This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu <ol><li> Büyüme ortamı fare nöroblastom 2a (N2a) hücreleri korumak. <ol><li> Yüksek glikoz 200 mi Dulbecco&#39;nun Eagle ortamında (DMEM) 500 mi N2a büyüme ortamı yapmak, 250 mi, serum ortamı, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), düşük ve 5 ml penisilin / streptomisin (100 X). </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de bir T75 şişesi içinde hücreleri korumak. </li><li> Bölünmüş hücreler 01:15 gerektiğinde, ya da yaklaşık% 80-90 confluency. Bu genellikle haftada 2-3 kez olduğunu. </li></ol></li><li> Coat 35 mm cam poli-D-lizin ile alt çanak. <ol><li> Laminer akış biyo-güvenlik kabini, steril 35 mm çanak cam alt bölgesi üzerine 0.1 ug / ml poli-D-lisin 200 ul ekle. </li><li> 1 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde çanak yerleştirin. </li><li> Dikkatle GKD 2 O 3-4 kez yemek durulayın. </li><li> Birden fazla 1 saat boyunca yemekler tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> SterilGerekirse biyogüvenlik kabini UV ışık kullanarak yemekleri ize. </li></ol></li><li> TIRFM görüntüleme için N2a hücreler plaka. <ol><li> yapışık hücrelere büyüme ortamı çıkarın. </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 1 ml 1 x tripsin (+ EDTA) ile inkübe edilerek şişe bundan sonrakinden hücrelerin ayrılmaları. </li><li> 9 ml büyüme ortamı ekleyerek tripsin inaktive. Bir pipet kullanarak medya, tripsin ve müstakil hücreleri karıştırın. </li><li> Görme hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısı ve her bir poli-D-lizin kaplı cam alt çanak 90.000 hücre eklemek için doğru hacmi hesaplamak. Bu yoğunluk etkin transfeksiyon ve tek bir hücre TIRF görüntüleme için gereklidir. </li><li> 90.000 hücreleri içeren her cam alt çanak 2 ml büyüme ortamı ekleyin. </li><li> 16-24 saat süreyle% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin çanak. </li></ol></li><li> N2A transfeksiyon <ol><li> dahil bir Eylül fluorofor içeren bir plazmid yapı eldeilgili proteinin hücre-dışı bölümü içine. Bu PCR amplifikasyonu 5 gibi standart klonlama teknikleri yapı oluşturmak için de kullanılabilir. NOT: endoplazmik retikulum veya trafik veziküllerin lümeni içinde bulunduğu ve plazma membranı üzerinde hücre dışı çözeltisine maruz kaldığı Eylül membran proteini hücre dışı bölgesinin dahil edilmesi gerekir. GFP ve benzeri klonlama stratejileri kullanılabilir SEP boyutu benzer. </li><li> 1.5 mi düşük serum ortamında kaplama hücreleri üzerinde büyüme ortamı yerine (örneğin, Opti-MEM), yaklaşık 30 dakika transfeksiyon reaktifi ilave edilmeden önce. NOT: reseptörleri ilacın yol açtığı değişiklikleri incelemek için, ilacın, uygun bir konsantrasyonu, transfeksiyon zamanı eklenebilir. </li><li> 250 ul düşük serum ortamı oluşturmak her istenilen plazmid 500 ng ekleyin (tüp 1). </li><li> Ayrı bir tüp c transfeksiyon reaktifi 2 ul ekleindirgenmiş serum ortamı içeren gruptur 250 ul. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında boru 2 inkübe edin. DNA plazmid transfeksiyon reaktifi oranı her bir ilgi proteini ifade etmek üzere optimize edilmelidir. </li><li> transfeksiyon reaktifi ve plasmid karışımı, 500 ul içeren bir solüsyonun hazırlanması için tüpler 1 ve 2 bir araya getirin. 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> tabak başına 2 ml&#39;lik toplam hacmi 500 ul transfeksiyon karışımı önceden kaplama hücreleri ekleyin. </li><li> 24 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 24 saat sonra, transfeksiyon karışımı çıkarın ve büyüme ortamı ile hücrelerin yıkayın ve daha sonra her bir tabak için büyüme ortamının 2 ml ekleyin. NOT: Bir ilaç transfeksiyon zamanı ilave edildi, bu, bu aşamada daha doldurulan olabilir. </li><li> 24 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Görüntü hücreleri transfeksiyondan 48 saat sonra. </li></ol></li></ol> Toplam In tarafından 2. Canlı Hücre Görüntülememodu, harici Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) <ol><li> Görüntüleme kurmak <ol><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi bir tarama aşaması ile ters flüoresan mikroskop kurulumu ile görüntüleme gerçekleştirin. Bu 488 nm DPSS lazer kaynağının hizalanmasını gerektirir bir kademeli motor 488 nm ışın pozisyonu ve yüksek sayısal aralığı (1.49 NA) 60X ya 100X yağ daldırma objektif ayarlayın. </li><li> Uygun uyarma filtresi (bant geçiş 488/10 nm) aracılığıyla lazer ışını geçirin. Bir step motora monte edilmiş bir başlatıcısı bağlı bir tek modlu fiber üzerinden polarize lazer ışını aynı