CM, C1 Hastalığı Önleyici Eksiklikler (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht ve Kan Transfüzyon Araştırması için Landsteiner Vakfı (LSBR) için Uluslararası Hasta Kuruluşu tarafından maddi desteği onayladı.

Utrecht Üniversite Tıp Merkezi&#39;nin Yerel Medikal Etik Komitesi, bu çalışmanın da dahil olduğu ex vivo araştırma amaçları için kan çizimini onayladı. 1. Çözüm Hazırlama <ol><li> 10 mM HEPES, 0.5 mM Na2HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KC1, 1 mM MgS04 ve 5.55 mM D-HPO4 çözeltisi ile bir 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) Tyrode tamponu hazırlayın. Damıtılmış su içindeki glikoz. <ol><li> Tamponun iki çeşidi yapın: pH seviyelerini sırasıyla 6.5 ve 7,4 olarak ayarlayın. Deneylerin her günü için taze tampon yapın. Belirtildiği yerlerde, 10 ng / mL prostasiklin ile tamamlayın. </li></ol></li><li> Damıtık suda 50 mM Tris ve 150 mM NaCl eriterek TRIS tamponlu salin (TBS) hazırlayın ve pH&#39;ı 9.0&#39;a ayarlayın. </li><li> 85 mM Tri-sodyum sitrat, 71 mM sitrik asit ve 111 mM D-glükozun çözündürülmesi ile asit sitrat dekstrozu (ACD) hazırlayınTatlı su. </li><li> HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4&#39;e% 2 (v / v) paraformaldehit (PFA) ilavesiyle bir fiksatif solüsyon hazırlayın. Çözünecek şekilde ısıtın (50-70 ° C) ve pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. -20 ° C&#39;de ayırın ve saklayın. Kullanımdan önce 37 ° C&#39;de çözünür. </li><li> % 1 (m / v) insan serum albümini (HSA), HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde çözülerek bloke edici tampon hazırlayın </li><li> 12 g gliserole 4.8 g polivinil alkol ilave ederek bir polivinil alkol çözeltisi yapın ve iyice karıştırın. 12 mL damıtılmış su ilave edin ve gece boyunca oda sıcaklığında bir rotatorda bırakın. <ol><li> 24 mL 0.2 M Tris-HCL, pH 8.5 ilave edin. 30 dakika karıştırılarak 50 ° C&#39;ye ısıtılır. 1.25 g 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan (DABCO) ilave edin ve iyice karıştırın. 5 dakika boyunca 1,500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı (1 mL, 15-20 slayt için yeterlidir) alınız ve -20 ° C&#39;de saklayınız. Alikotları bir kez kullanın. </li></ol></li></ol> 2. Kapak Cam Hazırlığı <ol><li> Yağ alma örtüsü(25 x 50 mm2) gece boyunca seyreltilmemiş kromosülfürik asit içerisinde kuluçkalandı. Kapak gözlüklerini damıtılmış suyla durulayın ve bir gece boyunca 60 ° C&#39;de fırında kurutun. </li><li> Bir damla su ile bir laboratuar tezgahının üzerine bir parafin filmi şerit (10 x 15 cm2) yapıştırın ve parafin filmi yumuşatarak havayı alın. Parafin film üzerine 80 μL, 10 μg / mL VWF veya 100 μg / mL fibrinojenden pipetleyin. Gözlükleri damlaların üzerine yerleştirin; Protein çözeltisi iki yüzey arasında camın tüm arka tarafını örterek yayılır. Oda sıcaklığında (RT) 1.5 saat inkübe edin. </li><li> Parafin filmi çıkartın ve kaplama bardaklarını, kaplama yüzü bloke edici tamponlu 4 gözlü bir plakaya gelecek şekilde yerleştirerek bloke edin. 37 ° C&#39;de 1 saat veya gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Kontrol olarak, VWF veya fibrinojen ile kaplanmamış bir kapak camını kapatın. </li></ol> 3. Trombositten zengin plazmanın (PRP) hazırlanması </p&gt; <ol><li> Sitrik tam kan (son konsantrasyon:% 0.32 sodyum sitrat (M / V)) damar tıkanması ile toplayın. </li><li> Kan 160 xg&#39;de ve frensiz 15 dakika boyunca santrifüje tabi tutun. Süpernatantı ( yani, PRP) bir plastik Pasteur pipeti ile toplayın. NOT: Santrifüjden sonra, üç kat (üstten alta doğru) gözlenebilir: PRP, beyaz kan hücreleri ve kırmızı kan hücreleri. Beyaz ve kırmızı hücreleri içermemeye dikkat edin. Tipik olarak 9 mL&#39;lik bir kan tüpünün santrifüj edildikten sonra 3 mL PRP toplanabilir. </li><li> Deney yıkanmış trombositler ile gerçekleştirilecekse bölüm 4&#39;e geçin. PRP isteniyorsa bir sonraki adıma