Name: live-cell imaging of platelet degranulation and secretion under flow
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
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CM은 C1- 저해제 결핍증 (HAEi), Vladen van Het UMC Utrecht 및 수혈 연구를위한 Landsteiner 재단 (LSBR)에 대한 국제 환자기구의 재정 지원을 인정합니다.

University Medical Center Utrecht의 지역 의료 윤리위원회 (Medical Medical Committee)는이 연구를 포함한 생체 외 연구 목적으로 혈액을 채취하는 것을 승인했습니다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> 10mM HEPES, 0.5mM Na 2 HPO 4 , 145mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgSO 4 및 5.55mM D- 글루타민을 용해시켜 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) Tyrode &#39;s 완충액을 준비한다. 증류수 내 포도당. <ol><li> 완충액의 두 가지 변종을 만드십시오 : pH를 각각 6.5와 7.4로 설정하십시오. 실험 매일에 신선한 완충액을 만드십시오. 표시된 경우 10 ng / mL 프로 스타 사이클린으로 보충하십시오. </li></ol></li><li> 증류수에 50 MM 트리스와 150 MM NaCl을 용해하여 pH를 9.0으로 조정하여 TRIS - 버퍼 식염수 (TBS)를 준비합니다. </li><li> 85 mM Tri-sodium citrate, 71 mM citric acid 및 111 mM D-glucose를 용해시켜 산성 구연산 포도당 (acid citrate dextrose, ACD)을 준비한다.경수. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 pH 7.4에 2 % (v / v) 파라 포름 알데히드 (PFA)를 첨가하여 고정액을 준비하십시오. 용해시키기 위해 가열 (50 - 70 ° C)하고 pH를 7.4로 설정하십시오. 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 사용 전에 37 ° C에서 해동하십시오. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에 1 % (m / v) 인간 혈청 알부민 (HSA)을 용해하여 차단 완충액을 준비합니다 </li><li> 글리세롤 12g에 폴리 비닐 알콜 4.8g을 가하여 폴리 비닐 알콜 용액을 만들고 잘 섞는다. 12 mL의 증류수를 넣고 상온에서 로테이터에 밤새 방치한다. <ol><li> 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5) 24 mL를 넣는다. 30 분 동안 혼합하면서 50 ℃로 가열한다. 1,25- 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 1.25g을 가하고 잘 섞는다. 5 분 1,500 XG에서 원심 분리기. 나누어 진 상등액 (1 mL는 15-20 슬라이드에 충분 함) -20 ° C에 보관하십시오. 분량을 한 번 사용하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 커버 유리 준비 <ol><li> Degrease 표지희석 된 염색 황산에서 밤새 배양하여 유리 (25 x 50 mm 2 )에 옮겼다. 커버 유리를 증류수로 헹구고 오븐에서 60 ° C로 밤새 건조시킵니다. </li><li> 실험실 벤치 위에 파라핀 필름 스트립 (10 x 15cm 2 )을 물방울과 함께 붙이고 파라핀 필름을 부드럽게하여 공기를 제거합니다. paraffin 필름에 10 μg / mL VWF 또는 100 μg / mL fibrinogen의 피펫을 80 μL 떨어 뜨립니다. 