Name: assessment of hippocampal dendritic complexity in aged mice using the golgi-cox method
Uploaded: 2017-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method at JoVE.com

Bu çalışma, NIH P20 GM109005 (ARA) kapsamında bir pilot yardım ve Translational Neuroscience IDeA Programı ödül P30 GM110702 tarafından desteklenmiştir.

Denemeler, UAMS &#39;da Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan etik standartlara uygun olarak yürütülmüştür. 1. Hayvanlar ve 5-Fu Enjeksiyon Paradigması <ol><li> 6 aylık erkek C57Bl6 / J vahşi tipli fareler satın alarak bunları 1 yaşına gelene kadar sabit 12 saat aydınlık / karanlık döngü içinde yerleştirin. </li><li> 5-Fu&#39;yı% 0.9 steril tuzlu suda inceltin. Fare başına gerekli doz olarak 60 mg / kg kullanın. </li><li> 5-Fu&#39;nun intraperitoneal enjeksiyonlarını yapın (haftada bir kez üç hafta boyunca). <ol><li> Her gün aynı periyotta intraperitoneal enjeksiyonları verin. Örneğin, saat 09.00-1200 arasında. </li></ol></li><li> Hayvanları durdurun ve son enjeksiyondan 30 gün sonra beyinlerini alın. </li></ol> 2. Ötenazi Prosedürü ve Beyin Çıkarma <ol><li> Kemirgenleri sıkın ve kuyruk tabanı tutun. Öte yandan başparmak ya da parmağınızıKemirgen hayvanının boynu tabanı. Kemiricinin boynuna hızla baskı uygulayın ve diğer eliniz kuyruk tutarken geriye doğru çekin. </li><li> Kemirganı bir elinizle ve büyük makas makinesini diğeri ile tutun. Kemirgenlerin boynunu iki bıçak arasına yerleştirin ve kafayı çabucak kesin. </li><li> Kopmuş fare kafasını kaldırın ve kafatasının üstündeki kürkü düzeltmek için ince makasları kullanın. Daha sonra, makasın uçlarını her bir göz soketine yerleştirin ve hafifçe kuvvetle makarayı kapatın. </li><li> Serebellumun sağında ve solunda kafatasını kesmek için yaylı makas kullanın. </li><li> Serebellumu çevreleyen kafatasının bir kısmını yukarı kaldırıp kaldırmak için forseps kullanın. </li><li> Kafatasının midsagittal çizgisini kesmek için makas kullan. </li><li> Kafatasının kalan kısmını beyinden kaldırmak için forseps kullanın. </li><li> Beyni istenilen kaba koymak için bir spatula ve bir sonda kullanın. Paslanmaz çeliktenTeel bıçakla, her beyin midsagital düzlem boyunca kes. Sağ hemisferlerde aşağıdaki Golgi-Cox yöntemini uygulayın. </li></ol> 3. Golgi Boyama ve Doku Hazırlama <ol><li> Yeni hasat edilen yarım beyinleri, 10 mL&#39;lik konik bir tüpteki 5 mL cıva klorür esaslı çözeltiye (kitten çözelti A) daldırın. Cıvalı klorür çözeltisi ışığa duyarlıdır; Tüpü folyo ile örtün. Numuneyi oda sıcaklığında karanlıkta saklayın. NOT: Çözüm A, malzeme tablosunda listelenen kit içinde sağlanmıştır. Dikkat! Çözelti A (ayrıca civalı klorür çözeltisi olarak da adlandırılır), potasyum dikromat, mercurik klorür ve potasyum kromat gibi toksik reaktifler içerir. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın. </li><li> 1 gün sonra solüsyonu geçici bir kaba (büyük bir tartım botu gibi) yavaşça boşaltın ve bir biyolojik tehlikeli atık kabına atın. Beyinlerini (orijinal 10 mL konik tüplerde hala) 5 mLMercurik klorür solüsyonu ilave edin ve numuneyi oda sıcaklığında 13 gün daha karanlığa döndürün. </li><li> 90 ml damıtılmış veya deiyonize suya (dH20) 30 g emdirme sonrası tampon ekleyin. 6 oyuklu bir tabakın her kuyucuğunu 6.5 ml&#39;lik post-emprenye tamponuyla, beyne göre birer tane doldurun NOT: Emdirme sonrası tampon maddesi, malzeme tablosunda listelenen kit içinde sağlanmaktadır. <ol><li> Cıva klorür solüsyonunda 14 gün sonra (toplamda), dokuyu dH20 ile durulayın, daha sonra emdirme sonrası tamponla birlikte 6 gözlü plakalara aktarın. Tabakları folyo ile örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında saklayın. </li></ol></li><li> 1 gün daldırıldıktan sonra emprenye sonrası tampon maddeyi pipetleyin ve yeni emdirme sonrası tampon ile yenileyin; Oda sıcaklığında karanlıkta 1 gün saklayın. Gerekirse, bunu 1 aya kadar 4 ° C&#39;de saklayın 22 . </li></ol> 4. Kesit alma <ol><li> Kapaklardaki 12 yuvalı plakları, soldan sağa ve yukarıdan aşağıya artan sırayla numaralandırın. </li><li> Beynin her birine bölünürse, beyin başına iki ya da üç 12 plakalı tabak hazırlayın. <ol><li> Her bir 12 bölmeli plakanın üst kısmını, kesit alan beyin tanımlama numarası ile etiketleyin. </li><li> Her plakanın her kuyusuna 2 mL 1x PBS pipetleyin. </li></ol></li><li> Sahneyi kurun ve vibratome&#39;yu açın; Dokuyu kapatacak kadar kapta yeterli 1x PBS bulunduğundan emin olun. <ol><li> İki parça plastik parafin filmi kesin ve iki kat daha katlayın. 