hizaya getirin. Epifloresans modunda, uyarma ışın hedefi arka diyafram ortasında merkezli. </li><li> kritik açı ulaşıldığında ve kiriş artık numune boyunca iletilir ve yerine tamamen cam cel yansıyan kadar TIRF elde etmek için, objektif lens arka diyafram boyunca odaklanmış bir lazer ışını çevirmek için step motor kullanmakl arayüzü. </li><li> Uygun emisyon filtresi ile görüntüleme yazılımı (örneğin Metamorph) ile kontrol edilen bir EMCCD (512 x 512 piksel) kullanarak Yakalama görüntüleri emisyon yolunda monte (525/50 nm). </li></ol></li><li> Görüntüleme çözüm hazırlayın <ol><li> GKD 150 mM NaCI, 4 mM KCI, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 10 mM glükoz karıştırılarak 200 mi hücre dışı çözelti (EİS) hazırlanması 2 O stok çözeltileri NaCI, KCI, MgCI2, ve CaCl2 önceden hazırlanmış ve görüntüleme gününde taze HEPES ve glikoz ile kombine edilebilir. </li><li> pH 7,4-100 mi ECS ihtiva eden bir çözeltinin pH&#39;ının ayarlanması. 5.4 arasında bir pH değerine ECS kalan 100 ml ayarlayın. ECS 2 ml (pH 7.4) ile transfekte hücrelerin durulayın. </li><li> görüntüleme önce transfekte hücrelere ECS 2 ml (pH 7.4) eklenir. </li></ol></li><li> TIRF Canlı hücre görüntüleme <ol><li> includin tüm sistemi açıng 488 nm lazer, kamera, çeviri sahne ve görüntüleme programı. Epifloresans ışını Odak ve 60X objektif yaklaşık 1 mW güç ayarlayın. </li><li> amaç yağ ekleyin ve çeviri sahnede transfekte hücrelerin bir tabak koyun. Hücreler birden çok kez görüntülenmiş olabilir bu yüzden sahneye göre hareket etmiyor sağlamak için sahne bağlar kullanarak yerine çanak sabitleyin. </li><li> Epifloresans modunda, mikroskop odak ve floresan, transfekte hücreler bulun. Hücreler çeşitli odak düzlemleri boyunca odaklanmaya devam edecektir. TIRF ile devam etmek tek izole hücreler bulun. </li><li> görüntüleme programı, 200 milisaniye maruz kalma zamanını ayarlamak ve EM kazanç ayarlayarak floresan yoğunluğu optimize. </li><li> step motor kullanılarak kademeli bir şekilde objektif karşısında ışını çevirerek TIRF içine lazer ışınını Geçiş. o th yakınsar kadar kritik açı yaklaşırken, kiriş gözle görülür yemeğin kenarı boyunca tercüme edecektirÖrnek uçakta toplam iç yansıma e noktası. </li><li> Hücreler odak düğmesini ayarlayarak TIRF modunda olduğundan emin olun. TIRF, hücrelerin sadece bir düzlemde, plazma membranının yüksek çözünürlüğe sahip bir çok tanımlanmış bir görüntü üreten (cam arayüzünden, yani yaklaşık olarak 150 nm) odaklanabilir. </li></ol></li><li> Hücre içi lokalizasyonu belirlemek için görüntüleme Eylül <ol><li> Görüntüleme düzlemde sağlıklı, transfekte tek hücreleri bulun. </li><li> pH 7.4 hücrenin odaklanmış bir görüntü kazanır. Eylül görünür olmalıdır plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde reseptörleri etiketli. </li><li> Hızlı photobleaching önlemek için örnek ulaşmasını lazer ışınını bloke eder. </li><li> Birden fazla xy yeri kayıt yeteneğine mikroskop görüntüleme yazılımı kullanarak her hücreye karşılık gelen sahne pozisyonları ezberleyin. </li><li> yazılımı kullanırken çanak başına 20-30 hücreleri için adımları tekrarlayın 2.4.1-2.4.4 her hücrenin konumunu kaydetmek için. </li><li> AfpH 7.4&#39;te tüm hücre görüntüleri toplanan ter, elle pipet kullanarak pH 7.4 ECS çözüm kaldırmak. Bu ezberlemiş sahne pozisyonları hareket olabilir gibi çanak dokunmayın. </li><li> Dikkatle çanak pH 5.4 ECS 2 ml ekleyin ve 10 dakika bekleyin. Bu süre zarfında, önceden edinilmiş görüntüleri kaydetmek. </li><li> PH 7.4 görüntüleri toplamak kaydedilen her pozisyona sahne taşımak ve pH 5.4 de aynı hücrede bir görüntü elde etmek için kullanılan koşullar aynı set altında. algılanan tüm floresan reseptörleri etiketli Eylül sınırlı endoplazmik retikulum kaynaklı beri Hücreler daha az tanımlanmış bakmak gerekir. pH 5.4 hücre görüntüleri kaydedin. </li></ol></li><li> Canlı hücrelerde Görüntüleme tek vezikül ekleme olaylar <ol><li> 2 mi, pH 7.4 ECS ile transfekte edilmiş hücrelerin büyüme ortamı yerine veya Leibovitz L-15 ortamı ile. Leibovitz L-15 ortam maddesinin pH değeri, gerekirse görüntüleme uzun bir süre boyunca meydana sağlayan CO2 bağımsızdır. </li><li> Placmikroskop sahnede transfekte hücrelerin çanak e. Güvenli ve yukarıdaki Adım 2.3 aşağıdaki TIRF tek bir hücreyi odaklanır. </li><li> Varsa odak görüntüleme süresi boyunca kayması değil böylece, otofokus ayarlayın. </li><li> Sürekli 200 msn bir kare hızında fotoğraf çekimi, 1.000 kare bir dizi kaydedin. floresan patlamaları dışı pH 7.4 SEP açığa plazma zarı ile kaynaştırarak düşük pH kaçakçılığı veziküller karşılık, bu süre içinde görünür olacaktır. </li><li> başka bir tek hücreyi bulup yukarıdaki adımı tekrarlayın. Gerekirse otofokus sıfırlayın. </li></ol></li></ol> 3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme <ol><li> Eylül floresan analiz hücre içi lokalizasyonu belirlemek için <ol><li> Bu Metamorph ya ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) gibi bir görüntü analizi yazılımı kullanılarak hücre görüntüleri açın. yuvarlanan top ayarını kullanarak hem pH 5.4 ve pH 7.4 görüntüleri arka plan çıkarın.