geçin. </li><li> PRP toplandıktan sonra, kalan kanı (kırmızı hücre peletini içeren) santrifüj ederek frensiz 2.000 xg&#39;de 10 dakika tekrar santrifüjleyin. Trombosit zayıf plazması (PPP) içeren süpernatanı toplayın. NOT: Bu ikinci santrifüj adımından sonra tipik olarak 2 mL toplanabilir. </li><li> P sayısını sayLatelet&#39;leri bir hücre analizöründe analiz edin ve PPP (adım 3.4) ile 150.000 trombosit / μL konsantrasyonuna kadar sulandırın. NOT: Seyreltilmiş PRP&#39;nin toplam hacmi donörün trombosit sayısına bağlıdır. Trombosit sayıları vericiler arasında çok çeşitlidir ve PRP seyrelmesi bireysel bazda değerlendirme gerektirir. 150.000 ve 450.000 trombosit / μL&#39;de trombosit sayıları normal kabul edilir. </li><li> Bölüm 5&#39;e geçin. </li></ol> 4. Yıkanmış Trombositlerin Hazırlanması <ol><li> Bir hücre analizcisi kullanarak PRP&#39;deki ortalama trombosit hacmini (MPV) belirleyin. NOT: Bu, platelet ön-aktifleştirme 11&#39;in bir göstergesidir. Trombosit dinlenmesi için normal bir MPV 7.5-11.5 fL 11&#39;dir . MPV, trombosit yıkama prosedürü sırasında 1,5 fL&#39;den fazla artmamalıdır. </li><li> Trombosit ön-aktivasyonunu önlemek ve frensiz 400 xg ve RT&#39;de 15 dakika süreyle santrifüjlemeyi önlemek için PRP&#39;ye 1/10 hacim ACD ekleyin. Dosyayı kaldırPernatant hale getirin ve topağı HEPES Tyrode tamponunda (pH 6.5) özenle PRP&#39;nin orijinal hacmine yeniden askıya alın. </li><li> 10 ug / mL&#39;lik bir konsantrasyona TBS ilave ederek bir kısım prostasiklin çözülür; Buzda tutun </li><li> Trombosit aktivasyonunu önlemek için, yeniden askıya alınmış trombositlere 10 ng / mL&#39;lik bir nihai konsantrasyonda prostasiklin ekleyin ve hemen fren olmaksızın 400 xg&#39;de ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüje tabi tutun. Süpernatantı çıkarın ve peleti HEPES Tyrode&#39;un tamponu (pH 7.4) içinde dikkatle süspanse edin. </li><li> Trombosit sayısını sayın (adım 3.5) ve MPV&#39;deki değişikliği belirleyin (adım 4.1) (MPV, 1,5 fL&#39;den fazla değişmemelidir). </li><li> HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile trombosit sayısını 150.000 trombosit / μL konsantrasyona ayarlayın. Deneylerden önce oda sıcaklığında 30 dakika kadar iyileşmek için trombositleri bırakın. İzolasyondan 4 saat sonra yıkanmış trombositleri deneyler için kullanın. </li></ol> 5. Akış Odası Meclisi 12&#39;yi kullanmaktadır . Tercihen daha ileri analizler için çıkartılabilen bir kapak camı tuttuğu sürece, çeşitli ticari olarak üretilmiş akış bölmeleri kullanılabilir. Tanımlanan deneyler için kullanılan akış odası, mikroskop ekleme aşamasına tam olarak uyum sağlamak için poli (metil metakrilat) malzemesinden yapılmıştır. Giriş ve çıkış ( Şekil 1A - C ; 1, 2) ve vakum bağlantısı ( Şekil 1A ve C ; 3) içerir. Özelleştirilmiş bir silikon levha ( Şekil 1A ve D ; 4) üstüne yerleştirilir. Kapak camını ( Şekil 1A ; 6) odacığa sıkıca bağlamak için iki kesik boşluklar vakum kanalları oluşturur ( Şekil 1A ve D ; 5). Merkezi bir kesik akış kanalı oluşturur ( Şekil 1A </strong&gt; Ve D ; 7; 2.0 mm genişlik ve 0.125 mm yükseklik). Giriş ve çıkış akış kanalına bağlıdır ve vakum vakum kanalına bağlıdır. <ol><li> Akış odasının üst kısmını damıtılmış su ile örtün ve özelleştirilmiş silikon levhanın pürüzsüz yüzü aşağıda suya yerleştirin. Levhayı yerine koyarken fazla suyu çıkararak sayfayı yerlerine kaydırın. NOT: Bu silikon levha yeniden kullanılabilir (silikon, inert nitelikleri ile bilinir); Genellikle, trombositlerin ona tutunduğu gözlemlenmemiştir. Levhalar deterjanla temizlenebilir ve malzeme hasar görene kadar tekrar kullanılabilir (özellikle kanallar arasındaki alanda yırtılma). Genel olarak, bir sayfa, günde birden fazla deneyle 20 gün boyunca kullanılabilir. </li><li> Silah silikon levhasını akış odasına sıkıca yapıştırmak için artık odayı buharlaştırmak için akış odasını 60 