1x PBS&#39;nin sayaca sızmasını önlemek için numune tutacağı çıkıntılarının deliklerine yerleştirin. </li><li> Şişeyi örnek tutucunun doku bloğuna koyun ve sonra siyanoakrilat yapışkan tutkalı (malzeme tablolarına bakın) koyun. </li></ol></li><li> Beyni 6 kuyucuklu plakadan çıkarın ve bir plastik veya cam tabak üzerine koyun. Paslanmaz çeliktenSerebellumun yarısını kesmek için çelik iki kanatlı bıçak. <ol><li> Serebellini kaudally kesin. Kalan kalan serebellinin bile eşit olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Geri kalan serebellumun düz yüzeyini tutkal üzerine derhal yerleştirin. NOT: Dokunun dorsal kısmı (serebral korteks) bıçağın sağına veya sağına bakmalıdır. Daha önce koku alma ampulünün bulunduğu rostral uç yukarı bakmalıdır. <ol><li> Tutkalın tamamen kurutulduğundan emin olmak için en az birkaç dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Beyni yerinde tutan yapışkan kuruysa da numune banyosuna 1x PBS dökün. Tutkal kuruduktan sonra numune tutacağını doku ile birlikte numune banyosuna yerleştirin. <ol><li> Doku örneği tam olarak kaplanmamışsa, numune banyosuna 1x PBS daha dökün. </li></ol></li><li> Bıçağı, vibratomun bıçak tutucusuna ve yavaşça l1x PBS&#39;ye tamamen batıncaya kadar bıçağı numune banyosuna geçirin. Bıçağı, dokunun üstünün biraz altına düşene kadar indirmeye devam edin. </li><li> Vibrasyon hızı 7&#39;ye, genliği 6&#39;ya ve kesme açısını 12 °&#39;ye ayarlayın (vibratome model için malzeme tablosuna bakın). Titreşimi başlatın ve 200 μm kesitleri kesin 23 . <ol><li> Doku bölümlerini numune banyosundan 12 oyuklu plakaların belirlenmiş her bir oyuğuna taşımak için büyük bir fırça kullanın. </li></ol></li><li> İstenen sayıda doku kesitine ulaşana kadar dokuyu kesmeye devam edin. </li></ol> 5. Post-boyama <ol><li> Aşağıdaki boyama adımları ve durulamalar için her biri için belirtilen çözeltiden 2 mL kullanın. Çözümleri oyuklara aktarmak için motorlu bir pipet dolgusu kullanın (materyal tablosuna bakın). Çözümleri kuyulardan ve uygun atıklara aktarmak için bir transfer pipeti (bkz. Malzeme tablosu) kullanınkonteynerler. </li><li> Parçaları 0.01 M PBS-T&#39;nin bir 30 dakika yıkamasında durulayın (3.0 mL deterjan ekleyin (materyal tablosuna bakın) 1000 mL 0.01 M PBS&#39;ye ekleyin). </li><li> Amonyum hidroksit solüsyonunu (Dikkat) 3: 5 oranında dH20 ile seyreltin, kullanımdan hemen önce. Seyreltilmiş amonyum hidroksit solüsyonundaki kısımları 19-21 dakika boyunca boyayın. <ol><li> Işık hassas amonyum hidroksit solüsyonunu folyo ile koruyun. NOT: Çözeltideki amonyum hidroksit konsantrasyonu ~% 10&#39;dur ve &quot;tehlikeli&quot; olarak sınıflandırılmıştır. Amonyum hidroksit çözeltisi deriyle temas halinde yanıklara neden olabilir. Solunduğunda solunum borusu tahrişine neden olabilir. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın. </li></ol></li><li> Bölümleri, boyama sonrası tamponda boyayın (19 dakika boyunca 21 dakika boyunca 500 mL dH20 içinde 90 g reaktif D ekleyin). Boyama sonrası tampon ışığa duyarlıdır; Folyo ile koruyun 22 . </li><li> Kesitleri üç, 0.01 M PBS-T&#39;nin 5-10 dk yıkaması. </li></ol> 6. Montaj, Temizleme ve Kaplama <ol><li> Büyük fırça ile% 1 jelatin kaplı slaytlara bölümleri monte edin. Oda sıcaklığında 20-30 dakika boyunca kurumalarını bekleyin ve sonra gece boyunca bir Coplin kavanozuna koyun. </li><li> Eldivenleri eldivenli ellerle Coplin kavanozundan çıkarın ve plastik bir rafa koyun (materyal tablosuna bakın). Plastik rafı% 100 etanol içeren boyama kabına (bkz. Malzeme tablosu) yerleştirin. Onları üç tane 5 dk yıkayarak kurutun. </li><li> Slaytları, her biri% 99 ksilen içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Sürgüleri bir cam rafa yerleştirin ve rafı, metal saplı ksilen içeren bir cam boyama kabına indirin (bkz. Malzeme tablosu). NOT: Dikkat, ksilen inhale edildiğinde zararlıdır ve deriye dokunursa tahrişe neden olur. Sıvı ve buhar hallerinde son derece yanıcıdır. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın. </li><li> Slaytları xyl&#39;den kaldırEne birer birer alın ve dokuyu ~ 0.25 mL montaj medyasıyla hızlıca kaplayın (bkz. Malzeme Tablosu). Daha sonra, slayt kapaklarını alın ve onları ortamın üzerine koyun. <ol><li> Kapakların altındaki sıkışmış hava kabarcıklarını, bir fırça sonu gibi kör bir nesneyle kenara itin. </li></ol></li><li> Slaytları güneş ışığından uzak bir alana yerleştirin ve 2-3 gün kurumalarını bekleyin. </li><li> Bir mikroskop kullanarak görüntü elde etmeye ve uygun yazılımla analiz etmeye devam edin. </li></ol> 7. Görüntü Yığını Edinme <ol><li> Görüntüleme programını açın (bkz. Malzeme Tablosu ). Slayt mikroskop sahnesine yerleştirin. Programın üst kısmındaki menüde, &quot;Edinme&quot; yi tıklayın ve ardından &quot;Canlı Resim&quot; i tıklayın. </li><li> Mikroskopu 10X yapın. Tercih nöronunu belirleyin ve ardından kırmızı bir X gibi görünen imleci soma&#39;nın merkezine getirin. Referans noktasını ayarlamak için sol tıklayın. </li><li> Mikroskopu 40X yapın. Programın üst kısmındaki menüden &quot;Taşı&quot; yı tıklayın ve ardından &quot;Referans Noktasına&quot; tıklayın. </li><li> Odak dışına gelene kadar dokunun üzerindeki ince objektifi elle kaydırarak görüntü yığını oluşturmaya başlayın. <ol><li> &quot;Image Acquisition&quot; başlığı altındaki programın sağ alt köşesindeki &quot;Üstü Ayarla&quot; yı tıklayın. </li><li> Dokudan biraz dışarı doğru kaydırın ve ardından &quot;Resim Alma&quot; altındaki &quot;Altını Ayarla&quot; yı tıklayın. Ardından, &quot;Görüntü Yığını Al&quot; ı tıklayın. </li></ol></li><li> Görüntü yığını edinildikten sonra, görüntülenen pencerede görüntü dosyası için istediğiniz adı yazın. &quot;MBF Ascii dosyası&quot; olarak kaydedin. <ol><li> İstendiğinde, dosya türünü &quot;MBF JPEG2000 yığın dosyası&quot; olarak seçin ve ardından &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li></ol></li></ol> 8. Nöronal İzleme <ol><li> Toolba&#39;daR menüsünün altındaki &quot;Kontur Adı&quot; başlıklı kutuyu tıklayın. Açılır menüden &quot;Soma&quot; yı seçin. </li><li> Elle soma izini almak. Ardından sağ tıklayın ve izleme tamamlandığında &quot;Cell Body&#39;yi Sonlandır&quot; ı seçin. </li><li> &quot;AutoNeuron Workflow&quot; başlıklı başka bir sekme açmak için &quot;AutoNeuron&quot; u seçin. </li><li> &quot;Yapılandırma Türü&quot; nin altında &quot;Yeni&quot; yi seçin. Parametreleri ayarlayın ve &quot;Soma Algılama&quot; alt başlığını getirmek için &quot;Sonraki Adım&quot; ı tıklayın. <ol><li> Parametreleri ayarlamak için &quot;Parlaklık Alanı&quot; nı seçin. Ardından, &quot;Maksimum İşlem Çapı&quot; altında, &quot;Ölçüm Başlat&quot; ı tıklayın. İmleci kullanarak, dendritin tabanına gidin ve elle çapı ayarlayın. </li></ol></li><li> Kullanıcının tüm görüntüyü izlemesini isteyen pencerede &quot;Evet&quot; seçeneğini tıklayın. Elle soma izini almak. &quot;Tohum Yerleşimi&quot; alt başlığını getirmek için Tıklayın ve ardından &quot;Sonraki adım&quot; a tıklayın. </li><li> &quot;Doğrulama Tohumunu&quot; tıklayınS &quot;yazıp&quot; Next Step &quot;e basarak&quot; Neuron Reconstruction &quot;alt başlığını getirin. </li><li> &quot;Neuron&quot; altında, &quot;Etkileşimli&quot; yi tıklayın. Dendritlerin programındaki yönergeleri izleyerek ve program tarafından izlenen vurgulanan alanı tamamlamak için sağ tıklayarak etkileşimli izlemeyi gerçekleştirin. Tüm dendritleri izledikten sonra &quot;Sonraki Adım&quot; ı tıklayın. </li><li> Yeni bir pencere göründükten sonra, yeni konfigürasyonu istediğiniz başlık ile kaydedin. &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li></ol> 9. Analiz <ol><li> Analiz programını açın (materyal tablosuna bakın). </li><li> Üst menüden &quot;Dosya&quot; yı tıklayın ve ardından &quot;Veri Dosyasını Aç&quot; ı tıklayın. İlgilenilen dosyayı seçin. </li><li> Analiz alt başlığı altında, &quot;Sholl Analizi&quot; ni seçin. </li><li> &quot;Sholl Analysis&quot; penceresinde başlangıç ​​yarıçapını 10 μm olarak ayarlayın. &quot;Analiz&quot; altında, &quot;Dendritler&quot; ve &quot;Şube Siparişleri&quot; kutularını tıklayın. </li><li> Sağ clYeni açılan pencereleri tıklayın ve &quot;Excel Dışa Aktar&quot; ı tıklayın. &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> Analizde &quot;Dallanmış Yapı Analizleri&quot; ni tıklayın. &quot;Tüm Olası Analizler&quot; i seçin. </li><li> Yeni açılan pencereyi sağ tıklatın ve &quot;Excel Dışa Aktar&quot; ı tıklayın 24 . </li></ol>