</li><li> tek bir hücreden floresan ölçmek için bir yoğunluk threshold kullanın. El ile pH 7.4 görüntüdeki hücrenin çevresinde ilgi bir bölge seçin. </li><li> , Hücre alanını ölçün yoğunluğu ortalama ve entegre yoğunluk ImageJ bir eklenti kullanarak veya Analiz sekmesi altında &quot;Tedbir&quot; fonksiyonu yerleşik kullanarak. </li><li> dikkatle aynı şekilde ilgi yoğunluğu tabanlı eşiği ve bölgeyi ayarlama, pH 5.4 aynı hücre için adımlar 3.1.1-3.1.3 tekrarlayın. </li><li> Entegre yoğunluğu hem pH 7.4 ve 5.4 hücre görüntüler için elde edildikten sonra, pH 7.4 değeri, pH 5.4 değeri çıkarılarak plazma zarı entegre yoğunluğunu hesaplar. Fark TIRF uyarma bölgede plazma zarı üzerinde göreli sayı reseptörlerine karşılık gelir. </li><li> İnsan ticareti bir tedbir olarak, SEP göreceli yüzdesi TIRF excitati görünür kalan reseptörlerine kıyasla plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler etiketli hesaplamak100 ile çarpılarak pH 7.4&#39;de toplam entegre yoğunluğu ile yoğunluğu entegre plazma zarı, bölerek birimde. </li></ol></li><li> Tek vezikül ekleme olayları analiz <ol><li> görüntü analiz yazılımı kullanılarak 1.000 tiff görüntü serisi açın. yuvarlanan top ayarını kullanarak tüm kareleri arka planı çıkarma. </li><li> Ekleme olayları mesaneye gelen yoğun bölgeleri maksimize etmek kaydın renk dengesini ayarlar. El ile daha uzun 3 kare (&gt; 600 msn) süren floresan patlamaları saymak. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery.">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li><li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs.">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li><li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease--a+stereological+approach.">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li><li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+&#946;-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease.">Cortical &#945;7 nicotinic acetylcholine receptor and &#946;-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li><li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+&#945;4*+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin.">Trafficking of &#945;4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li><li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors.">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li><li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotine+metabolite,+cotinine,+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors.">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors.">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs,+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry,+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency,+and+Prevents+Nicotine+Reward.">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li><li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease.">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li><li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+and+mecamylamine+treatment+increase+brain+nicotinic+receptor+binding+without+changing+alpha+4+or+beta+2+mRNA+levels.">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li><li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms.">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li><li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor.">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li><li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#946;2+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity:+pharmacology,+stoichiometry,+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine.">&#945;4&#946;2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).</li><li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique.">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pH+of+the+secretory+pathway:+measurement,+determinants,+and+regulation.">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to declare.