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. </li><li> Bir plastik Pasteur pipetiyle bir damlaTyrode&#39;un tamponunu, pH 7.4&#39;ü akış kanalına geçirir. Kapak camını (bkz. Bölüm 2) kaplamalı yüzü aşağıda olacak şekilde akış kanalına yerleştirin. Vakum pompasını vakum bağlantısına takın ( Şekil 1A ve C ; 3). ~ 10 kPa basınç uygulayın. </li></ol> 6. Trombositlerin ön boyanması ve antikorların hazırlanması <ol><li> Trombosit boyama <ol><li> Karanlıkta 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca yıkanmış trombositleri 10 μg / mL DAPI ile inkübe edin. Bağlanmamış DAPI&#39;yı yıkamak ve trombosit aktivasyonunu önlemek için 10 ng / mL&#39;lik bir nihai konsantrasyonda prostasiklin ekleyin ve hemen 400 xg&#39;de ve frensiz RT&#39;de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Trombosit topağını HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde 150.000 trombosit / μL trombosit konsantrasyonuna getirin. </li></ol></li><li> Antikorların hazırlanması <ol><li> Biyotinle etiketlenmiş antikoru Alexa ile etiketlenmiş strep ile karıştırın1: 1 molar oranda tavidin. Kullanmadan önce oda sıcaklığında minimum 10 dakika inkübe edin (adım 7.6). NOT: Biyotin etiketleme etkinliği farklı yığınlar arasında değişebilir. Hedef moleküllerin görselleştirilmesinde sorunlar olması durumunda, başarılı biotinleme ve spesifik biyotinlenmiş antikorun hedefe bağlanma özelliklerini teyit etmek için kontrol deneyleri yapılmalıdır. </li></ol></li></ol> Perfüzyon <ol><li> Floresan mikroskopu yanı sıra mikroskop yazılımı başlatmak. Tablo 1&#39;de listelenen mikroskop ayarlarını kullanın. NOT: Mikroskop yazılımında uygun bir deney yükleyerek, trombositlerin ve seçilen floresan etiketli antikorların ve / veya boyaların canlı hücre görselleştirilmesi ve kaydedilmesi için mikroskop ve kayıt ayarlarını başlatın. RT de akış deneyleri yapın. </li><li> 10 mL&#39;lik bir şırıngayı boruya bağlayarak ve% 1&#39;lik HSA bloğu emerek giriş tüpünü bloke edinTüpünü giriş borusuna sokun. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Giriş tüpünü, HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4&#39;ü giriş borusuna aspire ederek durulayın. </li><li> Kapatılan giriş tüpünü ve işlenmemiş çıkış tüpünü, oda girişine ve çıkışına 1.02 mm çapında ve ~ 20-30 cm uzunluğunda bağlayın. Çıkış tüpüne 10 mL&#39;lik bir şırınga (veya daha düşük doğruluk için daha düşük hacim) bağlayın. Şırınga pompasını çalıştırın. NOT: Şırınganın çapı, pompa üzerinde ayarlanan akış hızı ile birlikte hacimsel akış hızını belirler. Akış kanalının yüzey alanı ile birlikte kesme oranı, formül 13&#39;e göre hesaplanabilir altında. Dolayısıyla şırınga pompasının akış oranını değiştirerek veya akış kanalının boyutlarını değiştirerek makaslama oranını değiştirmek mümkündür. Atım hızı 800-1,600 s -1 arteryel kan akışı için normalde modellenirken, venöz kan için 25 - 100 s-1 modelleriakar. Bu kurulum için, 7.5 μL / dak&#39;lık bir akış hızı, 25 s -1&#39;lik bir makaslanma oranına neden olur. Makaslama hızı = s-1&#39;de 6Q / saat 2 w Burada: Q = hacimsel akış oranı (mL / s), h = yükseklik kanalı (cm) (0.0125 cm, silikon levhanın kalınlığıdır), w = genişlik kanalı (cm) (bu bölmede 0.2 cm). </li><li> 100X&#39;lik bir objektif üzerine bir damla daldırma yağı yerleştirin (1.000X&#39;lik toplam amplifikasyon) ve cam yüzeyi aşağı bakacak şekilde mikroskop üzerine oda monte edin. </li><li> Giriş hortumunu, HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 içeren bir tüp içine yerleştirin. Çıkış tüpüne bağlı şırınganın pistini elle çekin ve havayı sistemden çıkarmak için odanın içinden çözeltiyi çekin. Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ( Şekil 1B ve C ; 8) ve pompayı kısaca çalıştırarak pistonu sıkıştırın ve dengeli akış sağlayın. </li><li> Trombosit süspansiyonuna veya PRP&#39;ye antikorlar ve / veya boyalar ekleyin, dikkatlicePlastik bir pipetle karıştırın ve karışımı 1.5 mL&#39;lik bir tüpe aktarın. NOT: Kesme hızında 25 s-1 (7.5 μL / dak) olan tipik bir 30 dakikalık perfüzyon için minimum 225 μL trombosit süspansiyonu gerekir. Temsili sonuçlar için kullanılan antikorlar Tablo 2&#39;de gösterilmektedir. </li><li> Giriş tüpünü sıkarken HEPES Tyrode tamponu pH 7.4&#39;den, ya PRP ya da yıkanmış trombositleri, antikorları ve / veya boyaları ( Şekil 1B ve C ; 9) içeren 1.5 mL&#39;lik bir tüpe getirin. NOT: Havanın hortuma girmesini engellemek için hortumun transferinde hortumun sıkıştırılması (havanın bastırılması) önemlidir. Yapışkan trombositleri, çeşitli yöntemlerle, bir sonraki aşamada, benzer bir şekilde başka bir tüpe aktarılarak işleme tabi tutmak mümkündür. Potansiyel olarak yararlı reaktiflerin bir listesi Tablo 3&#39;te verilmiştir . </li><li> &quot;Canlı görselleştirme&quot; yi seçinN &quot;seçeneğine basın, mikroskopı kaplanmış kaplama camının yüzeyine odaklayın ve trombositler akış odasına ulaşıncaya kadar 1,600 s-1 (484 μL / dak) kesme hızında pompaya başlayın.Bu anda, Şırınga pompasının ayarlarını 7,5 μL / dak&#39;lık bir akış oranına değiştirerek makaslama oranını 25 s-1&#39;e düşürün. </li><li> Kapak camının kaplanmış tarafının yüzeyini izleyin, ilk trombositlerin yapışmasına başlamasını bekleyin, mikroskopu bu trombosit üzerinde odaklayın ve yazılımı yazılımda denemeyi başlatarak kayıt işlemine başlayın. Burada kullanılan kayıt ayarları için Tablo 1&#39;e bakın. </li><li> Canlı kaydı görsel olarak takip edin. 30 dakika sonra şırınga pompasını durdurun. NOT: Deney süresince trombositlerin odakta kalmasını sağlayın. Tipik olarak, 20-30 trombositler 1,000X&#39;lık bir büyütme oranında görüş alanına eklenir; Bu akış kanalının tamamında yaklaşık 2.000-3.000 trombosittir. </li><li> Kullanarak sabitlemeAkış odası (isteğe bağlı). <ol><li> Şırınga pompası durdurulduktan sonra akış durdurulduğunda, giriş tüpünü (hava ücretsiz) sabitleme solüsyonuna aktarın. Pompayı tekrar başlatın ve sabitleme tamponunu 7.8. Adımda belirtildiği gibi aynı akış hızında en az 10 dakika kanal boyunca akıtırın. </li></ol></li><li> Mikroskop odasını çıkarın, daldırma yağı camdan temizleyin, vakum bağlantısını kesin ve 18 G&#39;lik bir iğne ile kapak camını bölmeden dikkatli bir şekilde çıkarın. NOT: Kapak camının silikon tabakasını kırıp hasar görmesini önleyin. </li><li> Kapak sürgüsünü (hücreleri yukarı doğru yönlendirdikçe) damıtık suyla önceden ıslatılmış bir doku üzerine 4 oyuklu bir plakaya yerleştirin. NOT: Bu, kapak camının kuyu yüzeyine yapışmasını önler ve kurumayı engeller. </li><li> Kapak camının üzerine fiksatif çözelti 750 μL Pipetleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Numunelerin doğrudan analiz edilememesi durumunda,Sabit fiksasyon sağlamak için 4 ° C&#39;de% 0.5 PFA (HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile seyreltilmiş) içinde saklayın. Görüntüleme için kapak camını işlemek için 8. bölüme geçin. </li><li> Kullandıktan sonra, bölmeyi, boruyu ve tabakayı damıtılmış suyla durulayın ve bir gece boyunca bir deterjan çözeltisi içerisinde inkübe edin. Hazne ve diğer bileşenlerin tekrar kullanılmadan önce damıtılmış su ile yıkayın. </li><li> Tüm meta verileri içeren mikroskop ham veri dosyalarını kaydedin. Gerektiğinde, filmleri .MOV, h.264 sıkıştırılmış veya .AVI sıkıştırılmamış olarak dışa aktarın. Ayrı kareleri JPEG veya TIF dosyaları olarak kaydedin. </li></ol> 8. Konfokal Floresan Mikroskopi için Örnek Hazırlama <ol><li> Kapak gözlüklerini yeni 4 yuvalı plakalara aktarın ve 5 mL 3 mL HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile durulayın. 