<ol>
	<li>Stuart, G. J., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+integration:+60+years+of+progress.">Dendritic integration: 60 years of progress.</a> Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+tree+and+brain+disorders.">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li><li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Dynamics+of+Dendritic+Spines+in+Memory+and+Cognition.">Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition.</a> Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).</li><li>von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+dendritic+spines+within+the+hippocampus.">Structure and function of dendritic spines within the hippocampus.</a> Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).</li><li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2.">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li><li>Bourne, J. N., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+structure+and+function+at+hippocampal+dendritic+spines.">Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines.</a> Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).</li><li>Lai, K. O., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines:+the+underlying+mechanisms+and+its+dysregulation+in+brain+disorders.">Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).</li><li>Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+development,+and+plasticity+of+dendritic+spines.">Structure, development, and plasticity of dendritic spines.</a> Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).</li><li>Harris, K. M., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines:+cellular+specializations+imparting+both+stability+and+flexibility+to+synaptic+function.">Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function.</a> Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).</li><li>Leuner, B., Shors, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress,+anxiety,+and+dendritic+spines:+what+are+the+connections.">Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections.</a> Neuroscience. 251, 108-119 (2013).</li><li>Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+at+dendritic+spine+synapses+during+long-term+potentiation.">Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).</li><li>Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-stability-function+relationships+of+dendritic+spines.">Structure-stability-function relationships of dendritic spines.</a> Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).</li><li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Golgi-Cox+method.">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li><li>Koyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unending+fascination+with+the+Golgi+method.">The unending fascination with the Golgi method.</a> OA Anat. 1 (3), 24 (2013).</li><li>Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+"selectivity"+of+the+Golgi-Cox+method.">On the "selectivity" of the Golgi-Cox method.</a> J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).</li><li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum.">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li><li>Rosoklija, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Golgi+methods+for+impregnation+of+brain+tissue+from+humans+and+monkeys.">Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys.</a> J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).</li><li>de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal:+lessons+on+brain+development.">Cajal: lessons on brain development.</a> Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).</li><li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"single"+section+Golgi-impregnation+procedure:+methodological+description.">The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li><li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi-Cox+staining+step+by+step.">Golgi-Cox staining step by step.</a> Front Neuroanat. 10 (38), (2016).</li><li>. Vibroslice NVSL &amp; Vibroslice NVSLM123 Available from: <a target="_blank" href="https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf">https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf</a> (2000)</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neurolucida 11.03. , (2017).</li><li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+organization+in+the+neurons+of+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat.">Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li><li>Pillai, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+morphology+of+hippocampal+and+amygdalar+neurons+in+adolescent+mice+is+resilient+to+genetic+differences+in+stress+reactivity.">Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li><li>Morley, B. J., Mervis, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+alterations+in+the+hippocampus+and+parietal+cortex+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+knockout+mice.">Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice.</a> Neuroscience. 233, 54-63 (2013).</li><li>Titus, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypobaric+hypoxia-induced+dendritic+atrophy+of+hippocampal+neurons+is+associated+with+cognitive+impairment+in+adult+rats.">Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats.</a> Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).</li><li>Groves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluorouracil+chemotherapy+upregulates+cytokines+and+alters+hippocampal+dendritic+complexity+in+aged+mice.">5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice.</a> Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).</li><li>Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Golgi+analysis+method+for+efficient+and+unbiased+classification+of+dendritic+spines.">Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li><li>Kaufmann, W. E., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation.">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).</li><li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+tree+and+brain+disorders.">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Daha modern tekniklerle karşılaştırıldığında, Golgi-Cox yöntemi, omurga morfolojisini incelemek için tercih edilen yöntem olan çeşitli avantajlara sahiptir: 1) Boyama esasen herhangi bir doku için kullanılabilir 2) Basit bir ışık mikroskopu kurulumu, 3) Golgi-Cox görüntüleme konfokal görüntülemeden daha hızlıdır ve 4) Golgi lekeli bölümler birkaç ay ila yıllarca floresanla işaretlenmiş örneklerden daha uzun süre yaşayabilir. Bu avantajlarla bile, Golgi-Cox yönteminin hala bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, tüm süreç çok zaman alıcıdır, birkaç hafta boyunca boyama gerektirir ve ardından görüntülerin analizi yapılır. Bu protokol ile görüldüğü gibi, kesitlendirme başlamadan önce A çözeltisinde 14 gün, B çözümü için 1 gün sürer. Ek olarak, kesitlendirme, post-lekeleme ve montaj yapmak beyne 2-3 saat sürecektir. Her slayt temizleme ve örtme işleminden önce 1 gün boyunca kurumaya bırakılmalıdır. Ardından, zaman miktarıGörüntü alıp götürecek ve bölümlerini analiz edecek olan kişi bağlı olacaktır. İkincisi, kategorilere ayrılan dikenlerdeki farklılıklardan dolayı analistlerden gelen veriler arasında tutarlılık sorunları olabilir30. Bu nedenle, bir kişinin her denemenin görüntüleme ve analiz bölümünü gerçekleştirmesi ve böylece projenin tamamlanması için gereken süreyi uzatması önerilir. Golgi-Cox yönteminde, kesin zamanlama ve dikkat gerektiren kritik adımlar vardır. Kesitleri amonyum hidroksit çözeltisi ile boyadığınızda, bölümlerin en az 19 dakika süreyle çözelti içinde kalması zorunludur, ancak 21 dakika boyunca gerekli değildir. Kesitler yeterli süre boyunca amonyum hidroksit solüsyonunda bulunmazlarsa, lekelenmeyeceklerdir, yani nöronlar görüntüleme sırasında daha az tanımlanacak, dolayısıyla onları daha zor analiz edecektir. Eğer bölümler amonyum hidroksit solüsyonunda 21 dakikadan fazla sürerse, ov olurlarEr lekelenmiş, bu nedenle bireysel nöronların belirlenmesini zorlaştırıyor. Bu nedenle, çözümleri değiştirirken, araştırmacı hızlı bir şekilde hareket etmelidir. Bir diğer önemli adım ise, bölümlerin slaytlara aktarılmasıdır. Kesitleri büyük boy fırça ile taşımadan önce, önce slayt üzerine az miktarda PBS-T eklemeniz daha iyidir. Bu, bölümlerin slayt üzerine kolayca yerleştirilmesine ve potansiyel olarak kopmadan manevra yapılmasına olanak tanır. Bir diğer kritik adım, bölümler bir slayda yerleştirildikten sonra kurutma basamağıdır. Sürgüler oda sıcaklığında en az 20 dakika kurumazsa, dehidrasyon adımları sırasında bazı bölümlerin düşmesi muhtemel olur. Sürgüler 30 dakikadan uzun süre kurumaya bırakıldıysa, dehidrasyon adımları sırasında büyük olasılıkla kırılabilirler ve parçalanırlar. Bu işlemi yaparken, bazı adımlar zahmetli olabilir. Örneğin, beyni spektruma yerleştirmeden önce serebellum kesilirseImen tutucu ve kesit alma, beyin, DG tamamen kesilmeden önce parçalanabilir, böylece başka bölümler kullanılamaz hale gelir. Bu nedenle, serebellumun sadece yarısı boyunca kaudal olarak kesilmesi önemlidir. Bölümleri olumsuz etkileyebilecek bir diğer adım da vibratome hızı ve genliktir. Tavsiye edilen ayarlar sırasıyla 7 ve 6&#39;dır, kesim üzerine bazı bölümler PBS&#39;de parçalanabilir veya pürüzlü görünebilir. Bunu düzeltmek için, ya vibratome hızı ya da genliği, bölümler biraraya gelinceye kadar teker teker ve hatta 6-8 arasındaki ayarlar arasında ince ayarlayın. Golgi lekelenmesi için ticari kitler mevcut olmasına rağmen, genellikle her adım için kesin ayrıntıları yoktur. Bu protokolle, diğer laboratuvarların minimum sorun giderme ile dokuları yüksek kalitede güvenilir şekilde leke yapmasına izin vermek için kullanılan tüm adımları ayrıntılı olarak rapor ediyoruz. Kullanılan malzemeler, çoğu sinirbilimi laboratuarı tarafından kullanılabilir. Dentrit morpundaki aberasyonlarHologram ve dendritik omurga sayısındaki değişiklikler çok sayıda nörolojik rahatsızlıkla ilişkilidir 31 . Ayrıca, dendritik arborizasyonun bu dalgalanmaları, beyindeki 32 kemoterapi ile oluşan yaralanmanın belirgin bir morfolojik damgasını temsil edebilir. Gelecekte, 5-Fu tarafından indüklenen yapısal değişikliklerin davranışsal, hücresel ve moleküler değişimlerle nasıl ilişkili olabileceğini inceleyeceğiz.

