Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione pilota sotto NIH P20 GM109005 (ARA) e dal Centro per il Premio Programma IDeA P30 GM110702 per il Trasferimento Neuroscienze.

Gli esperimenti sono stati condotti secondo gli standard etici approvati dal comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali a UAMS. 1. Animali e 5 paradigmi di iniezione <ol><li> Acquistare i maschi di tipo maschio C57Bl6 / J di 6 mesi e di alloggiarli sotto un ciclo di luce / buio costante da 12 h fino a quando non raggiungono 1 anno di età. </li><li> Diluire la 5-Fu in soluzione salina sterile del 0.9%. Utilizzare 60 mg / kg come dose necessaria per mouse. </li><li> Dare le iniezioni intraperitoneali del 5-Fu (una volta alla settimana per tre settimane). <ol><li> Date le iniezioni intraperitoneali attorno allo stesso tempo ogni giorno. Ad esempio, tra 0900-1200 h. </li></ol></li><li> Eutanizzare gli animali e estrarre il cervello 30 giorni dopo l&#39;iniezione finale. </li></ol> 2. Procedura di eutanasia e estrazione del cervello <ol><li> Restringere il roditore e afferrare la base della coda. Con l&#39;altra mano, posizionare il pollice o il primo dito a thBase del collo del roditore. Rapidamente mettere pressione sul collo del roditore e spingere in avanti mentre l&#39;altra mano che tiene la coda tira indietro. </li><li> Tenere il roditore con una mano e le grandi forbici chirurgiche con l&#39;altra. Posizionare il collo del roditore tra le due lame e decapitare rapidamente la testa. </li><li> Prendi la testa del mouse tagliata e usa le forbici belle per tagliare la pelliccia sopra il cranio, fino agli occhi. Quindi posizionare le punte delle forbici in ciascuna presa d&#39;occhio e chiudere le forbici con una leggera forza. </li><li> Usare forbici a molla per tagliare il cranio a sinistra ea destra del cervelletto. </li><li> Usare la pinza per sollevare la parte del cranio che circonda il cervelletto direttamente e in su. </li><li> Utilizzate le forbici a molla per tagliare lungo la linea midsagittale del cranio. </li><li> Utilizzare la pinza per sollevare la parte rimanente del cranio dal cervello. </li><li> Utilizzare una spatola e una sonda per scavare il cervello nel contenitore desiderato. Utilizzando un inoxLa lama di teel, taglia ogni cervello lungo il piano midsagittale. Eseguire il seguente metodo Golgi-Cox sugli emisferi destro. </li></ol> 3. Golgi colorazione e preparazione dei tessuti <ol><li> Immergere i semi-cervelli appena raccolti in 5 ml di soluzione a base di cloruro di mercurio (soluzione A dal kit) in un tubo conico da 10 ml. La soluzione di cloruro di mercurio è sensibile alla luce; Coprire il tubo con la pellicola. Conservare il campione al buio a temperatura ambiente. NOTA: La soluzione A è fornita nel kit elencato nella tabella dei materiali. Attenzione! La soluzione A (chiamata anche soluzione di cloruro di mercurio) contiene reagenti tossici quali il bicromato di potassio, il cloruro di mercurio e il cromato di potassio. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio. </li><li> Dopo 1 giorno, decanta lentamente la soluzione in un contenitore temporaneo (ad esempio una grande imbarcazione pesata) e smaltire in un contenitore di rifiuti a rischio biologico. Immergere i cervelli (ancora nei tubi conici originali da 10 mL) con 5 ml diLa soluzione di cloruro di mercurio e restituisce il campione al buio a temperatura ambiente per altri 13 giorni. </li><li> Aggiungere 30 g di tampone post-impregnazione a 90 mL di acqua distillata o deionizzata (dH 2 O). Riempire ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 6,5 ml del tampone post-impregnazione, un pozzetto per cervello NOTA: Il buffer di post impregnazione è fornito nel kit elencato nella tabella dei materiali. <ol><li> Dopo 14 giorni (in totale) nella