방울 위에 안경을 놓으십시오. 단백질 용액은 두 표면 사이에 퍼져 유리의 전체 뒷면을 덮을 것입니다. 실온 (RT)에서 1.5 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 파라핀 필름을 제거하고 차단 된 버퍼가있는 4-well 플레이트에 코팅면이 위로 오도록하여 커버 유리를 올려 놓습니다. 37 ° C에서 1 시간 또는 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 대조군으로 VWF 또는 피브리노겐으로 코팅되지 않은 커버 글래스를 차단하십시오. </li></ol> 3. 혈소판 풍부 혈장 (PRP) </p&gt; <ol><li> 베 뉼다에 의해 구연산 전혈 (최종 농도 : 0.32 % 시트르산 나트륨 (M / V))을 수집합니다. </li><li> 브레이크없이 160 XG와 RT에서 15 분 동안 혈액을 원심 분리하십시오. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 상청액 ( 즉, PRP)을 수집합니다. 참고 : 원심 분리 후, 위에서 아래로 3 개의 층이 관찰 될 수 있습니다 : PRP, 백혈구 및 적혈구. 흰색과 빨간색 셀을 포함하지 않도록주의하십시오. 일반적으로 9 mL 혈액 튜브를 원심 분리 한 후 PRP 3 mL를 수집 할 수 있습니다. </li><li> 세척 된 혈소판으로 실험을 수행하려면 4 절을 계속하십시오. PRP가 필요한 경우 다음 단계를 계속하십시오. </li><li> PRP 수집 후, 브레이크없이 2,000 xg에서 10 분간 다시 혈액의 나머지 (적혈구 펠렛 포함)를 원심 분리하십시오. 혈소판이 부족한 혈장 (PPP)이 들어있는 상등액을 수집합니다. 참고 : 일반적으로이 두 번째 원심 분리 단계 후에 2 mL를 수집 할 수 있습니다. </li><li> p의 수를 센다.세포 분석기의 PRP에 래트 렛을 넣고 150,000 혈소판 / μL의 농도로 PPP (단계 3.4)로 희석한다. 참고 : 희석 된 PRP의 총량은 기증자의 혈소판 수에 따라 다릅니다. 혈소판 수는 기증자에 따라 크게 다르며 PRP 희석은 개별적으로 평가해야합니다. 혈소판 수치는 150,000 ~ 450,000 혈소판 / μL 범위 내에서 정상으로 간주됩니다. </li><li> 섹션 5로 계속 진행하십시오. </li></ol> 4. 세척 된 혈소판의 제조 <ol><li> 세포 분석기를 사용하여 PRP에서 평균 혈소판 부피 (MPV)를 결정합니다. 참고 : 이것은 혈소판 사전 활성화 11 의 표시입니다. 혈소판을 쉬기위한 정상 MPV는 7.5-11.5 fL입니다 11 . MPV는 혈소판 세척 과정에서 1.5 fL 이상 증가하면 안됩니다. </li><li> 혈소판 사전 활성화를 방지하기 위해 PRD에 1/10 부피의 ACD를 넣고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 원심 분리하십시오. su를 제거하십시오.HEPES Tyrode의 완충액 (pH 6.5)에서 조심스럽게 pellet을 PRP의 원래 부피로 다시 부순다. </li><li> TBS를 10 μg / mL의 농도로 첨가하여 프로스타 시클린의 분량을 녹입니다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 혈소판 활성화를 막기 위해 프로 그레시클린을 재조합 혈소판에 10 ng / mL의 최종 농도로 첨가하고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 즉시 원심 분리하십시오. 뜨는를 제거하고 HEPES Tyrode의 버퍼, 산도 7.4에서 신중하게 펠렛을 다시 중단. </li><li> 혈소판 수를 세고 (단계 3.5) MPV (단계 4.1)의 변화를 결정하십시오 (MPV가 1.5 fL 이상 변하지 않아야 함). </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)으로 혈소판 수를 150,000 혈소판 / μL의 농도로 조정하십시오. 