<html> Dendritler, presinaptik girdi 1&#39;i alan ve işleyen nöronların en büyük kısmıdır. Dendritik süreçleri, proksimal dalların distal dallardan daha büyük bir çapa sahip olduğu karmaşık bir geometriye sahiptir. Dendritler geliştikçe, dendritik arborizasyon olarak adlandırılan bir süreçte diğer nöronlarla birkaç bağlantı oluştururlar. Bu dallanma miktarı ve paterni, bir dendrite&#39;nin 2&#39;yi yeterince işleyebildiği sinaptik girdilerin miktarını belirler. Dendritik koordinasyon, aktiviteye bağlı plastisite ve nöronal devrelerin düzgün gelişimi için gerekli bir süreçtir. Uzatma, geri çekme, dallanma ve sinaptojenez intrensek genetik programlar ve ekstrensek faktörlerden etkilenen karmaşık süreçlerdir. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilirF &quot;&gt; 3 , 4. Dendritik karmaşıklıktaki değişiklikler patofizyolojik ve davranışsal değişikliklerle ilişkilidir 5. Anormallikler Kırılgan X Sendromu ve Down Sendromu 6 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir. Dendritik omurgalar, merkezi sinir sistemi içinde heyecan verici girdiler alan dendritik arbelerin uzmanlaşmış subselüler bölmeleridir. Dendritik dikenlerin üç morfolojik sınıfı vardır, her sınıfa boyutları ve şekilleri temel alınarak adı verilmiştir: 1) diğer dikenlere göre daha fazla glutamat reseptörü ile kompleks postsinaptik yoğunluklara sahip olan mantar dikenleri; 2) kökten yoksun sağlam dikenler; Ve 3) uzunlamasına dar bir gövdeden ve küresel bir baştan oluşan ince dikenler. Dendritik omurga hacmi, onları kısmen tanımlamak için kullanılır; genellikle küçük ince dikenler (0.01 μm3 </sup&gt;) Mantar omurgalarına kıyasla (0.8 μm 3 ) 9 , 10 . Omurgalar olgunlaşma ile dengelenir. Örneğin, ince dikenler birkaç gün sonra geri çekilir veya mantar omurgalarına dönüşür. Alternatif olarak, mantar dikenleri nispeten kararlıdır ve uzun süre hayatta kalabilir. Nöronal bağlantıların kuvvetinin dikenlerin sayısına ve / veya hacmine 11 , 12 , 13 dayalı olduğu düşünülmektedir. Klasik Golgi boyama yöntemi ve daha modern varyasyonları, dendritik omurga morfolojisi ve yoğunluğunu incelemek için kullanışlıdır. Golgi boyamasının benzersiz bir özelliği, rasgele toplam nöronların% 5&#39;ini lekelediğidir, bu da bireysel nöronların izini sağlar 14,15. Golgi metasının tam mekanizması olsa daOd lekeleri bireysel nöronlar hala bilinmemektedir, yöntemin prensibi, gümüş kromat (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17&#39;nin kristalleşmesine dayanmaktadır. Golgi yönteminin üç ana türü vardır: hızlı Golgi, Golgi-Cox ve Golgi-Kopsch 18 , 19 . Her üç yöntem de birkaç gün ila aylarca krom tuzlarında ilk inkübasyon evresi ile başlar ancak aralarında bazı önemli farklar vardır. Hızlı Golgi, ilk aşamada osmiyum tetroksit kullanırken, Golgi-Kopsch paraformaldehid içerir. Hem hızlı Golgi hem de Golgi-Kopsch boyama sonrasında, yaklaşık% 7 oranında,% 1-2 gümüş nitrat solüsyonunda inkübe edilir. Golgi-Cox yöntemi gümüş nitrat yerine mercurik klorür ve potasyum dikromat kullanır ve 2-4 hafta süreyle emprenyasyon süresine sahiptir. Dokular daha sonra kesitlendirilir ve seyreltilmiş amonyakÇözeltiyi, ardından tuzları gidermek için bir fotoğrafik düzeltici uygulayın. Üç tipten Golgi-Cox yönteminin, kısmen arka plana müdahale etmeden dendritik aplikleri boyamakta en iyi olduğu düşünülmektedir, çünkü kısmen kristal yapılar doku yüzeyinde oluşmaz (hızlı Golgi yönteminde olduğu gibi) 17 , 20 , 21 . Mevcut yöntem, ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün hafif bir varyasyonudur ve nispeten düşük bir dozda 5-Fu&#39;nın dendritik morfolojik özellikleri ve omurganın yoğunluğunu nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır. Elde edilen veriler, kemoterapötik tedavinin nöronal devreleri nasıl etkilediği konusunda daha fazla bilgi sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>superGolgi Kit&amp;nbsp;</td><td>Bioenno Lifesciences</td><td>30100</td><td>&amp;nbsp;Contains hazardous materials.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 10x powder concentrate</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>Slide cover&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>7 mL Transfer pipette&amp;nbsp;</td><td>Globe Scientific&amp;nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Falcon tubes&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Foil&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>200 proof Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics&amp;nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>Hazardous.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Permabond 200</td><td>Permabond LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serological pipette</td><td>Sigma</td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Midsci</td><td>HS234526C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Male Mice&amp;nbsp;</td><td>The Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>Multiple components, see website for details.&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc Camera</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish , Green</td><td>Tissue-Tek</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish Set&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>Motorized Pipet Filler&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida&amp;nbsp;</td><td>mbf Bioscience&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer&amp;nbsp;</td><td>mbf Bioscience&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of hippocampal dendritic complexity in aged mice using the golgi-cox method