soluzione di cloruro di mercurio, sciacquare il tessuto con dH 2 O, quindi trasferirli in piatti a 6 pozzetti con tampone post-impregnazione. Coprire le lastre con la pellicola e conservarle a temperatura ambiente al buio. </li></ol></li><li> Pipettare il tampone post-impregnazione dopo 1 giorno di immersione e rinnovare con il tampone di impregnazione fresco; Memorizzare per 1 giorno al buio a temperatura ambiente. Se necessario, conservare questo a 4 ° C per un massimo di 1 mese 22 . </li></ol> 4. Sezione <ol><li> Etichettare i piatti a 12 pozzetti sui loro coperchi con i numeri in ordine crescente da sinistra a destra e verso l&#39;alto. </li><li> Preparare due o tre piatti da 12 pozzetti per cervello se si taglia l&#39;intero cervello. <ol><li> Etichettare la parte superiore di ogni coperchio della piastra a 12 pozzetti con il numero di identificazione del cervello tagliato. </li><li> Pipettare 2 ml di 1x PBS in ogni pozzetto di ogni piastra. </li></ol></li><li> Impostare il palco e accendere il vibratome; Assicurarsi che nel contenitore sia sufficiente 1x PBS per coprire il tessuto. <ol><li> Tagliare due pezzi di paraffina in plastica e piegarli per due volte. Posizionarli sopra i fori per le manopole del supporto del campione per impedire che 1x PBS cada sul contatore. </li><li> Mettere il nastro giù sul blocco di tessuto del supporto del campione e quindi mettere su di esso la colla adesiva di cianoacrilato (vedere tabella dei materiali). </li></ol></li><li> Rimuovere il cervello dalla piastra a 6 pozzetti e metterlo su un piatto di plastica o vetro. Usare l&#39;inossidabileLama in acciaio a doppio taglio per tagliare circa la metà del cervelletto. <ol><li> Tagliare il cervelletto caudalmente. Assicurarsi che la porzione del cervelletto rimanente sia pari. </li></ol></li><li> Immediatamente collocare la superficie piana del cervelletto rimanente sulla colla. NOTA: La parte dorsale del tessuto (la corteccia cerebrale) deve essere rivolta a sinistra oa destra rispetto alla lama. L&#39;estremità rostrale che precedentemente conteneva la lampadina olfattiva attaccata doveva essere rivolta verso l&#39;alto. <ol><li> Attendere almeno alcuni minuti per assicurarsi che la colla asciughi completamente. </li></ol></li><li> Mentre la colla che tiene il cervello in posizione sta essendo asciugata, versare 1x PBS nel bagno di campione. Dopo che la colla è asciutta, posizionare il supporto del campione con il tessuto nel bagno del campione. <ol><li> Se il campione di tessuto non è completamente coperto, versare più 1x PBS nella vasca del campione. </li></ol></li><li> Fissare la lama sul supporto della lama del vibratome e lentamente lTirare la lama nella vasca del campione finché non sia completamente sommersa in 1x PBS. Continuare a abbassare la lama fino a leggermente sotto la parte superiore del tessuto. </li><li> Impostare la velocità del vibratore a 7, l&#39;ampiezza a 6 e l&#39;angolo di taglio a 12 ° (vedere tabella dei materiali per il modello vibratome). Avviare la vibrazione e tagliare le sezioni da 200 μm 23 . <ol><li> Utilizzare un grande pennello per spostare le sezioni del tessuto dalla vasca del campione in ciascun pozzo designato delle piastre a 12 pozzetti. </li></ol></li><li> Continuare a tagliare il tessuto fino a raggiungere il numero desiderato di sezioni del tessuto. </li></ol> 5. Post-colorazione <ol><li> Per ciascuna delle seguenti fasi di verniciatura e risciacqui, utilizzare 2 ml della soluzione indicata per pozzetto. Utilizzare un riempitivo a pipetta motorizzato (vedere tabella dei materiali) per trasferire le soluzioni nei pozzetti. Utilizzare una pipetta di trasferimento (vedere tabella dei materiali) per trasferire soluzioni dai pozzetti e nei rifiuti appropriaticontenitori. </li><li> Sciacquare le sezioni in un lavaggio di 