SEP pH duyarlılığı, plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler endoplazmik retikulum hücre içi reseptörler ayırt edilmesini sağlar ve sokma olayları çözmek için kullanılabilen reseptör taşıyan veziküller 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Yüzey biyotinilasyon ve ligand dahil olmak...

Reseptör ifadesi, dağıtım, ve montaj değişiklikler Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kistik fibroz, ve madde bağımlılığı, 1, 2, 3, 4, 5 dahil olmak üzere hastalıkların geniş bir yelpazede bağlı olmuştur. Örneğin, nikotin ve nikotinik ligandlar kaçakçılığı, ifadesi ve yukarı doğru düzenleme, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 değişikliklere yol nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR&#39;ler) kaçakçılığı etkilemektedir. Nikotin, bir hücre içinde bir araya nAChR&#39;lerin sayısı artar, plazma zarının kaçakçılığı artırand bazı alt tiplerinin yüksek hassasiyet sürümünü lehine alt birimlerinin montajını değiştirir. bir hastalık modelinde kaçakçılığı, montaj ve reseptörlerin ifadesinde belirgin değişiklikler çözümleniyor ilaç hedefleri tanımlamak için gerekli olan çok önemli mekanistik ayrıntıları sağlar. Ideal bir yaklaşım hızla hücre içi reseptörler ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında ayrım olur. Bu, belirli bir proteinin bir çoğunluğu bu nAChR&#39;lerle gibi, hücre bulunduğu durumlarda, özellikle zordur. nAChR&#39;lerin çoğunluğu endoplazmik retikulum lokalize olduğundan, geleneksel ölçümler salgı yolu boyunca lokalizasyonu ve kaçakçılık değişikliklerini saptamak için gerekli uzay-zamansal çözünürlüğe yoksundur. NAChR&#39;lerin Reseptör kaçakçılığı ve anlatım çalışmaları öncelikle 11 Radyogland bağ, biyotinilasyon deneyleri 12, batı lekeleme 13 veya immünopresipitasyon techniq kullanılarak yapılmıştır<html> ues 12. Bu hücreler, bir raportör molekülü veya tespitin bağlama spesifikliği bağlıdır ve aynı zamanda plazma zarı yerleşik ve hücre içi reseptörler ayırt kabiliyetinden yoksundur. Bu nedenle, iyon kanal montaj ve vezikül dinamikleri çalışmalar büyük ölçüde düşük verimlilik elektrofizyolojik teknikler 14 yararlanmıştır. Üstün mekansal ve zamansal çözünürlükte floresan mikroskobu gelişmeler ile mümkündür. , Yeşil flüoresan protein (GFP) ve türevleri gibi genetik olarak kodlanmış raportör moleküller, spesifik olmayan bağlama sorunları ortadan kaldırmak ve hassasiyeti 15 artar. Superecliptic pHluorin (SEP) olarak bilinen GFP bir pH duyarlı varyantı, yeri 5, 7, 8 belirlemek için, hücre içinde bölmeler arasında doğal pH farklılıkları yararlanmak için kullanılabilecekref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. Eylül pH 6 daha yüksek olduğunda fluoresces, ancak daha düşük pH değerlerinde bir kapalı durumda kalır. Bu nedenle, lümen tarafında SEP ile etiketlenmiş reseptörleri endoplazmik retikulumda mevcut olduğunda tespit edilir ( bir trafik kesecik sınırlı ER) veya plazma zarı (PM) içine sokulması üzerine, ancak., plazma zarı üzerinde reseptörleri ile temas ekstrasellüler pH manipülasyonu sonuç olarak floresans ve bu reseptörlerin nedenle algılama değiştirir. aynı hücre halinde ardışık olarak nötr ekstrasellüler pH ile 6 daha düşük daha sonra bir pH hem de görüntülenmiş olan, görüntü arasındaki fark, plazma membranı üzerinde bulunan reseptörlere bağlanabilir. Bu, aynı anda hücre içi ölçümünü (periferik ER) ve plazma membran yerleşik reseptörleri 5 karşılaştırın 7, 8 </sup&gt; 9. hücre dışı pH nötr olduğunda tek vezikül ekleme olaylar da çözülebilir. Düşük pH trafik vezikül plazma membranı ile kaynaştıran sonra, vesikül luminal tarafında floresan 7, 18, 19, 20 bir patlama olarak algılanabilir bir geçiş neden nötr hücre dışı çözeltiye maruz bırakılır. Eylül