Dendritik dikenler, eksitatör sinapslar içeren nöronal dendritik millerin çıkıntılarıdır. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilir. Golgi boyama için çeşitli yaklaşımlar vardır, bunların hepsi dendritik alandların morfolojik özelliklerini belirlemek ve belirgin bir arka plan oluşturmak için kullanışlıdır. Mevcut Golgi-Cox yöntemi (ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün ufak bir varyasyonu), kemoterapötik ilaç olan 5-flurouracil&#39;in (5-Fu) nispeten düşük dozunun dendritik morfolojiyi nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır , Omurganın sayısı ve hipokampüs içindeki işlenmesi karmaşıklığı. 5-Fu, dendritik karmaşıklığı önemli derecede modüle etti ve bölgeye özel bir şekilde, hipokampustaki omurga yoğunluğunu azalttı. Sunulan veriler, Golgi boyama yönteminin efOlgun nöronları, CA1, CA3 ve hipokampus diş açısı (DG) lekelemiştir. Bu protokol, diğer araştırmacıların beyne dokuları yüksek kaliteli sonuçlar ve minimum sorun giderme ile güvenilir şekilde boyayabilmesi için her adımın ayrıntılarını bildirir.

5-Fu işleminin, Golgi ile boyanmış beyin bölümlerinin hipokampusundaki dendritik taşlama ve kompleksite üzerindeki etkileri, ticari olarak mevcut bir görüntüleme yazılımı kullanılarak nicelleştirildi ve izlendi. İzlemeden sonra, dendritik kabarcıklanma, omurga yoğunluğu ve omurga morfolojisi Sholl analizi ve dendritik karmaşıklık indeksi (DCI) kullanılarak analiz edildi. Sholl analizi, dendritik çember morfolojisini belirlemek için kullanılan nicel bir analitik yöntemdir25. Soma&#39;dan başlayarak, birbirinden 10 μm&#39;lik daireler dendritik izlerin üzerine bindirilir. Dendritlerin uzunluğu, dendritlerin geçtiği dairelerin sayısıyla belirlenir. Bir dendritik çemberin karmaşıklığını belirlemek için bir yöntem olan dal noktası analizi, dallanma noktalarının toplam sayısı ve sırasına dayanır. Bir dal noktası,Dal iki alt dalda bölünür. Şube emri, şubelerin kaç kez bölündüğüne bağlı olarak karmaşıklığın bir ölçüsüdür. Örneğin, bir birinci mertebeden dallanma noktası, soma uzanan orijinal dendrit olacaktır; ikinci mertebe bir dal noktası, dalın iki alt dala ayrıldığı nokta olacaktır. Hem dallanma noktalarını hem de dallanma düzenini inceleyerek dendritik arborun karmaşıklığı (dallanma noktalarının sayısına bağlı olarak) ve dallanmanın hangi noktalarda gerçekleştiği (daha küçük bir dallanma düzeni soma&#39;ya daha yakın olmakla birlikte, daha büyük bir dallanma düzeni Soma dışında) belirlenebilir. Bu parametreler DCI&#39;ya uygulandı. CA1 ve CA3 apikal ve bazal kısımlara ayrılmış ve bağımsız olarak 26 , 27 analiz edilmiştir. DG&#39;de CA1 ve CA3 piramidal nöron ve granül nöronlarının dendritleri analiz edildi. Tüm nöronlar,Her bir deney grubu aşağıdaki kriterleri karşılamıştır: 1) dendritlerin tüm uzunluğu boyunca karanlık ve tutarlı Golgi boyaması, 2) dendritler görülebilir şekilde incitmiştir ve 3) her nöron, analiz sırasında girişim önlemek için aralarında yeterli boşluk bırakmıştır 28 . Şekil 1 , yukarıdaki kriterleri yerine getiren bir nöron göstermektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edildi. Sahte ve 5-Fu grupları arasındaki istatistiksel farklılıkları saptamak için, eşleştirilmiş bir iki-kuyruklu t -testi kullanıldı. Tüm istatistiksel analizler analitik yazılım (bakınız tablo) kullanılarak yapıldı ve p &lt;0.5 anlamlı kabul edildi. 5-Fu tedavisinin ve Sholl yarıçapının etkilerini değerlendirmek için karışık faktör analizi (ANOVA) kullanıldı. Uygun olduğunda, Fisher LSD post-hoc testleri ANOVA sonrasında kullanıldı 29 . Her iki CA&#39;da<html> 1 ( t = 7.68, p &lt;0.01; Şekil 2A) ve CA3 ( t = 7.54, p &lt;0.01) Şekil 3 A ) apikal piramidal dendritlerde, 5-Fu tedavisini takiben omurgalarda belirgin bir azalma vardı. 