3 mL / oyuk bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Bloke edici tamponu kaldırın; HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde 3 mL / oyuk% 0.15 glisin (M / V) ilave edin; Ve 15 dakika boyunca R&#39;de inkübe edinT. </li><li> Glisin çözeltisini çıkarın ve bloke edici tamponun 3 mL / çukurunda 5 kez yıkayın. İsteğe bağlı olarak, ek boyama için bloke edici tamponda seyreltilmiş fluorofor-konjuge antikorlar ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Blok tamponu ile 5 kez ve damıtılmış su ile 2 kez yıkayın. Fazla sıvıyı bir doku ile (kenarlardan içe doğru) hücreye dokunmadan kaldırarak camı kurutun. </li><li> Mikroskop slayt üzerine 60 μL polivinil alkol solüsyonu pipetleyin. Kapak camını, hücrelerin aşağı gelecek şekilde damla üstüne koyun ve polivinil alkolün iki yüzey arasında dağılmasına izin verin. Gece boyunca karanlıkta RT kuluçkalayın. </li><li> Konfokal mikroskopi ile hücreleri analiz 14 . </li><li> Tüm meta verileri içeren kaydedilmiş yığın verisinin ham veri dosyalarını kaydedin. Gerektiğinde, ham veri dosyalarını MOV, h.264 sıkıştırılmış veya .AVI sıkıştırılmamış dosyalar olarak işleyin. Ayrı yığınları JPEG veya TIF dosyaları olarak kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+granule+exocytosis:+a+comparison+with+chromaffin+cells.">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).</li><li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines.">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li><li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein.">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li><li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules:+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis.">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li><li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+&#945;-granules.">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet &#945;-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li><li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells,+their+extracellular+matrix,+and+purified+components.">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li><li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro.">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation.">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li><li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity.">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li><li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation:+methodological+issues.">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li><li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood.">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li><li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH.">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy:+present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li><li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules,+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome,+and+appears+identical+to+granulophysin.">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li><li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes.">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li><li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control:+Alternatives+for+ADAMTS13.">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li><li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy.">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li><li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact.">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Dünya çapında tromboz önde gelen ölüm ve morbidite nedenidir ve trombositler gelişiminde merkezi bir rol oynamaktadır. Bu çalışma akış altında trombosit degranülasyonunun canlı hücre görüntülemesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Genellikle, trombositler harekete geçirildiğinde, tüm granül içeriği çözeltiye doğrudan salınır. Eşlik eden sonuçlar bunun mutlaka geçerli olmadığını göstermektedir. Yapışma ve degranülasyon sırasında, trombositler önemli miktarda polifosfat tut...