실험 전에 RT에서 30 분 동안 회복하기 위해 혈소판을 남겨주세요. 격리 후 4 시간 이내에 실험을 위해 세척 된 혈소판을 사용하십시오. </li></ol> 5. 플로우 챔버 어셈블리 12를 사용 합니다. 추가 분석을 위해 우선적으로 제거 할 수있는 커버 유리를 수용 할 수있는 한 상업적으로 생산 된 다양한 유동 챔버를 사용할 수 있습니다. 설명 된 실험에 사용 된 유동 챔버는 현미경 삽입 스테이지에 정확하게 맞도록 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)로 만들어졌습니다. 여기에는 흡입구와 배출구 ( 그림 1A - C , 1, 2)와 진공 연결부 ( 그림 1A 및 C , 3)가 있습니다. 맞춤형 실리콘 시트 ( 그림 1A 및 D ; 4)가 위에 배치됩니다. 두 개의 컷 아웃은 커버 유리 ( 그림 1A , 6)를 챔버에 단단히 부착하기 위해 진공 채널을 형성합니다 ( 그림 1A 및 D ; 5). 중앙 절개 부는 유동 채널을 형성한다 ( 도 1A </strong&gt; 및 D ; 7; 폭 2.0 mm, 높이 0.125 mm). 입구와 출구는 유로에 연결되고 진공은 진공 채널에 연결됩니다. <ol><li> 플로우 챔버의 상단을 증류수로 덮고 부드러운면이 아래로 향한 맞춤 실리콘 시트를 물 위에 놓습니다. 시트를 제 위치에 유지하면서 여분의 물을 제거하여 시트를 제자리에 놓습니다. 참고 :이 실리콘 시트는 재사용이 가능합니다 (실리콘은 비활성 속성으로 알려져 있음). 일반적으로 혈소판은 부착되지 않았다. 시트는 세제로 닦고 재료가 손상 될 때까지 재사용 할 수 있습니다 ( 즉, 채널 사이의 영역에서 특히 찢어짐). 일반적으로 시트는 하루에 여러 번 실험하여 20 일 동안 사용할 수 있습니다. </li><li> 60 ° C에서 1 시간 동안 유동 챔버를 배양하여 잔류 물을 증발시켜 실리콘 시트를 유동 챔버에 단단히 부착시킵니다. </li><li> 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 한 방울을HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)을 유로에 넣습니다. 코팅 된면이 아래로 향하게하여 커버 유리 (섹션 2 참조)를 유로에 놓습니다. 진공 펌프를 진공 연결부에 연결하십시오 ( 그림 1A 및 C , 3). 10 kPa의 압력을가하십시오. </li></ol> 6. 혈소판의 사전 염색 및 항체 준비 <ol><li> 혈소판 염색 <ol><li> 37 ℃에서 30 분 동안 10 μg / mL DAPI로 세척 된 혈소판을 인큐 베이트한다. 암소에서. 결합되지 않은 DAPI를 씻어 내고 혈소판 활성화를 막기 위해 프로스타글린을 10 ng / mL의 최종 농도로 첨가하고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 즉시 원심 분리하십시오. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)에서 혈소판 펠렛을 재생하여 150,000 혈소판 / μL의 혈소판 농도를 얻습니다. </li></ol></li><li> 항체의 제조 <ol><li> Biotin으로 표지 된 항체와 Alexa로 표지 된 strep을 혼합합니다.1 : 1의 몰비의 타비 딘. 사용하기 전에 실온에서 최소 10 분 동안 품어 둔다 (단계 7.6). 참고 : 바이오틴 표지 효율은 배치마다 다를 수 있습니다. 표적 분자의 시각화에 문제가있는 경우, 성공적인 바이오틴 일화를 확인하기위한 대조 실험과 특정 비오틴 화 항체의 표적 결합 성질을 수행해야합니다. </li></ol></li></ol> 7. 관류 <ol><li> 형광 현미경뿐만 아니라 현미경 소프트웨어를 시작합니다. 