5-Fu tedavisi, CA1&#39;in bazal omurga yoğunluğunu önemli ölçüde etkilemese de ( t = 1.79, p = 0.15; Şekil 2 B ), CA3 bazal piramidal dendritik omurgalarını önemli ölçüde azalttı ( t = 5.57, p &lt;0.05; Şekil 3 B ). Ayrıca, Fisher LSD post-hoc testleri, CA1 apikal piramidal dendritlerin 40-100 μm&#39;de (Fisher LSD, p &lt;0.001; Şekil 2 C ) ve 130-160 μm&#39;de (Fisher LSD, p &lt;0.05) dendritik arborizasyonunda azalma olduğunu ortaya koydu 0.05;Benzer şekilde, CA1 bazal apikal dendritlerde 30-60 μm&#39;de (Fisher&#39;s LSD, p &lt;0.001; Şekil 2 D ) ve 70-110&#39;da görülen benzer bir fenomen görüldü Μm (Fisher LSD, p &lt;0.05; Şekil 2 D ) uzaklaştırıldı 29 . CA3 apikal piramidal dendritleri ile ilgili olarak, 5-Fu tedavisini takiben segmental dendritik uzunlukta tuzla muamele edilen kontrollerle ( F (28,87) = 0.91; p = 0.59; Şekil 3 C ) karşılaştırıldığında anlamlı bir farklılık yoktu. Bununla birlikte, CA3 bazal piramidal dendritler için, segmental dendritik uzunlukta 5-Fu tedavisi ile salin ile kontrol edilen kontroller arasında belirgin bir fark vardı ( F (25, 78) =1.85; P &lt;0.05; Şekil 3 D ). Fisher LSD, 5-Fu muamelesinin 90-100 um ( p &lt;0.01; Şekil 3 D ), 70-80 um ve 110-120 um&#39;de dentritik arborizasyonu azalttığını ortaya koymuştur (Fisher LSD, p &lt;0.05; Şekil 3 D ) Soma&#39;dan uzak 29 . Dendritik karmaşıklığı belirlemek için, 5-Fu ile muamele edilen ve saline ile muamele edilen kontrol gruplarını karşılaştırmak için bir kol analizi yapılmıştır. Genel Müdürlük bünyesinde, şube analizi, her bir muamele ve şube sırası arasında anlamlı bir farklılık gösterdi ( F (8, 36) = 25.61, p &lt;0.001; Şekil 4 ). Bu, Fisher&#39;s LSD kullanılarak daha da analiz edildi; bu, 4. ve 6. aylarda uzunluğun azaldığını gösterdi5-Fu tedavisini takiben ( p &lt;0.001; Şekil 4 ) 29 . <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig1.jpg" /> Şekil 1 : Görüntüleme ve daha ileri analiz için kriterleri temsil eden Golgi lekeli nöron. Her üç omurga türü de Golgi boyamasını takiben kolayca görülebilir. Boyama, dendritin tüm uzunluğu boyunca tutarlıdır ve dendrit, diğer nöronlardan izole edilmiştir. Ölçek çubuğu, 5 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig2.jpg" /> Şekil 2 : Golgi lekeli n<html> Euronlar apikal CA1&#39;de 5-Fu ile tedavi edilen gruplar ile tuzlu su ile tedavi edilen gruplar arasında omurga yoğunluğunda önemli farklılıklar olduğunu gösterdi, ancak bazal CA1&#39;i değil. Hem apikal hem de bazal CA1&#39;de 5-Fu ile tedavi edilen gruplar ile tuzlu su ile tedavi edilen gruplar arasındaki omurga uzunluğunda önemli bir fark vardı. ( A ) CA1 apikal piramidal dendritlerde, 5-Fu omurga yoğunluğunu önemli ölçüde azalttı. ( B ) Bazal dendritlerde, omurganın genel yoğunluğunda önemli bir değişiklik yoktu. ( C ) Sholl analizi, 5-Fu tedavisinin CA1 apikal piramidal dendritlerdeki soma 40-100 μm ve 130-160 μm uzakta dendritik arborizasyonu önemli ölçüde azalttığını ortaya koymuştur. ( D ) Bazal dendritlerde, 5-Fu muamelesi soma ile 30-60 μm ve 70-110 um&#39;de dendritik arborizasyonu azalttı. Ortalama ± SEM (n = 6). * P &lt;0.05; ** p &lt;0.01, ANOVA 29 .= &quot;Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig3.jpg" /> Şekil 3 : Golgi lekeli nöronlar, hem apikal hem de bazal CA3&#39;te 5-Fu ile işleme tabi tutulmuş gruplar ile tuzlu su ile tedavi edilen gruplar arasındaki omurga yoğunluğunda önemli farklılıklar sergiledi. Apikal CA3&#39;te 5-Fu ile ve saline ile tedavi edilen gruplar arasında omurga uzunluğunda önemli bir fark vardı, ancak bazal CA3&#39;te değildi. ( A ) CA3 apikal piramidal dendritlerde, 5-Fu omurga yoğunluğunu önemli ölçüde azalttı. ( B ) Bazal dendritlerde, 5-Fu, omurganın genel yoğunluğunu önemli ölçüde azalttı. ( C ) CA 3 apikal bölgesinde 5-Fu tedavisinin anlamlı bir etkisi yoktu. ( D ) Bazal dendritlerde, 5-Fu treaSomatadan 70-120 μm uzakta dendritik arborazasyonu azalttı. Ortalama ± SEM (n = 6). *, P &lt;0.05; **, p &lt;0.01, ANOVA 29 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55696/55696fig4.jpg" /> Şekil 4 : DG içerisindeki Golgi boyalı nöronlar, 5-Fu tedavisinden sonra 4. ve 6. siralarda salinle muamele edilen gruba kıyasla azalmış uzunluk gösterdi. CA1 hipokampal bölgesinin piramidal nöronlarındaki dal sırası başına uzunluk. Ortalama ± SEM (n = 6). * P &lt;0.05; ** p &lt;0.01, ANOVA 29 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55696/55696fig4large.jpg" target="_blank">Savunma</a>Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method at JoVE.com