plazma membranı ve periferik endoplazmik retikulum lokalize reseptörlerin ölçüm sağlar ve bu hücre içi bölgelerde 5, 7, 18 arasında reseptörlerinin kaçakçılığı ölçmek için bir araç sağlar. plazma membranında yüksek çözünürlük elde etmek için, genetik olarak kodlanmış SEP ile reseptör toplam iç yansıma florasan mikroskobu (TIRFM) tarafından görüntülü. Bu yöntem, özellikle biryararlı reseptörlerin çoğunluğu TIRFM plazma zarı görünürlüğünü arttırır, çünkü hücre içi bölgelere lokalize ise. TIRFM da PM içine sokulması üzerine Eylül-etiketli reseptörleri taşıyan tek veziküllerin kaçakçılığı dinamiklerinin çözünürlüğü sağlar. Toplam iç yansıma bir hücre ve bir cam kapak-slip 21, 22 arasında olduğu gibi, farklı kırılma indislerine sahip malzeme ara yüzeyinde meydana gelir. Cam ve hücre çözümü arayüzünde toplam iç yansıma elde aydınlatmaktadır 488 nm uyarma, ışınlanmış zaman Eylül fluoresces. Bu örnek, bu hacmin içinde sadece heyecanlı fluorophores içine yaklaşık 150 nm nüfuz bir evanescent dalga üretir. ikaz bu aralık içinde nötr pH ortamında reseptörleri içeren sadece Eylül plazma membranı veya periferik endoplazmik retikulum üzerinde bulunan kişilerce karşılık gelen tespit edilir. algılama sınırlı t olduğundanhücre içi bölge kaybolan dalga eşiğe göre O uyarım azalır ve sinyal gürültü oranı, 22 21 arttırılır. Buna ek olarak, hücre toplu nüfuz etmez ışıma, fotohasar zaman içinde canlı hücre görüntüleme sağlayan en aza indirilir. Bunun bir sonucu olarak, TIRFM Eylül salgı yolu boyunca membran reseptörlerinin hücre içi lokalizasyonu ve trafik dinamikleri ölçmek için gerekli olan yüksek çözünürlük ve hassasiyet sağlayan genetik olarak kodlanmış ile birlikte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="861">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:413px;">35 mm glass bottom petri dishes, sterile</td>
			<td style="width:163px;">Cell E&#38;G</td>
			<td style="width:119px;">GBD00002-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">vwr</td>
			<td align="right">215017510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco Modified Eagle Medium&#8206; (DMEM), High Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:413px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21083027</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11668030</td>
			<td>Gently mix; Do not vortex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>P217-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective immersion oil&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Camera</td>
			<td style="width:163px;">Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">60x, 1.49 NA oil immersion objective</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td>APON 60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:163px;">Prior</td>
			<td>IXPROXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized actuator (stepper motor)</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td>ZST213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">MetaMorph (or other imaging program)</td>
			<td style="width:163px;">Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:163px;">Market Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">SM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Mirrors</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">BB1-E01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dichroic 488 nm LP</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>Di02-R488-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 488 nm</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>LL01-488-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 525/50</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking

Anlamak membran proteini kaçakçılığı, montaj ve ifade hücre içi organellerin kalanların ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında farklılık bir yaklaşım gerektirir. Geleneksel floresan bazlı ölçümler farklı organellere ikamet eden zar proteinleri ayırt yeteneği yoksundur. Kesici kenar metodolojileri toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) ile pH-duyarlı fluorophores bağlanmasıyla geleneksel yöntemlerle aşmak. TIRF aydınlatma, böylece arka plan azalan sinyal gürültü oranını artırmak ve çözünürlük arttırıcı, cam numunesi arayüzünden 150 nm&#39;ye kadar örnek uyarılmaktadır. TIRFM içinde uyarma hacmi gibi periferik ER olarak plazma zarı ve yakındaki organelleri kapsar. Superecliptic pHluorin (SEP) GFP pH&#39;ya duyarlı bir versiyonudur. Genetik olarak ilgi konusu bir membran proteini hücre dışı etki alanına SEP kodlayan fluorofor ile ilgili pozisyonlarıER ve hücre dışı bölgesinde lümen taraf. Eylül pH, 6 daha büyük olduğu zaman, floresan, ancak daha düşük pH değerlerinde kapalı durumda kalır. Bu nedenle, (PM) plazma membranında endoplazmik retikulum (ER) &#39;de ya da sokulması üzerine bulunan ancak bir trafik vezikül veya Golgi gibi diğer organellere sınırlı değilken Eylül floresan ile etiketlenmiş reseptörleri. ekstrasellüler pH, plazma zarı üzerinde reseptörlerin floresan dikte ayarlanabilir. Aynı hücre için nötr ve asidik hücre dışı pH TIRF görüntüleri arasında floresan farkı, plazma zarı üzerinde reseptör göreli sayısına karşılık gelir. Bu hücre içi ve plazma zarı ikamet reseptörlerinin bir ölçümünü sağlar. ekstrasellüler pH plazma membranı ile füzyonu bir floresan haline geçiş, düşük pH trafik vezikül tekabül eden nötr olduğunda tek vezikül yerleştirme etkinlikleri de ölçülebilir. bu versatilE tekniği membran proteinlerinin lokalizasyonu, ifade ve ticaretini incelemek için kullanılabilir.