표 1에 나열된 현미경 설정을 사용하십시오. 참고 : 현미경 소프트웨어에 적절한 실험을로드하여 혈소판 및 선택된 형광 표지 항체 및 / 또는 염료의 생세 (live-cell) 시각화 및 기록을위한 현미경 및 기록 설정을 시작하십시오. RT에서 플로우 실험을 수행하십시오. </li><li> 튜브에 10mL 주사기를 연결하고 1 % HSA 블로 우를 흡입하여 흡입 튜브를 차단하십시오cking buffer를 주입 튜브에 넣으십시오. RT에서 15 분 동안 품어 둡니다. HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)을 흡 입 튜빙으로 흡입하여 흡입 튜빙을 헹굽니다. </li><li> 차단 된 입구 튜브와 처리되지 않은 출구 튜브를 직경 1.02mm 및 길이 약 20-30cm로 챔버의 입구와 출구에 연결하십시오. 콘센트 튜빙에 10 mL 주사기 (또는보다 낮은 볼륨)를 연결하십시오. 주사기 펌프의 전원을 켭니다. 참고 : 펌프에 설정된 유속과 함께 주사기의 직경이 체적 유량을 결정합니다. 유동 채널의 표면적과 함께, 전단 속도는 식 13 에 따라 계산 될 수있다 이하. 따라서 주사기 펌프의 유량을 변경하거나 유로의 치수를 변경하여 전단 속도를 조작 할 수 있습니다. 800-1600s -1 의 전단 율은 전형적으로 동맥 혈류를 모델로하며, 25-100 s-1 모델은 정맥혈흐름. 이 설정에서 7.5 μL / min의 유속은 25 s -1 의 전단 속도를 발생시킵니다. 전단 속도 = 6Q / h 2 w in s -1 Q = 체적 유량 (mL / s), h = 높이 채널 (cm) (0.0125cm, 실리콘 시트의 두께), w = 너비 채널 (cm) (이 챔버에서 0.2cm). </li><li> 100X 대물 렌즈 (1,000X의 총 증폭)에 침지 오일 한 방울을 놓고 유리 표면을 아래로하여 현미경에 챔버를 놓습니다. </li><li> 유입 튜브를 HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)이 들어있는 튜브에 넣으십시오. 출구 튜빙에 연결된 주사기의 플런저를 수동으로 당기고 챔버를 통해 용액을 당겨 시스템에서 공기를 제거합니다. 주사기 펌프 ( 그림 1B 및 C , 8)에 주사기를 놓고 펌프를 잠깐 실행하여 플런저를 조이고 안정된 흐름을 확보합니다. </li><li> 혈소판 현탁액 또는 PRP에 항체 및 / 또는 염료를 조심스럽게 추가하십시오.플라스틱 피펫으로 섞어서 1.5 mL 튜브에 옮긴다. 참고 : 전단 속도 25 s-1 (7.5 μL / min)에서 일반적인 30 분 재관류 의 경우 최소 225 μL의 혈소판 현탁액이 필요합니다. 대표 결과에 사용 된 항체를 표 2 에 나타내었다 . </li><li> HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에서 주입 튜브를 PRP 또는 세척 된 혈소판과 항체 및 / 또는 염료가 들어있는 1.5 mL 튜브 ( 그림 1B 및 C ; 9)로 옮깁니다 . 참고 : 튜빙을 옮길 때 공기가 튜브 안으로 들어가는 것을 방지하기 위해 튜빙이 압착되어 있어야합니다 (공기를 밀어내는 것). 비슷한 방식으로 유입 튜브를 다른 튜브로 이동시켜 후속 단계에서 다양한 시약으로 부착 성 혈소판을 치료할 수 있습니다. 잠재적으로 유용한 시약의 목록이 표 3 에 나와 있습니다. </li><li> &#39;실시간 시각화&#39;를 선택하십시오.n &quot;옵션을 사용하여 코팅 된 커버 글래스의 표면에 현미경을 맞추고 혈소판이 유량 용기에 도달 할 때까지 1,600 s-1 (484 μL / min)의 전단 속도로 펌프를 시동하십시오. 시린지 펌프의 세팅을 7.5 μL / min의 유속으로 변경하여 전단 속도를 25 s-1 로 낮추십시오. </li><li> 커버 유리의 코팅면의 표면을 관찰하고 첫 번째 혈소판이 부착하기 시작할 때까지 기다렸다가이 혈소판에 현미경을 맞추고 소프트웨어에서 실험을 시작하여 녹음을 시작하십시오. 