We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Il protocollo seguente descrive la preparazione di C57BL / 6 e C3H / He (retinally degeneri) tessuto neuronale mouse, ma le tecniche simili possono essere applicati ad altre specie. Tutti gli animali erano sani e maneggiato con condizioni standard di temperatura, umidità, 12 ore di luce / buio ciclo, libero accesso a cibo e acqua, e senza stimoli di stress previsti. Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti in accordo con il comitato Occidentale Sydney University cura degli animali e etica e secondo l&#39;uso animale e le linee guida per la cura degli animali (Research Autorità # A9452, # A10396 e # A8967). 1. Cervello Fetta Preparazione <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale per inalazione di isoflurano (5%) e decapitare utilizzando una ghigliottina roditore. Rimuovere il cervello rapidamente, come descritto in precedenza 9 e posizionarlo nella soluzione ghiacciata fisiologica (aCSF) contenente (in mM): 125 NaCl, KCl 2,5, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25NaHCO 3, 25 destrosio, e saturata con CarboGen (95% O 2/5% della miscela di CO 2; 310 mOsm; pH 7,4). </li><li> Tagliare sezioni di cervello, nella regione di interesse, 300 micron di spessore con un microtomo vibrante. </li><li> Trasferire le fette di un sistema di incubazione su misura che monitora e controlla i livelli di pH (pH 7,2-7,4) da vicino, il flusso di CarboGen, e la temperatura come descritto in precedenza 10, 11. </li><li> Impostare temperatura iniziale della camera a 35 ° C per 15 - 30 min, e poi lentamente ridurre a 15 - 16 ° C, come mostrato nella Figura 1C. Incubare fette nel sistema di incubazione fino a quando necessario, sia per elettrofisiologia o imaging. NOTA: se devono essere utilizzati per il calcio fette imaging, seguire i passi di seguito prima di raffreddamento del tessuto sotto RT. </li></ol> 2. retina Wholemount Preparazione e interna rimozione membrana limitante <ol><li> Preparare wholemounts retina in entrambi i normalicondizioni di illuminazione di laboratorio o fioca luce rossa / infrarossi. </li><li> L&#39;eutanasia degli animali da dislocazione cervicale e immediatamente gli occhi enucleare. Fare un piccolo taglio lungo la serrata, e il luogo in entrambe le Ames dei media, o aCSF contenente (mm): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 di glucosio, 0.5 L-glutammina, e saturare con CarboGen (95% O 2/5% CO 2 miscela; ~ 300 mOsm; pH 7,4), a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere immediatamente la cornea, cristallino e vitreo tagliando lungo la serrata con piccole forbici e la rimozione del cristallino e corpo vitreo con una pinza. Posizionare il tessuto nel sistema di incubazione a RT. NOTA: tessuto retinico può essere mantenuta nell&#39;occhio coppa, dopo la riduzione di temperatura lento a 15 - 16 ° C, per&gt; 24 ore nel sistema di incubazione fino a quando necessario. </li><li> Per rimuovere la ILM, trasferire l&#39;occhio-tazza contenente la retina un vasetto di vetro contenente papaina 30 U / mL, 1 mM L-cistina, 0,5 mM EDTA e 0,005% in DNasi Earl&#39;s-Soluzione salina bilanciata (BSS) a 37 ° C per 20 min. Applicare 95% O 2/5% di CO 2 alla soluzione attraverso il coperchio ma non fare bolle. Se si utilizza il tessuto da animali giovani (&lt;6 settimane), diluire la soluzione a mezza forza. <ol><li> Arrestare digestione enzimatica, posizionando il tessuto in una soluzione ovomucoid (10 mg / mL) e BSA (10 mg / ml) per 10 min in BSS Earl. tessuto Lavare accuratamente con aCSF prima del trasferimento al sistema di incubazione e ridurre la temperatura a 15 - 16 ° C. </li></ol></li><li> Mantenere tessuto retinico in un occhio-tazza fino a quando necessario. Per il trasferimento al microscopio, isolare la retina dall&#39;occhio-tazza e tagliato in 4 pezzi con una lametta. Se è richiesta l&#39;intera retina, fare quattro piccoli tagli nella periferia della retina per permettere di distendersi. NOTA: Per gli esperimenti di imaging, carico con calcio-coloranti prima del trasferimento al sistema di incubazione, vedere di seguito. </li></ol> 3. Il mantenimento dei tessuti nell&#39;incubatrice <ol><li&gt; Posizionare tessuto nella camera principale contenente sonde per misure di pH e temperatura (Figura 1A, B). </li><li> Circolare aCSF attraverso una seconda camera (camera UVC, costruito come descritto in precedenza 12) isolata dalla camera principale ed esposti a 1,1 W luce UVC (254 nm, 5W / 2P sterilizzatrice lampada UV) per eradiate batteri galleggiano nella soluzione (Figura 1A). temporizzazione luce controllo UVC tramite un timer programmabile tramite una funzione casuale che si attiva in tempi variabili tra 15 e 26 min ogni 15 - 30 min per evitare eccessivo riscaldamento del aCSF. </li><li> Impostare la portata nella camera UVC a 12 ml / min come riportato in precedenza 12. Coprire la camera UVC con un foglio di alluminio per evitare l&#39;illuminazione UVC di fuori della camera, che può danneggiare il tessuto neuronale. NOTA: per tessuto retinico adattata al buio, applicare una copertura su misura per la camera principale per