Biz çeşitli insan hücre tipleri içine LDL kolesterol alımı canlı görüntü analizi için bir yöntem saklı. Bu bileşikler için ekran sağlar, LDL kolesterol taşıma değiştirmek. LDL akını niceleme için canlı hücre görüntüleme kullanmanın en büyük avantajı, bu nedenle potansiyel toksik bileşikler tespit edilebilir, böylece tetkik süresi boyunca hücre morfolojisi izleme sağlar.
Başlamak için, daha önce hazırlanmış hücreler kapalı medya aspire, ve Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu 5 mililitre ile hücreleri yıkayın. DPDS aspire. 100 milimetrelik çanak hücreleri ayırmak için yanında, HepG2 hücreleri için% 0,25 Tripsin-EDTA 1.5 mililitre ekleyin ve HK2 hücreleri için 0.05% Trypsin-EDTA çözeltisi 1.5 mililitre ekleyin, veya HCAECs.
Plakaları 37 derecede dört dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra HepG2 ve HCAEC hücreleri için komple medya 3 mililitre ekleyerek Tripsin nötralize. 3 mililitre Tripsin nötralize solüsyonu kullanın, HK2 hücreleri için %5 fetal sığır serumu veya FBS ile DPDS'yi tehlikeye at.
Hücreleri 15 mililitrelik konik tüplere aktarın, sonra tüpleri 250g'de beş dakika santrifüj edin. Döndükten sonra, medya aspire ve tam ortamda hücre pelet yeniden askıya. Hücre kümelerini kırmak için hücreleri 40 mikron örgü süzgeçten yavaşça filtreleyin.
Hücreleri sayın ve 24 kuyulu bir plakaiçinde optimize edilmiş bir yoğunlukta plakalayın. Hücrelerin bağlanmasını sağlamak için tabağı bir gecede 37 derece yekponlayın. Ertesi gün, hücre hattı için FBS olmadan temel ortam hücre ortamı nı değiştirin, artı% 5 lipoprotein eksik serum, ya da% 2 FBS medya.
24 kuyuluk bir tabakta kuyu başına 500 mikrolitre toplam ortam kullanın. Sonra hücreleri açlıktan 24 saat boyunca kuluçka devam edin. Açlık adım veya ertesi gün ile birlikte, hücreler istenilen bileşikler ve uygun kontroller ile tedavi edilebilir.
Açlıktan 24 saat sonra, mililitre başına 10 mikrogram lık son konsantrasyonelde etmek için 500 mikrolitre ortam içeren her kuyuya 5 mikrolitre pHrodo kırmızısı LDL etiketli pHrodo kırmızısı ldl ekleyin. Dikkatle kuyulardan herhangi bir kabarcıklar kaldırın. Etiketli LDL'yi ekledikten hemen sonra, plakayı canlı hücre analiz sistemi kuluçka makinesine yerleştirin ve plakadaki yoğuşmayı azaltmak için plakanın 15 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.
Hücreler kuluçkaya yatarken, yazılımı açın ve plakayı tutan damarı ekleyerek tazyiki planlayın. Resim 16 görüntüleri başına iyi, kırmızı ve faz kanalları kullanarak dört saat boyunca 10x büyütme bir saat aralıklarla ekleyin. Ardından, veri işleme için kullanılacak bir plaka eşlemi oluşturun, özellikler sekmesini seçin ve plaka eşlemi seçin.
Hücre türünü hücre sekmesine ve bileşik musluktaki tedavilere giriş. Ardından bölgeler sekmesine tıklayın, her çoğaltma kümesini seçin ve bölgeleri atayın. Deneme çalışması tamamlandıktan sonra, bilgisayarı sayım kümesinde bulunan her parametreyi ölçmek için eğitmek için yazılımda bir görüntü kümesi oluşturun.
Yazılımda, plaka görünümünü açın, ardından analiz iş yardımcı programları kutusunda, oluşturma yı veya resim koleksiyonuna eklemeyi seçin. Yeni görüntü koleksiyonu seçin, görüntü koleksiyonu için bir ad yazın ve kanalların yanındaki kutuları işaretleyerek kırmızı ve faz kanallarını seçin. Farklı kuyulardan ve zaman noktalarından beş görüntü daha seçin ve geçerli görüntü koleksiyonuna ekleyerek bunları görüntü koleksiyonuna ekleyin.