여기에 사용 된 녹음 설정은 표 1 을 참조하십시오. </li><li> 라이브 녹음을 시각적으로 따라하십시오. 30 분 후 주사기 펌프를 멈추십시오. 참고 : 실험 도중 혈소판에 초점이 맞춰 졌는지 확인하십시오. 전형적으로, 20-30 개의 혈소판이 1,000X의 배율로 시야에 붙습니다. 이것은 전체 흐름 채널에서 약 2,000-3,000 개의 혈소판입니다. </li><li> 사용하여 고정플로우 챔버 (옵션). <ol><li> 주사기 펌프를 멈춘 후 흐름이 멈 추면 주입 튜브 (공기가없는)를 고정 용액으로 옮기십시오. 펌프를 다시 시작하고 단계 7.8에서 언급 한 것과 같은 유속으로 채널을 통해 고정 버퍼를 최소 10 분 동안 흐르게하십시오. </li></ol></li><li> 현미경에서 챔버를 제거하고, 유리에서 침지 오일을 청소하고, 진공을 차단하고, 18G 바늘로 조심스럽게 커버 유리를 챔버에서 제거하십시오. 참고 : 커버 유리가 파손되어 실리콘 시트가 손상되지 않도록하십시오. </li><li> 증류수로 미리 적셔 놓은 조직의 상단에있는 4- 웰 플레이트에 커버 슬라이드 (셀이 위를 향하도록)를 놓습니다. 참고 : 이렇게하면 커버 유리가 표면에 달라 붙지 않고 건조되지 않습니다. </li><li> 커버 유리 위에 고정액 750 μL를 피펫과 실온에서 1 시간 품어. 샘플을 직접 분석 할 수없는 경우,안정적인 고정을 보장하기 위해 4 ℃에서 0.5 % PFA (HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4로 희석)에 보관하십시오. 이미징을 위해 커버 유리를 처리하려면 8 절을 계속 진행하십시오. </li><li> 사용 후에는 챔버, 튜빙 및 시트를 증류수로 헹구고 세제 용액에서 밤새 배양하십시오. 챔버 및 다른 구성 요소를 재사용하기 전에 증류수로 헹구십시오. </li><li> 모든 메타 데이터가 포함 된 현미경 원시 데이터 파일을 저장합니다. 필요할 때 동영상을 .MOV, h.264 압축 또는 .AVI 비 압축으로 내 보냅니다. 별도의 프레임을 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오. </li></ol> 8. 공 촛점 형광 현미경 검사를위한 샘플 준비 <ol><li> 덮개 유리를 새로운 4-well plates에 옮기고 3 mL의 HEPES Tyrode &#39;s buffer, pH 7.4로 5 회 헹굽니다. 차단 버퍼 3 ML / 잘 추가하고 RT에서 1 시간 품어. </li><li> 블로킹 버퍼를 제거하십시오. HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에 0.15 % 글리신 (M / V) 3 mL / well을 첨가한다. R에서 15 분간 품어 둔다.티. </li><li> 글리신 용액을 제거하고 3 mL / well의 블로킹 완충액으로 5 번 씻는다. 필요에 따라 추가 염색을 위해 블로킹 완충액으로 희석 한 형광 단 결합 항체를 첨가하십시오. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 차단 완충액으로 5 회, 증류수로 2 회 세척한다. 세포를 만지지 말고 조직 안의 가장자리에서 과량의 액체를 제거하여 유리를 말립니다. </li><li> 현미경 슬라이드에 폴리 비닐 알코올 용액 60 μL를 피펫에 넣습니다. 세포와 함께 커버 유리를 방울 위에 놓고 폴리 비닐 알코올이 두 표면 사이에 퍼지게하십시오. 어두운 밤 RT에서 밤새 품어 낸다. </li><li> 공 촛점 현미경으로 세포를 분석 14 . </li><li> 모든 메타 데이터가 포함 된 기록 된 스택 데이터의 원시 데이터 파일을 저장합니다. 필요한 경우 원시 데이터 파일을 MOV, h.264 압축 또는 .AVI 비 압축 파일로 처리합니다. 별도의 스택을 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오. </li></ol>