escludere la luce. </li><li> Utilizzare una pompa peristaltica a circulate la soluzione (aCSF) attraverso le due camere e una piastra termoelettrico Peltier cooler per raffreddarsi o riscaldare la camera principale alle temperature desiderate nell&#39;intervallo 0 - 50 ° C. Per incubazione del tessuto ottimale, utilizzare 15 - 16 ° C per la redditività a lungo termine. </li></ol> 4. Il calcio Dye Caricamento <ol><li> Selezionare coloranti di calcio in base alla preferenza del singolo ricercatore. Qui usiamo Fura-02:00, Fluo-08:00 o Fluo-4 del mattino. Tuttavia, questo metodo può essere applicato ad altri coloranti così: sciogliere coloranti calcio in DMSO ad una soluzione 1 mM e 1% di copolimeri a blocchi (es, acido-127 Pluronic) ad un volume finale di 50 microlitri e ultrasuoni per 10 min. </li><li> Aggiungere la soluzione al aCSF ad una concentrazione finale di 10 mM, 0,01% copolimeri a blocchi di fettine cerebrali, e 20 pM (retina), 0,02% copolimeri a blocchi per la retina. In retinae (papaina trattato) e sezioni di cervello da animali giovani, carico al bagno per 45 min a 37 ° C (Fura-2 AM) o RT (Fluo-4 del mattino; Fluo-08:00). <ol><li> Per gli animali adulti, (&gt; 12 settimane) pipettare i coloranti (50 ml) direttamente sui sezioni di cervello, e mantenere per 75 minuti per consentire una migliore penetrazione del colorante negli strati profondi. </li><li> Per assicurare un&#39;adeguata ossigenazione della fetta sommersa durante l&#39;incubazione colorante, preparare un vetro camera di carico con coperchio chiuso (barattolo circolare del diametro di 2,5 cm, 3,5 cm di altezza) con coloranti calcio diluito in 2,5 mL di aCSF. Ossigenare continuamente con il 95% O 2/5% di CO 2. Non farlo bolla. </li></ol></li><li> Dopo dye carico, lavare il tessuto con aCSF e trasferimento al sistema di incubazione, ridurre lentamente la temperatura a 15 - 16 ° C fino al momento dell&#39;uso sperimentale. </li></ol> 5. elettrofisiologiche Recordings e Imaging <ol><li> Posizionare il tessuto in una camera di registrazione sommerso sotto un microscopio, e profumato con ossigenato aCSF ad una portata di 4 - 5 mL / min sia a RT (~ 22 ° C) o temperatura fisiologica (~ 35 ° C). Hold il tessuto in luogo utilizzando un custom made &#39;&#39; arpa &#39;&#39;, realizzato in nylon o in oro le discussioni tese e incollate su un pezzo a forma di U di oro o filo di platino. </li><li> Per elettrofisiologia: <ol><li> Preparare pipette di registrazione da 1,5 mm (1,19 millimetri ID) in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta per ottenere una resistenza finale di 5-6 MW. </li><li> Riempire la pipetta con 3-4 ml di soluzione interna come descritto in precedenza 13 e visualizzare le cellule sotto infrarossi interferenza differenziale contrasto (IR-DIC) utilizzando una telecamera CCD. La soluzione intracellulare deve essere attentamente su misura per ogni esperimento per ottenere risultati sperimentali. </li><li> Posizione pipetta, mantenendo una pressione positiva applicata attraverso una porta di aspirazione sul supporto pipetta, sulla membrana di una cellula con un micromanipolatore. Poiché la ILM è stato rimosso dalla retina, non è richiesta alcuna raschiare membrana prima. Una volta che la pipetta è sulla cella, applicare delicato negativopressione alla pipetta per ottenere una tenuta gigaohm. Poi rompere la membrana cellulare con una breve quantità di pressione negativa. </li><li> Effettuare registrazioni current- o tensione-clamp cellule intere utilizzando tecniche standard a seconda dei casi. </li></ol></li><li> Calcio-immagini: <ol><li> Per l&#39;imaging raziometrico di Fura-2, utilizzare un ultra-alta lunghezza d&#39;onda switcher velocità per offrire lunghezze d&#39;onda di eccitazione di 340 nm e 380 nm. Far passare la luce emessa da singole cellule attraverso un filtro di emissione di 510 ± 20 nm, e catturare con un&#39;elevata sensibilità, fotocamera digitale ad alta velocità. </li><li> Per una singola lunghezza d&#39;onda di eccitazione di Fluo-4, la luce filtro di eccitazione attraverso un 460 - filtro passa banda nm 490 e la luce emessa attraverso un 515 - filtro passa banda nm 550. Per la registrazione più veloce e sensibile utilizzare una fotocamera digitale ad alta velocità tale. Acquisire immagini come richiesto. </li><li> Misurare alterazioni di fluorescenza in funzione del tempo sia ad una sola lunghezza d&#39;onda (Fluo-4) o utilizzando il rapporto di lunghezza d&#39;ondaMetodo (Fura-2), come precedentemente descritto 8, 14. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording.">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, 117-125 (2006).</li><li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+sliced+tissues.">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li><li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. 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L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li><li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse.">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9 (2007).</li><li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).</li></ol>

Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

Questo articolo descrive un metodo di incubazione per estendere la vitalità del tessuto neuronale acuta per immagini ed elettrofisiologici esperimenti, riducendo così il numero di animali necessari per completare obiettivi sperimentali. Due processi principali governano il deterioramento del tessuto neuronale nel tempo: i) un aumento dei livelli di batteri, e il conseguente aumento endotossina batterica rilasciato, e ii) eccitotossicità che segue la procedura affettamento traumatica 10. Come t...

Elettrofisiologia e di imaging funzionale (calcio, tensione di coloranti sensibili) sono due delle tecniche sperimentali più comunemente utilizzati nel campo delle neuroscienze. preparati fetta del cervello e della retina wholemount, che sarà esaminato qui, forniscono un mezzo per esaminare le proprietà elettrofisiologiche e connettività sinaptica senza contaminazione da anestetici o miorilassanti. Fettine di cervello e della retina wholemount mantenere la loro integrità strutturale, a differenza di culture o omogenati cellulari, permettendo lo studio di circuiti specifici e reti del cervello 1. Le registrazioni dal tessuto isolato presentano vantaggi rispetto vivo registrazioni i movimenti connessi con il battito cardiaco e la respirazione sono eliminati. Inoltre, la visualizzazione diretta permette specifiche classi di celle da mirati, e l&#39;applicazione locale di strumenti farmacologici 2, 3. registrazioni patch-clamp e calcIUM Dye-carico in wholemount retina è complicato dalla presenza di Inner Limitazione membrana (ILM), che copre lo strato di cellule gangliari della retina (RGC) e impedisce l&#39;accesso diretto alle cellule. Tipicamente, questa membrana è raschiato via con una pipetta di vetro per consentire l&#39;applicazione diretta di una pipetta di patch e la formazione di un sigillo gigaohm su una singola cella. Inoltre, coloranti calcio bagno-applicata non attraversano la ILM e devono o essere iniettato sotto questa membrana 4, retrograda trasportato dopo l&#39;iniezione al nervo ottico o 5 elettroporate attraverso il tessuto 6. Inoltre, quando si utilizza un modello di roditore di retinite pigmentosa, il mouse rd / rd, la ILM è più spessa e più impenetrabile. Qui, si usa una tecnica per rimuovere il ILM con digestione enzimatica 7, per consentire sia onnipresente calcio dye-carico e l&#39;accesso diretto alle cellule gangliari della retina per recordi patch-clampngs 8. registrazioni di successo da entrambi fettine di cervello o wholemount retina dipendono da dissezione e l&#39;incubazione del tessuto neuronale vitali. Tipicamente, il tessuto viene estratto il mattino dell&#39;esperimento ed incubato nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) fino al suo utilizzo per le registrazioni. Di solito, il tessuto rimane vitale per 6 - 8 ore, con notevole degrado in seguito questa finestra temporale. Tuttavia, entrambe le fettine di cervello e preparati RETINÆ wholemount solito producono più tessuto che può essere registrata all&#39;interno di questo breve periodo di tempo. Di conseguenza, il tessuto è spesso scartata alla fine della giornata e la dissezione è completata nuovamente nei giorni successivi. Questo significa che un altro animale è utilizzato e ~ 2 ore di messa a punto e la dissezione / colorazione ripetuto. Il protocollo che segue descrive un metodo per prolungare la durata del tessuto neuronale per più di 24 ore, il che significa meno animali vengono utilizzati, e il tempo più sperimentale è disponibile. Tissue vitalità wvalutata attraverso la registrazione di proprietà elettrofisiologiche e le dinamiche del calcio, e queste proprietà erano indistinguibili tra &lt;4 ore e&gt; 24 ore postdissection. Questi risultati indicano che non solo sono proprietà delle celle singole intatte e funzionali dopo incubazione prolungata, ma l&#39;attività di rete, come valutato dal calcio-imaging e registrazioni elettrofisiologiche, è invariato&gt; 24 h postdissection. Inoltre, dimostriamo che coloranti calcio possono rimanere nelle cellule per periodi prolungati senza provocare effetti dannosi. L&#39;applicazione di questo protocollo dimostra che l&#39;attività funzionale dei neuroni nel tessuto neuronale acuta può essere mantenuta per lunghi periodi, una volta che l&#39;ambiente esterno è altamente regolata. Inoltre, come la vitalità del tessuto varia notevolmente tra i laboratori a causa di diversi protocolli di incubazione, questo metodo stabilisce un gold standard per i parametri ideali che dovrebbero essere applicati per ridurre la variabilità nella salute di Neu acutatessuto Ronal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="831">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich VETEC</td>