Bir reseptör olarak Eylül dahil canlı bir hücreye reseptörün doğrudan tespit edilmesine olanak sağlar. TIRFM ile birleştiğinde, bu plazma zarı ve TIRF uyarma bölgede hücre içi yerlerinizdeki reseptörlerin dağılımı üzerindeki bağıl ifade seviyelerinin değerlendirilmesini sağlar. Tek vezikül kaçakçılığı olayları da çözülebilir. Plazma Zarında Eylül-etiketli Reseptör göreli İfade Düzeyleri </...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking at JoVE.com

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

pH&#39;ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

utilizing-phluorin-tagged-receptors-to-monitor-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Görüntüleme.  University of Kentucky.  pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar. 

Video: Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Biyoloji

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Gastrointestinal Motilite Monitör (Gimm)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated 1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins. 
Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated 4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell. 
Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot 8-10. 
We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

We describe a method to localize fluorescently tagged proteins in electron micrographs. Fluorescence is first localized using photo-activated localization microscopy on ultrathin sections. These images are then aligned to electron micrographs of the same section.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Scap analizi<em&gt; K</em&gt; İnsan Hücreleri -glycosylation ve Ticareti

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro antifungal activity against a broad-spectrum of fungal pathogens and therefore have the potential to be used as antifungal agents in transgenic crops. In order to harness the full potential of plant defensins for diseases control, it is crucial to elucidate their mechanisms of action (MOA). With the advent of advanced microscopy techniques, live-cell imaging has become a powerful tool for understanding the dynamics of the antifungal MOA of plant defensins. Here, a confocal microscopy based live-cell imaging method is described using two fluorescently labeled plant defensins (MtDef4 and MtDef5) in combination with vital fluorescent dyes. This technique enables real-time visualization and analysis of the dynamic events of MtDef4 and MtDef5 internalization into fungal cells. Importantly, this assay generates a wealth of information including internalization kinetics, mode of entry and subcellular localization of these peptides. Along with other cell biological tools, these methods have provided critical insights into the dynamics and complexity of the MOA of these peptides. These tools can also be used to compare the MOA of these peptides against different fungi.

Plant defensins play an important role in plant defense against pathogens. For effective use of these antifungal peptides as antifungal agents, understanding their modes of action (MOA) is critical. Here, a live-cell imaging method is described to study critical aspects of the MOA of these peptides.

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Probing Structural and Dynamic Properties of Trafficking Subcellular Nanostructures by Spatiotemporal Fluctuation Spectroscopy

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles involved in the endo/exocytotic trafficking of solutes and biomolecules. iMSD relies on standard time-lapse imaging, is compatible with any optical setup, and does not need to dwell on single objects to extract trajectories. From each iMSD trace, a unique triplet of average structural and dynamic parameters (i.e., size, local diffusivity, anomalous coefficient) is calculated and combined to build the "iMSD signature" of the nanostructure under study. 
The potency of this approach is proved here with the exemplary case of macropinosomes. These vesicles evolve in time, changing their average size, number, and dynamic properties passing from early to late stages of intracellular trafficking. As a control, insulin secretory granules (ISGs) are used as a reference for subcellular structures that live in a stationary state in which the average structural and dynamic properties of the whole population of objects are invariant in time. The iMSD analysis highlights these peculiar features quantitatively and paves the way to similar applications at the sub-cellular level, both in the physiological and pathological states.

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analysis is applied to macropinosomes to highlight their intrinsic time-evolving nature in terms of structural and dynamic properties. Macropinosomes are then compared to insulin secretory granules (ISGs) as a reference for subcellular structures with time-invariant average structural/dynamic properties.

Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi

Imaging-derived mean square displacement (iMSD) is used to address the structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, such as vesicles ...