid, but do not bubble. Stop the enzymatic digestion by placing the tissue in an ovomucoid and BSA solution for 10 minutes in Earl&#39;s BSS. Then, wash the tissue thoroughly with aCSF.
Subsequently, transfer the tissue to the incubation system and reduce the temperature to about 15 to 16 degrees Celsius. Following that, transfer the retinal tissue to the microscope; isolate the retina from the eye cup, and cut it into four pieces with a razor blade. If the entire retina is required, make four small cuts in the periphery of the retina to allow it to lie flat.
This tissue can now be transferred to the microscope for electrophysiology, or maintained in the Braincubator. The tissue is maintained in the main chamber containing the probes for pH and temperature measurements. A second chamber is isolated from the main chamber and is exposed to 1.1 watts UVC light in order to irradiate bacteria floating in the solution. Use a peristaltic pump to circulate aCSF through the two chambers, and a Peltier thermoelectric cold plate to either cool or heat the main chamber.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Resumo

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