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	<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+granule+exocytosis:+a+comparison+with+chromaffin+cells.">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).</li><li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines.">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li><li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein.">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li><li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules:+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis.">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li><li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+&#945;-granules.">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet &#945;-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li><li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells,+their+extracellular+matrix,+and+purified+components.">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li><li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro.">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation.">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li><li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity.">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li><li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation:+methodological+issues.">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li><li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood.">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li><li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH.">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy:+present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li><li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules,+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome,+and+appears+identical+to+granulophysin.">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li><li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes.">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li><li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control:+Alternatives+for+ADAMTS13.">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li><li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy.">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li><li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact.">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li></ol>

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전 세계적으로 혈전증은 사망 및 이환율의 주요 원인이며 혈소판은 그 발달에 중심적인 역할을합니다. 이 작품은 흐름 아래 혈소판 degranulation의 라이브 셀 이미징을위한 방법을 설명합니다. 일반적으로 혈소판이 활성화되면 모든 세분화 된 내용물이 직접 용액으로 방출된다고 가정합니다. 수반되는 결과는 이것이 꼭 그런 것은 아니라는 것을 암시한다. 접착 및 탈과립시 혈소판은 상당량의 폴리...

혈소판은 혈류를 순환하는 무핵 세포입니다. 그들의 주요 기능은 손상 부위에서 혈관 침범을 봉쇄하고 출혈을 막는 것입니다. 이러한 부상 부위에서, 내피 내 콜라겐 섬유가 노출되고이어서 다량 단백질, 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)로 덮힌 다. VWF는 세포 표면의 당 단백질 Ibα-IX-V 복합체에 의존하는 메커니즘으로 혈소판과 순환 적으로 상호 작용하여 혈소판의 속도를 늦춘다. 이것은 고 전단 속도에서 특히 중요합니다. 이어서 혈소판은 콜라겐으로부터 활성화 자극을받는 동안 형태 학적 변화를 겪습니다. 이것은 돌이킬 수없는 퍼짐 및 결국 혈소판 응집을 유도한다. 두 공정 모두 혈소판 - 혈소판 혼입을 촉진하기 위해 과립 내용물의 분비에 달려있다. 그 중에서도 혈소판 알파 과립에는 혈소판의 부착과 다리를 돕기 위해 섬유소원과 VWF가 포함되어 있습니다혈소판을 인테그린에 의존적으로 결합시킨다. 혈소판 고밀도 과립에는 혈소판 활성화를 강화시키는 데 도움이되는 칼슘 및 아데노신 디 포스페이트 (ADP)를 비롯한 무기 화합물 2가 포함되어 있습니다. 또한 혈소판에는 (알레르기) 염증 3 매개체, 보체 - 조절 단백질 4 및 혈관 신생 인자 5,6 이 포함되어있어 이러한 내용물이 다양한 조건에서 어떻게 다르게 방출되는지 여부와 문제에 대한 의문을 제기합니다. 1980 년대 이래로, 혈류 모델에서 혈소판 기능에 대한 연구는 혈전 메커니즘의 연구에 유용했다. 그 이후로 많은 기술적 진보가 이루어졌으며, 피브린 형성을 포함하는 유동 모델은 현재 생체 내 에서 치료 용 혈소판 농축 물의 지혈 가능성을 평가하기 위해 개발되었다.혈전 형태학에 전단 율의 교란이 미치는 영향을 조사 9 . 병리학 적 혈전 형성 (혈전증)에 비해 안정적인 접착 및 생리적 인 혈전 형성 (지혈)을 유도하는 분자 및 세포 - 생물학적 기전의 차이는 매우 미묘 할 수 있으며, 이러한 세포 내 (subcellular)의 실시간 시각화를 허용하는 흐름 모델의 개발을 동기 부여 할 수있다 프로세스. 그러한 셋업이 가치있는 과정의 예는 세포 내 폴리 인산염의 (재) 분포와 응고 인자의 동원에 의해 섬유소 미세 구조에 미치는 영향을 밝혀줍니다. 연구는 종종 종단점 분석으로 제한됩니다. 기술 된 방법의 주 목적은 혈류가 활성화 된 상태에서 혈소판 활성화 과정에서 발생하는 동적 세포 과정을 실시간으로 시각적으로 조사 할 수있게하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostacyclin&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid&amp;nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness.</td></tr><tr><td>Chromosulfuric acid (2% CrO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Von Willebrand factor (VWF)</td><td>in-house purified</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4 well dish, non-treated</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin Fraction V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td>823022</td><td></td></tr><tr><td>Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>Cell analyser&amp;nbsp;</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CELL-DYN hematology analyzer</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA</td><td>Harvard apparatus 22</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe with 14.5 mm diameter</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Luer-Lok syringe</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotin&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>AB134331</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62P-biotin&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&amp;nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Detergent solution</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Sheep Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Parafinn film</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 in. x 125 ft. Roll.</td></tr><tr><td>Silicone sheet non-reinforced</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm x 150 mm x 0.125 mm.</td></tr><tr><td>Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels</td><td>in-house made</td><td></td><td>Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss Observer Z1&amp;nbsp;</td><td></td><td>Equiped with LED excitation lights.</td></tr><tr><td>Microscope software</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>blue edition</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle (18 G x 1 1/2&quot;)</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Plastic pasteur pipet</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&amp;nbsp;7 mL non sterile, graduated up to 3 mL.</td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 &amp;deg;, frosted end.</td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of platelet degranulation and secretion under flow