30 minuti di 0.01 M PBS-T (aggiungere 3,0 ml di detergente (vedere tabella dei materiali) a 1000 ml di PBS da 0,01 M). </li><li> Diluire la soluzione di idrossido di ammonio (Caution) 3: 5 in volume con dH 2 O immediatamente prima dell&#39;uso. Macchiare le sezioni nella soluzione diluita di idrossido di ammonio per 19-21 min. <ol><li> Proteggere la soluzione idrossido di ammonio sensibile alla luce con la pellicola. NOTA: L&#39;idrossido di ammonio all&#39;interno della soluzione ha una concentrazione di ~ 10% ed è classificato come &quot;pericoloso&quot;. La soluzione di idrossido di ammonio può produrre ustioni se contatto con la pelle. Può causare irritazione delle vie respiratorie se inalato. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio. </li></ol></li><li> Macchiare le sezioni nel tampone post-colorazione (aggiungere 90 g di reagente D in 500 mL dH 2 O) per 19-21 min. Il tampone post-colorazione è sensibile alla luce; Proteggerlo con la lamina 22 . </li><li> Sciacquare le sezioni in tre, Lavaggi da 5-10 min di 0.01 M PBS-T. </li></ol> 6. Montaggio, pulizia e copertura <ol><li> Montare le sezioni su slitte rivestite con gelatina al 1% con il grande pennello. Lasciare asciugare per 20-30 minuti a temperatura ambiente e poi metterli in un vaso di Coplin durante la notte. </li><li> Rimuovere le diapositive con le mani guantate dal vaso Coplin e posizionarle in un rack di plastica (vedere tabella dei materiali). Posizionare il rack di plastica nel piatto di colorazione (vedere tabella dei materiali) contenente 100% etanolo. Deidirli con tre lavaggi da 5 minuti. </li><li> Lavare le diapositive due volte per 5 min ciascuna nel 99% di xilene. Posizionare le diapositive in un rack di vetro e abbassare il rack in un piatto di vernice di vetro contenente xilene con una maniglia in metallo (vedere tabella dei materiali). NOTA: Attenzione, Xylene è dannoso se inalato e provoca irritazione se tocca la pelle. È altamente infiammabile negli stati liquidi e vapori. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio. </li><li> Rimuovere le diapositive dal xilUno alla volta e coprire rapidamente il tessuto con ~ 0,25 ml di supporti di montaggio (vedi tabella dei materiali). Quindi, prendete le copertine e posate sui supporti. <ol><li> Spingere le bolle d&#39;aria intrappolate sotto le coperture dello scivolo sul bordo con un oggetto sfocato, come la fine di un pennello. </li></ol></li><li> Posizionare le diapositive in un&#39;area lontana dalla luce del sole e lasciarle asciugare per 2-3 giorni. </li><li> Procedere all&#39;acquisizione di immagini usando un microscopio e analizzando con il software appropriato. </li></ol> 7. Acquisire Image Stack <ol><li> Aprire il programma di imaging (vedere Tabella materiali ). Posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio. Nel menu nella parte superiore del programma, fai clic su &quot;Acquisizione&quot; e fai clic su &quot;Immagine in diretta&quot;. </li><li> Impostare il microscopio a 10 volte. Individuare il neurone di preferenza e portare il cursore, che appare come un X rosso, sul centro del soma. Fare clic con il tasto sinistro per impostare il punto di riferimento. </li><li> Impostare il microscopio a 40X. Fai clic su &quot;Sposta&quot; dal menu nella parte superiore del programma e fai clic su &quot;A punto di riferimento&quot;. </li><li> Inizia la creazione dello stack di immagini scorrendo manualmente con il fine obiettivo sopra il tessuto finché non è leggermente fuori fuoco. <ol><li> Fai clic su &quot;Set Top&quot; nell&#39;angolo in basso a destra del programma sotto la voce &quot;Acquisizione immagine&quot;. </li><li> Scorrere leggermente sotto il tessuto finché non è leggermente fuori fuoco e quindi fare clic su &quot;Set Bottom&quot; in &quot;Acquisizione immagine&quot;. Avanti, fai