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

assessment-hippocampal-dendritic-complexity-aged-mice-using-golgi-cox

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K Görüntüleme.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar. 

Video: Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Nörobilim

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Golgi-Cox Boyama ile dendritik morfoloji ve sinaptik bağlantı üzerinde olumlu bir Erken Deneyimi, Tactile uyarılması Etkileri, görselleştirme

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Biyoloji

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Farelerde Hipokampal Bölgesi Dentate Gyrus dendritik arborization Değerlendirilmesi

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate new neurons, which integrate into an existing neural circuit and contribute to specific hippocampal functions. Importantly, adult neurogenesis is highly susceptible to environmental stimuli, which allows for activity-dependent regulation of various cognitive functions. A vast range of neural circuits from various brain regions orchestrates these complex cognitive functions. It is therefore important to understand how specific neural circuits regulate adult neurogenesis. Here, we describe a protocol to manipulate neural circuit activity using designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADDs) technology that regulates NSCs and newborn progeny in rodents. This comprehensive protocol includes stereotaxic injection of viral particles, chemogenetic stimulation of specific neural circuits, thymidine analog administration, tissue processing, immunofluorescence labeling, confocal imaging, and imaging analysis of various stages of neural precursor cells. This protocol provides detailed instructions on antigen retrieval techniques used to visualize NSCs and their progeny and describes a simple, yet effective way to modulate brain circuits using clozapine N-oxide (CNO) or CNO-containing drinking water and DREADDs-expressing viruses. The strength of this protocol lies in its adaptability to study a diverse range of neural circuits that influence adult neurogenesis derived from NSCs.

The goal of this protocol is to describe an approach for analyzing behavior of adult neural stem/progenitor cells in response to chemogenetic manipulation of a specific local neural circuit.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.