Çözümleme iş yardımcı programları kutusunda, yeni işleme tanımını seçin, açılır menüden görüntü koleksiyonunu seçin, hücre türüne ait parametreleri girdi. Önizleme kutusunda, tüm önizlemeyi seçmek için açılır menüyü kullanın. Çözümleme maskesi kutusunda, işleme tanımı için analizde yer alan alanı görüntülemek için birleştirme maskesini ve kırmızı nesne maskesi kutularını işaretleyin.
Hücrelerin ve LDL'nin maskeye dahil olduğundan emin olmak için görüntü koleksiyonunda ilerleyin. Dosyayı seçin ve işleme tanımını kaydedin. Ardından, deneme çalışmasındaki görüntü kümesini analiz etmek için deneme plakası görünümünü açın.
Çözümleme iş yardımcı programları kutusunda, yeni çözümleme işini başlat'ı seçin ve kaydedilen işleme tanımını seçin. Analiz işini adlandırın, analiz için zaman aralığını seçin ve analiz etmek için deneysel kuyuları vurgulayın. Başlatma düğmesini seçin.
Analiz işi tamamlandıktan sonra, verileri dışa aktarın, tamamlanan çözümlemesi seçin ve görünüme basın. Yardımcı programlar menüsünde metrik grafik dışa aktarmayı seçin. Bölgeler menüsünde, grup olarak her kuyu kümesi için ortalama değeri elde etmek için tüm kuyuları ve grup menüsünde çoğaltmaları seçin.
Ve her kuyu için ayrı değerleri ihraç etmek için, hiçbiri seçin. Kırmızı nesne metrik menüsünde, toplam kırmızı nesne tümleşik yoğunluğunu seçin. Veri verme düğmesini seçin.
Verileri tek tek görüntülere ayırmayı denetleyin. Veriler bir panoda otomatik olarak kopyalanır ve yeni bir elektronik tablo dosyasına yapıştırılabilir. Aşama nesnesi metrik menüsünde, birleşimi seçin ve ardından veri dışa aktarma düğmesini tıklatın.
İstem sekmesinde, verileri tek tek görüntülere ayırmayı denetleyin. Veriler otomatik olarak bir panoya kopyalanır ve toplam kırmızı nesne tümleşik yoğunluk verilerini içeren elektronik tablo dosyasına yapıştırılabilir. Şimdi son ldl alım değerleri elde etmek için, protokol 4.1.7 ve 4.1.8 adımlarına göre, dışa aktarılan veriler normale döndürülebilir.
Dynasore veya rekombinant PCSK9 ile tedavi sonrasında, her üç test insan hücre hatları dört saatlik bir zaman ders içinde LDL akını önemli azalmalar gösterdi. LDL akını insan hepatik karsinom veya HepG2 hücrelerinde azalır, zaman içinde Dynasore tedavisi ile, bir kontrol olarak DMSO ile tedavi hücreleri ile karşılaştırıldığında. Farklı zaman noktalarında HepG2 hücrelerindeki LDL akınının canlı hücre görüntülemesi, SIMvastatin ile yapılan tedavi sonrasında LDL alımında bir pazar artışı olduğunu ve ldl akınındaki önemli değişiklikleri tespit etmek için bu yöntemin hassasiyetini desteklediğini göstermiştir.
İlk zaman noktası ve son bitiş noktasında incelenen gerçek zamanlı görüntüler, Dynasore tedavisinden sonra hücrelerin normal morfolojisini doğrular, bu bileşiğin etkinliğini ve güvenliğini gösterir. Floresan aktivitesini korumak için hücrelere daha fazla kırmızı etiketli LDL ekledikten sonra, canlı hücre görüntüleme sistemi kuluçka yerleştirilene kadar ışıktan plakakorumak için önemlidir. Farklı organlardan gelen hücreler tedavilere farklı yanıt verebilir, zıt yönlerde anlamı, ya da aynı yönde yanıt verebilir ama kolesterol alımında farklı değişim oranları gösterebilir.
Sadece canlı hücre görüntüleme ile bu tür farklılıklar tespit ve doğru ölçülebilir.