Trombositler kan akışında dolaşan anükleat hücrelerdir. Ana işlevi yaralanma yerlerinde vasküler yaraları kapatmak ve kan kaybını önlemektir. Bu yaralanma yerlerinde, subendotelyal kollajen lifleri maruz kalır ve daha sonra multimerik protein olan von Willebrand faktörü (VWF) ile kaplanır. VWF, trombosit hızını yavaşlatan hücre yüzeyi 1 üzerindeki glikoprotein Ibα-IX-V kompleksine bağlı olan bir mekanizma içinde dolaşımdaki trombositler ile etkileşime girer. Bu, yüksek makaslama hızlarında özellikle önemlidir. Trombositler daha sonra kollajenden aktive edici uyaranlar alırken morfolojik değişiklikler yaparlar. Bu, geri döndürülemez yayılma ve nihayetinde platelet toplanmasına yol açar. Her iki işlem de trombosit-platelet çapraz-tokuşunu kolaylaştırmak için granül içeriğinin salgılanmasına bağlıdır. Diğerleri arasında platelet a-granülleri trombosit yapışmasına ve köprüye yardımcı olmak için fibrinojen ve VWF içerirTrombositler integrin bağımlı bir şekilde bir araya getirilir. Trombosit yoğun granülleri, trombosit aktivasyonunu güçlendirmeye yardımcı olan inorganik bileşikler 2 , kalsiyum ve adenosin difosfat (ADP) içerir. Ayrıca, trombositler, (alerjik) inflamasyon 3 , komplement kontrol proteinleri 4 ve anjiyogenez faktörleri 5,6 olan aracı maddeleri içerirler ve bu içeriklerin farklı koşullar altında farklı şekilde serbest bırakılıp bırakılmadığı ve nasıl verildiğine ilişkin sorular ortaya çıkarır. 1980&#39;lerden bu yana, akım modellerinde platelet fonksiyonu çalışması, tromboz mekanizmalarının araştırılması için değerlidir7. O zamandan beri, çok teknik ilerleme kaydedildi ve fibrin oluşumunu içeren akış modelleri şu anda, terapötik trombosit konsantratlarının ex vivo 8 hemostatik potansiyelini test etmek için geliştirildi veyaKesilme hızlarındaki bozulmaların tromboz morfolojisi üzerindeki etkisini araştırır 9 . Stabil yapışma ve fizyolojik tromboz oluşumuna (hemostaz) neden olan patolojik tromboz oluşumuna (tromboz) neden olan moleküler ve hücre-biyolojik mekanizmalardaki farklılıklar çok ince olabilir ve bu subselülerlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesine izin veren akış modelleri gelişimini motive edebilir süreçler. Böyle bir kurulumun değerli olacağı bir işlem örneği, hücre içi polifosfatın yeniden (yeniden) dağılımı ve bunun fibrin ultrastrüktürü 10 üzerindeki zaman etkisine bağlı etkiyi ortaya çıkarmak için pıhtılaşma faktörlerinin alınmasıdır. Çalışmalar genellikle son nokta analizleriyle sınırlıdır. Açıklanan yöntemin asıl amacı, trombosit aktivasyonu sırasında akım altında gerçekleşen dinamik subselüler süreçlerin gerçek zamanlı görsel incelemesini sağlamaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">441476L</td>
			<td style="width:372px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.05886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.04074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostacyclin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:227px;">18220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tri-sodium citrate</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.06448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.00244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:295px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td style="width:227px;">BBAD02400500#A</td>
			<td>24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:447px;">Chromosulfuric acid (2% CrO3)</td>
			<td style="width:295px;">Riedel de Haen</td>
			<td>07404</td>
			<td>CAS [65272-70-0].</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Von Willebrand factor (VWF)</td>
			<td style="width:295px;">in-house purified</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:295px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:227px;">FIB3L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 well dish, non-treated</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:295px;">Haem Technologies Inc.</td>
			<td style="width:227px;">823022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%</td>
			<td style="width:295px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:227px;">455322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell analyser&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Abbott Diagnostics</td>
			<td style="width:227px;">CELL-DYN hematology analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>30525-89-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:295px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td style="width:227px;">Harvard apparatus 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mL syringe with 14.5 mm diameter</td>
			<td style="width:295px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:227px;">305959</td>
			<td>Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Anti-CD63-biotin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:227px;">AB134331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Anti-CD62P-biotin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:227px;">Dy137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:295px;">Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td style="width:227px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S11223&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444963-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Detergent solution</td>