혈소판은 혈관 침범을 봉쇄하기위한 혈전 형성의 지혈에 필수적인 요소입니다. 또한 혈전증, 혈관을 막아 장기를 손상시키는 혈전 형성에 생명을 위협하는 결과를 초래합니다. 이것은 혈소판 기능에 대한 과학적 연구와 흐름 조건에서 일어날 때 세포 생물학적 과정을 추적하는 방법 개발의 동기를 부여합니다. 혈소판 접착 및 응집의 연구를 위해 다양한 유동 모델을 사용할 수 있는데, 혈소판 생물학의 두 가지 주요 현상입니다. 이 연구는 활성화 동안 혈류에서 실시간으로 혈소판 탈과립을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 와이드 필드 역전 된 LED 기반 형광 현미경 아래에 놓인 주사기 펌프 셋업에 연결된 유동 챔버를 사용합니다. 여기에 설명 된 설정은 형광으로 표지 된 항체 또는 형광으로 전달되는 다중 형광 물질의 동시 여기를 허용합니다염료. 라이브 셀 이미징 실험 후 커버 유리는 정적 현미경 ( 즉, 공 초점 현미경 또는 주사 전자 현미경)을 사용하여 추가 처리 및 분석 될 수 있습니다.

도 1 은 유동 챔버 및 실험 장치의 이미지를 도시한다. 실리콘 시트의 위치와 치수; 및 배관 연결. 그림 2 는 플로우 챔버의 치수에 대한 세부 사항을 제공합니다. 그림 3 과 영화 1 은 고정 된 VWF에 혈소판 접착 및 퍼짐의 이미지의 시계열을 보여줍니다. CD63은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 고밀도...

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Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.5K 조회수.  University Medical Center Utrecht.  이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다. 

비디오: Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

연구

생체공학

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

면역학 및 감염병학

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

생물학

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

<meta charset="utf8"></head><body>Trauma and Transfusion에서 혈소판 기능을 평가하기 위한 플랫폼

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying aspects of thrombosis and hemostasis. At high-shear environments simulating arterial flow, a microfluidic assay facilitates the study of platelet function, as platelet-rich thrombi form in a localized stenotic region of a flow channel. Utilizing devices that allow for small sample volume can additionally aid in evaluating platelet function under flow from volume-limited patient samples or animal models. Studying trauma patient samples or samples following platelet product transfusion may aid in directing therapeutic strategies for patient populations in which platelet function is critical. Effects of platelet inhibition via pharmacological agents can also be studied in this model. The objective of this protocol is to establish a microfluidic platform that incorporates physiologic flow, biological surfaces, and relevant hemostatic mechanisms to assess platelet function with implications for the study of trauma induced coagulopathy and transfusion medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

Platelet function under flow can be assessed and simulated hemostatic resuscitation can be modeled using a microfluidic device, which has applications in trauma and transfusion medicine.

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

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혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

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