clic su &quot;Acquisisci Stack di immagini&quot;. </li></ol></li><li> Dopo aver acquisito lo stack di immagini, digitare il nome desiderato per il file immagine nella finestra visualizzata. Salva come &quot;file MBF Ascii&quot;. <ol><li> Quando richiesto, selezionare il tipo di file come &quot;file stack MBF JPEG2000&quot; e quindi fare clic su &quot;Salva&quot;. </li></ol></li></ol> 8. Tracciamento neuronale <ol><li> Nella toolbaR sotto il menu, fai clic sulla casella con il titolo &quot;Contour Name&quot;. Seleziona &quot;Soma&quot; dal menu a discesa. </li><li> Traccia manualmente il soma. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare &quot;Finish Cell Body&quot; quando il tracciamento è completo. </li><li> Selezionare &quot;AutoNeuron&quot; per visualizzare un&#39;altra scheda intitolata &quot;WorkNeuron Workflow&quot;. </li><li> In &quot;Tipo di configurazione&quot;, selezionare &quot;Nuovo&quot;. Impostare i parametri e fare clic su &quot;Next Step&quot; per visualizzare la sottovoce &quot;Soma Detection&quot;. <ol><li> Per impostare i parametri, selezionare &quot;Brightfield&quot;. Quindi, sotto &quot;Max Process Diameter&quot;, fai clic su &quot;Start Measuring&quot;. Usando il cursore, andare alla base del dendrite e impostare manualmente il diametro. </li></ol></li><li> Fare clic su &quot;Sì&quot; nella finestra che richiede all&#39;utente di tracciare l&#39;intera immagine. Traccia manualmente il soma. Disattiva e fai clic su &quot;Passo successivo&quot; per visualizzare la sottovoce &quot;Posizionamento semi&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Validate Seed&quot;S &quot;e quindi fare clic su&quot; Next Step &quot;per visualizzare la sottotitola&quot; Neuron Reconstruction &quot;. </li><li> In &quot;Neuron&quot;, fai clic su &quot;Interattivo&quot;. Eseguire tracciamenti interattivi seguendo la direzione del programma dei dendriti e fare clic con il pulsante destro del mouse per completare l&#39;area evidenziata tracciata dal programma. Dopo aver tracciato tutti i dendriti, fai clic su &quot;Next Step&quot;. </li><li> Dopo aver visualizzato una nuova finestra, salvare la nuova configurazione con un titolo desiderato. Fai clic su &quot;Salva&quot;. </li></ol> 9. Analisi <ol><li> Aprire il programma di analisi (vedere la tabella dei materiali). </li><li> Fai clic su &quot;File&quot; dal menu superiore e fai clic su &quot;Apri file di dati&quot;. Seleziona il file di interesse. </li><li> Sotto la sottovoce analisi, selezionare &quot;Analisi Sholl&quot;. </li><li> Nella finestra &quot;Analisi Sholl&quot;, impostare il raggio di inizio a 10 μm. In &quot;Analisi&quot;, fai clic sulle caselle &quot;Dendrites&quot; e &quot;Ordini dei rami&quot;. </li><li> Diritto clScattare le finestre aperte e fare clic su &quot;Excel Export&quot;. Fai clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Nell&#39;ambito dell&#39;analisi, fare clic su &quot;Analisi struttura strutturata&quot;. Selezionare &quot;Tutte le analisi possibili&quot;. </li><li> Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di recente apertura e fare clic su &quot;Esportazione di Excel&quot; 24 . </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+tree+and+brain+disorders.">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Rispetto alle tecniche più moderne, il metodo Golgi-Cox presenta diversi vantaggi che lo rendono il metodo preferito per esaminare la morfologia della colonna vertebrale: 1) la colorazione può essere utilizzata per qualsiasi tessuto, 2) una messa a punto di microscopi di base è tutto ciò che serve a Acquisire immagini basate su Golgi, 3) l&#39;imaging Golgi-Cox è più veloce di un&#39;immagine confocale e 4) le sezioni macchiate di Golgi sono vitali per diversi mesi a anni più a lungo dei campioni che sono etichet...