			<td>Unilever, Biotex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56-40-6&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td>Mowiol 40-88.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>1185-53-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>280-57-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep Anti-hVWF pAb</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td style="width:227px;">AB9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Alexa fluor 488-NHS</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:227px;">15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Parafinn film</td>
			<td style="width:295px;">Bemis</td>
			<td style="width:227px;">PM-996</td>
			<td>4 in. x 125 ft. Roll.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Silicone sheet non-reinforced</td>
			<td style="width:295px;">Nagor</td>
			<td style="width:227px;">NA 500-1</td>
			<td>200mmx150mmx0.125mm.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:447px;">Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels</td>
			<td style="width:295px;">in-house made</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td>Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:295px;">Eppendorf AG</td>
			<td style="width:227px;">T9661-1000AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:295px;">Zeiss Observer Z1&#160;</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td>Equiped with LED excitation lights.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Microscope software</td>
			<td style="width:295px;">Zeiss ZEN 2</td>
			<td style="width:227px;">blue edition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">18 G needle (18 G x 1 1/2&#34;)</td>
			<td style="width:295px;">BD biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">NaCl</td>
			<td style="width:295px;">Riedel de Haen</td>
			<td style="width:227px;">31248375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Tris</td>
			<td style="width:295px;">Roche</td>
			<td style="width:227px;">10708976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Plastic pasteur pipet</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">612-1681</td>
			<td>&#160;7 ml non sterile, graduated up to 3ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Silicone tubing</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">228-0656</td>
			<td>Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">ABAA000001##12E</td>
			<td>76 x 26 x 1 mm, ground edges 45&#176;, frosted end.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of platelet degranulation and secretion under flow

Kan trombositleri, hemostazda vasküler ihlalleri gidermek için trombüs oluşumu için önemli oyunculardır. Ayrıca tromboz, vaskülatürü tıkayan tromboz oluşumu ve organları yaralamaya, hayati tehlike oluşturan sonuçlarla ilgilenmektedirler. Bu, trombosit fonksiyonu ve akış koşulları altında gerçekleşen hücre biyolojik süreçlerini izlemek için yöntemlerin geliştirilmesi üzerine bilimsel araştırmalara motive olur. Trombosit yapışması ve toplanması, trombosit biyolojisinde iki temel olgu çalışması için çeşitli akış modelleri mevcuttur. Bu çalışma aktivasyon sırasında akım altında gerçek zamanlı trombosit degranülasyonunu incelemek için bir yöntem açıklamaktadır. Yöntem, geniş alanlı, ters çevrilmiş, LED tabanlı floresan mikroskop altında yerleştirilen bir şırınga pompası kurulumuna bağlı bir akış odası kullanır. Burada açıklanan kurulum, flüoresan etiketli antikorlar veya fluoresc tarafından gönderilen birden fazla florofor eşzamanlı uyarılmasına olanak tanırBoyalar. Canlı hücre görüntüleme deneylerinden sonra kapak gözlükleri statik mikroskopi ( örn. Konfokal mikroskopi veya taramalı elektron mikroskobu) kullanılarak daha da işlenebilir ve analiz edilebilir.

Şekil 1 , akış odasının görüntülerini ve deney düzeneğini göstermektedir; Silikon levhanın konumu ve boyutları; Ve hortum bağlantıları. Şekil 2 , akış haznesinin boyutlarıyla ilgili ayrıntılar sunmaktadır. Şekil 3 ve Film 1 , platelet yapışmasının ve sabitlenmiş VWF üzerine yayılma görüntülerinin bir zaman serisini göstermektedir. CD63, dinlenme pl...

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow at JoVE.com

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

live-cell-imaging-of-platelet-degranulation-and-secretion-under-flow

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Görüntüleme.  University Medical Center Utrecht.  Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar. 

Video: Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Biyoloji

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Enteroendokrin Hücre Gut Hormon salgısını Çalışması ve Canlı Hücre Görüntüleme için Amaçlanan Kemirgen Küçük Bağırsak Karışık İlköğretim Kültürler

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...