			<td style="width:135px;">V800372</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P9333</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M2004&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">D-glucose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">G5767</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S6014</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">S2554</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">M9272&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:315px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">223506</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:159px;">Worthington&#160;</td>
			<td style="width:135px;">LK003150</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide anhydrous</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">276855</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;">Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td>
			<td style="width:159px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">P-6867</td>
			<td style="width:225px;">20% solution in DMSO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:315px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fura-2 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Anaspec</td>
			<td style="width:135px;">84017</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-4 AM&#160;&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">F23917</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fluo-8 AM</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:135px;">Ab142773</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:315px;">Vibrating blade microtome&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Biosystem</td>
			<td style="width:135px;">VT1200 S</td>
			<td style="width:225px;">Equiped with Leica&#8217;s Vibrocheck&#8482; measurement device&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Antivibration table</td>
			<td style="width:159px;">Kinetic Systems Vibraplane&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Vibraplane 9100/9200&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Fixed Stage Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">BX51WI&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">20X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microscope Objective</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">LUMPlanFLN 60x/1.00w</td>
			<td style="width:225px;">60X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Ixon +</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">High speed wavelength switcher</td>
			<td style="width:159px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:135px;">Lambda DG-4&#160;</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Data acquisition system</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:225px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">BF150-86-10</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Microelectrode puller</td>
			<td style="width:159px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:135px;">P-97</td>
			<td style="width:225px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:135px;">RC-40LP</td>
			<td style="width:225px;">Low Profile Open Bath Chambers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Software</td>
			<td style="width:159px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:135px;">pClamp 10.2</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Andor iQ Live Cell Imaging Software</td>
			<td style="width:159px;">Andor</td>
			<td style="width:135px;">Andor iQ3</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">Braincubator</td>
			<td style="width:159px;">Payo Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BR26021976</td>
			<td style="width:225px;">www.braincubator.com.au</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>CP-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Controller</td>
			<td>TE Technology</td>
			<td>TC-36-25 RS232</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