<html> I dendriti sono la parte più grande dei neuroni che ricevono e trattano l&#39;input presinaptico 1 . I loro processi dendritici hanno una geometria complessa, in cui i rami prossimi hanno un diametro maggiore rispetto ai rami distali. Come sviluppano i dendriti, formano diversi collegamenti con altri neuroni in un processo denominato arborizzazione dendritica. L&#39;estensione e il modello di questa ramificazione determina la quantità di input sinaptici che un dendrite può elaborare adeguatamente 2 . L&#39;arborizzazione dendritica è un processo necessario per la plasticità dipendente dall&#39;attività e lo sviluppo appropriato dei circuiti neuronali. L&#39;estensione, la retrazione, la ramificazione e la sinaptogenesis sono processi intricati che includono programmi genetici intrinseci e influenze da fattori estrinseci. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all&#39;interno dell&#39;ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoriaF &quot;&gt; 3 , 4. Le alterazioni della complessità dendritica sono associate a alterazioni fisiopatologiche e comportamentali 5. Le anomalie sono legate a diversi stati malattie, tra cui la sindrome del X fragile e la sindrome di Down 6 . Le spine dendritiche sono gli scompartimenti subcellulari specializzati degli archi dendritici che ricevono entità eccitatorie all&#39;interno del sistema nervoso centrale. Ci sono tre classi morfologiche di spine dendritiche, con il nome di ciascuna classe basata sulla loro dimensione e forma: 1) spine di funghi, che hanno densità postinaptica complesse con più recettori di glutammato rispetto alle altre spine 7 ; 2) spine stubby, che non hanno uno stelo; E 3) spine sottili, che sono costituite da uno stelo protratto e stretto e da una testa a globo 8 . Il volume della spina dendritica viene utilizzato in parte per definirli, con spine sottili generalmente più piccole (0.01 μm 3 </sup&gt;) Rispetto alle spine di funghi (0,8 μm 3 ) 9 , 10 . Le spine si stabilizzano con la maturazione. Ad esempio, le spine sottili ritirarsi dopo pochi giorni o svilupparsi in spine fungine. In alternativa, le spine del fungo sono relativamente stabili e possono sopravvivere per un lungo periodo di tempo. La forza delle connessioni neuronali si basa sul numero di spine e / o sul loro volume 11 , 12 , 13 . Il classico metodo di colorazione Golgi e le sue variazioni più moderne sono state utili per esaminare la morfologia e la densità della spina dendritica. Un aspetto unico della colorazione Golgi è che macchia casualmente circa il 5% dei neuroni totali, che permette la traccia dei singoli neuroni 14 , 15 . Anche se l&#39;esatto meccanismo in cui il metodo GolgiOd di macchie di singoli neuroni è ancora sconosciuto, il principio del metodo è basato sulla cristallizzazione del cromato d&#39;argento (Ag 2 CrO 4 ) 16 , 17 . Ci sono tre tipi principali del metodo Golgi: il Golgi rapido, il Golgi-Cox e il Golgi-Kopsch 18 , 19 . Tutti e tre i metodi iniziano con una fase iniziale di incubazione nei sali di cromo per diversi giorni a mesi, ma esistono alcune differenze fondamentali tra loro. Il rapido Golgi usa il tetroxido di osmium nel primo passaggio, mentre il Golgi-Kopsch include la paraformaldeide. La colorazione sia nel rapido Golgi che nel Golgi-Kopsch è seguita da un&#39;incubazione in soluzione nitrato d&#39;argento 1-2% per circa 7 giorni. Il metodo Golgi-Cox utilizza il cloruro di mercurio e il bicromato di potassio anziché il nitrato d&#39;argento e ha un tempo di impregnazione di 2-4 settimane. I tessuti vengono quindi sezionati e posizionati rapidamente in una ammoniaca diluitaSoluzione, seguita da un fissatore fotografico per rimuovere sali. Tra i tre tipi, il metodo Golgi-Cox è considerato il più adatto alla colorazione degli archi dendritici senza molte interferenze di fondo, in parte perché gli artefatti cristallini non si verificano sulla superficie del tessuto (a differenza del metodo rapido Golgi) 17 , 20 , 21 . Il metodo presente è una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione commerciale Golgi ed è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del 5-Fu influenzerebbe le caratteristiche morfologiche dendritiche e la densità della colonna vertebrale. Tutti i dati acquisiti potrebbero fornire ulteriori informazioni sul modo in cui il trattamento chemioterapico influenza la circuiteria neuronale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">superGolgi Kit&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Bioenno Lifesciences</td>
			<td style="width:119px;">30100</td>
			<td style="width:216px;">&#160;Contains hazardous materials.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10X powder concentrate</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Permount&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SP 15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slide cover&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12-546-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7mL Transfer pipette&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Globe Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 mL Falcon tubes&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Foil&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">01-213-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-well plate&#160;</td>
			<td style="width:207px;">BD Biosciences&#160;</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200 proof Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Pharmco-AAPER</td>
			<td style="width:119px;">111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Acros Organics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">1330-20-7</td>
			<td>Hazardous.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Permabond 200</td>
			<td style="width:207px;">Permabond LLC</td>
			<td style="width:119px;">GF2492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25 mL serological pipette</td>
			<td style="width:207px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">SIAL1489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:207px;">Midsci</td>
			<td style="width:119px;">HS234526C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vibratome&#160;</td>
			<td style="width:207px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">NVSLM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57Bl/6 Male Mice&#160;</td>
			<td style="width:207px;">The Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Axio Imager 2</td>
			<td style="width:207px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">Multiple components, see website for details.&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AxioCam MRc Camera</td>
			<td style="width:207px;">ZEISS</td>
			<td style="width:119px;">426508-9902-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish , Green</td>
			<td style="width:207px;">Tissue-Tek</td>
			<td>62541-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish Set&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>70312-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Motorized Pipet Filler&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">03-692-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurolucida&#160;</td>
			<td style="width:207px;">mbf Bioscience&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurolucida Explorer&#160;</td>
			<td style="width:207px;">mbf Bioscience&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prism&#160;</td>
			<td style="width:207px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of hippocampal dendritic complexity in aged mice using the golgi-cox method

Le spline dendritiche sono le protuberanze degli alberi dendritici neuronali che contengono sinapsi eccitatoriali. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all&#39;interno dell&#39;ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoria. Ci sono diversi approcci alla colorazione Golgi, tutti utili per determinare le caratteristiche morfologiche degli archi dendritici e produrre uno sfondo chiaro. L&#39;attuale metodo Golgi-Cox, (una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione Golgi commerciale), è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del farmaco chemioterapico 5-flurouracil (5-Fu) avrebbe influenzato la morfologia dendritica , Il numero di spine e la complessità dell&#39;arborizzazione all&#39;interno dell&#39;ippocampo. Il 5-Fu ha significativamente modulato la complessità dendritica e ha ridotto la densità della colonna vertebrale in tutto l&#39;ippocampo in un modo specifico della regione. I dati presentati mostrano che il metodo di colorazione Golgi efHa colorato esattamente i neuroni maturi nel CA1, nel CA3 e nel dentato gyrus (DG) dell&#39;ippocampo. Questo protocollo riporta i dettagli di ogni passaggio in modo che altri ricercatori possano affidare affidabilmente il tessuto in tutto il cervello con risultati di alta qualità e minima risoluzione dei problemi.

Gli effetti del trattamento 5-Fu sull&#39;arborizzazione e la complessità dendritica nell&#39;ippocampo delle sezioni cerebrali macchiate da Golgi sono state quantificate e tracciate utilizzando un software di imaging disponibile in commercio. Dopo la tracciatura, l&#39;arborizzazione dendritica, la densità della colonna vertebrale e la morfologia della spina sono state analizzate usando l&#39;analisi di Sholl e l&#39;indice di complessità dendritica (DCI). L&#39;analisi di Sholl è u...

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Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell&#39;ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K Views.  University of Arkansas for Medical Sciences.  Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi. 

Video: Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Valutazione del bilanciamento del motore e di coordinamento nei topi utilizzando la Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Ricerca

Neuroscienze

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Visualizzare gli effetti di una prima esperienza positiva, tattile stimolazione, su dendritiche Morfologia e Synaptic connettività con Golgi-Cox colorazione

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Assessment of Vascular rigenerazione nel SNC Utilizzo del Retina mouse

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...