Acuta preparati tessuto neuronale, fettine di cervello e della retina wholemount, di solito può essere mantenuta solo per 6-8 ore dopo la dissezione. Ciò limita il tempo sperimentale, e aumenta il numero di animali che sono utilizzate per studio. Questa limitazione in particolare gli impatti protocolli come l&#39;imaging di calcio che richiedono una prolungata pre-incubazione con coloranti vasca da applicare. crescita batterica esponenziale entro 3 - 4 h dopo il taglio è strettamente correlata con una diminuzione della salute dei tessuti. Questo studio descrive un metodo per limitare la proliferazione di batteri preparati acute per mantenere il tessuto neuronale vitale per periodi prolungati di tempo (&gt; 24 h) senza la necessità di antibiotici, procedure sterili o terreni di coltura contenenti fattori di crescita. Con ciclismo liquido extracellulare tramite irradiazione UV e mantenendo il tessuto in una camera di contenimento personalizzati 15 - 16 ° C, il tessuto non mostra differenze nelle proprietà elettrofisiologiche, o si calciognaling attraverso coloranti intracellulari di calcio a&gt; 24 h postdissection. Questi metodi non solo estendere il tempo di sperimentazione per coloro che utilizzano il tessuto neuronale acuta, ma ridurrà il numero di animali necessari per completare gli obiettivi sperimentali, e stabiliscono un gold standard per l&#39;incubazione del tessuto neuronale acuta.

stretta regolazione della carica batterica e la temperatura del aCSF durante l&#39;incubazione è essenziale per mantenere la vitalità del tessuto neuronale. Questo può essere ottimizzato mediante irraggiamento con luce UVC e mantenendo la temperatura della aCSF a 15 - 16 ° C (Figura 1). Inoltre, il aCSF parametri di bollo (APS; Figura 1C) fornisce lo sperimentatore con un record delle condizioni ambientali (pH e temperatura.), Offrendo così un gold ...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Una volta rimosso dal corpo, tessuto neuronale è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, con conseguente eventuale degradazione del tessuto dopo 6 - 8 h. Utilizzando un metodo incubazione unica, che monitora e regola l&#39;ambiente extracellulare del tessuto, vitalità del tessuto può essere significativamente prolungata per&gt; 24 h.

L&#39;incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  Western Sydney University.  Una volta rimosso dal corpo, tessuto neuronale è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, con conseguente eventuale degradazione del tessuto dopo 6 - 8 h. Utilizzando un metodo incubazione unica, che monitora e regola l'ambiente extracellulare del tessuto, vitalità del tessuto può essere significativamente prolungata per> 24 h. 

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Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Crioconservazione di tessuto corticale blocchi per la generazione di altamente arricchito Culture neuronale

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Real-time Elettrofisiologia: utilizzando protocolli a circuito chiuso per sonda neuronali Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Microinjectrode System for Combined Drug Infusion and Electrophysiology

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes and nanosensors, optimized for repeated use in awake, behaving animals. The microinjectrode system can be configured for multiple purposes: (1) simple arrangement of the cannula for placement of an experimental probe that would otherwise be too fragile to penetrate the dura mater, (2) microfluidic infusion of a drug, either independently or coupled to a cannula containing an experimental probe (i.e., microelectrode, nanosensor). In this protocol we explain the step by step construction of the microinjectrode, its coupling to microfluidic components, and the protocol for use of the system in vivo. The microfluidic components of this system allow for delivery of volumes on the nanoliter scale, with minimal penetration damage. Drug infusion can be performed independently or simultaneously with experimental probes such as microelectrodes or nanosensors in an awake, behaving animal. Applications of this system range from measuring the effects of a drug on cortical electrical activity and behavior, to understanding the function of a specific region of cortex in the context of behavioral performance based on probe or nanosensor measurements. To demonstrate some of the capabilities of this system, we present an example of muscimol infusion for reversible inactivation of the frontal eye field (FEF) in rhesus macaque during a working memory task.

We present a microinjectrode system designed for electrophysiology and assisted delivery of experimental probes (i.e., nanosensors, microelectrodes), with optional drug infusion. Widely available microfluidic components are coupled to a cannula containing the probe. A step-by-step protocol for microinjectrode construction is included, with results during muscimol infusion in macaque cortex.

Sistema di microinietatra per l'infusione combinata di farmaci e l'elettrofisiologia

This microinjectrode system is designed for drug infusion, electrophysiology, and delivery and retrieval of experimental probes, such as microelectrodes ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

Coltura di periciti capillari cerebrali per misurazioni citosoliche del calcio e studi di imaging del calcio

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

L'incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

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