Bu protokol, Wolbachia ve konakçısı arasındaki etkileşimi anlamanın temeli olan hücrelerde Wolbachia'nın varlığını doğrulamaya yardımcı olur. Bu protokolde, hücre içi Wolbachia enfeksiyonunu başarılı bir şekilde tespit etmek için dört yöntem kullanıldı ve bu da hücrelerin Wolbachia enfeksiyonunun tespit doğruluğunu doğruladı ve geliştirdi. Prosedürü gösteren, Modern Patojen Biyolojisi ve Özellikleri Anahtar Laboratuvarı'ndan mezun olan Qiuqiu Xiao olacak.
Işık mikroskobu kullanarak lekesiz Aa23 ve Aa23-T hücrelerini 100x büyütmede gözlemleyerek başlayın. Şişe başına% 70 ila% 80 birleşmeye ulaşmak için hücreleri beş ila yedi gün boyunca kültürleyin. Bir pipet kullanarak, kültür ortamının 1 mL'sini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Hücreleri toplamak için beş dakika boyunca 100 RCF'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve elde edilen hücre peletini eksi 20 santigrat derecede saklayın. Şişe başına% 90 ila% 100 birleşmeye ulaşmak için hücreleri beş ila yedi gün boyunca kültürleyin.
Peletleri 0.40 mL PBS'de yeniden askıya alın ve bu çözeltinin 50 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Beş mikrolitre 20 mg / mL proteinaz K ekleyin ve bir saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra ham DNA'yı elde etmek ve eksi 20 santigrat derecede saklamak için tüpleri 15 dakika boyunca 99 santigrat derecede inkübe edin.
PCR'yi gerçekleştirmek için, 20 mikrolitrelik toplam reaksiyon karışımı hazırlayın ve PCR koşullarını metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın. Bir jel görüntüleyici kullanarak% 1'lik bir agaroz jeli üzerindeki DNA'yı tespit edin. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde TB Green kullanarak kantitatif PCR amplifikasyonu gerçekleştirin ve her reaksiyonun sonuçlarını kaydedin.
DNA'yı toplam 20 mikrolitrelik bir reaksiyon hacminde analiz edin ve metin makalesinde açıklandığı gibi kantitatif PCR koşullarını ayarlayın. Hücrelerdeki WSP ve RPS6 gen kopya sayılarını belirlenen standart eğriye göre hesaplayın. Ardından Wolbachia bağıl yoğunluğunu wsp/RPS6 kopya numarasına göre hesaplayın.
Bağımsız bir örnek t-testi kullanarak verileri analiz edin. Hücre peletine 200 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Lisatları 12.000 RCF'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin.
Süpernatantın wsp konsantrasyonunu, üreticinin talimatlarını izleyerek bir BCA protein tahlil kiti kullanarak analiz edin. % 15'lik bir SDS-PAGE jel üzerine eşit miktarda protein yükleyin. Proteini nitroselüloz membranlara aktarın ve membranları oda sıcaklığında iki saat boyunca% 5 yağsız süt ile bloke edin.
Daha sonra membranları TBST ile üç kez yıkayın. Membranları, primer antikorun% 5 yağsız sütle seyrelterek hazırlanan 100 mikrolitre anti-wsp poliklonal antikor ile 4 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Birincil antikoru TBST ile üç kez yıkayın.
Membranlara 100 mikrolitre yaban turpu peroksidaz konjuge sekonjuge sekonder antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Membranları TBST ile üç kez yıkayın ve kemilüminesans tespit kitinde 20 mikrolitre A çözeltisi ve 20 mikrolitre B çözeltisini bire bir oranında karıştırın. Tüm membranı aynı anda lüminesans çözeltisine daldırın ve çok işlevli bir görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri gözlemleyin.
Bir Lazer konfokal Petri kabında, Aa23 ve Aa23-T hücrelerini% 5 atmosferik karbondioksit altında 28 santigrat derecede üç ila dört gün boyunca inkübe edin. Hücre% 60 ila% 70 kavuşuma ulaştığında, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca% 4'lük bir paraformaldehit mL'sinde sabitleyin.
Sabit hücreleri PBST kullanarak beş dakika boyunca yıkayın ve hücreleri PBS ile iki kez tekrar yıkayın. Petri kabını, 37 santigrat derecede bir saat boyunca% 3 sığır serum albümininin bir mL'sinde inkübe edin. Slaytlara 100 mikrolitre fare anti-wsp poliklonal antikoru ve fare serumu ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede ıslak bir kutuda inkübe edin.
Petri kabını ıslak kutudan çıkarın ve oda sıcaklığına getirin. PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'yi çıkarın. Aşağıdaki prosedürleri ışıktan koruyun.
Petri kabını, 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede 100 mikrolitre Alexa Fluor 488 konjuge keçi anti-fare antikoru ile inkübe edin. Örnek Petri kabını, PBS'de seyreltilmiş 50 mikrolitre DAPI ile beş dakika boyunca 37 santigrat derecede 10 mikrogram / mL'ye kadar inkübe edin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın. İmmünoboyamayı konfokal mikroskop altında gözlemleyin.
Wolbachia'yı tespit etmeden önce, iki hücre hattı arasındaki morfolojik farklılıkları belirlemek için Aa23 ve Aa23-T hücreleri bir ışık mikroskobu altında gözlendi. Aa23 ve AA23-T hücreleri en az iki hücre morfolojisine sahipti, ancak iki hücre tipi arasında belirgin bir morfolojik farklılık gözlenmedi. Tanısal primerler 81F / 691R kullanılarak, Wolbachia wsp geninin pozitif amplifikasyonu Aa23 hücrelerinde tespit edildi, ancak Aa23-T hücrelerinde tespit edilmedi.
Hücre hatlarındaki Wolbachia yoğunluğunun analizi, Aa23 hücrelerinde 2.4'lük bir wsp / rps6 oranı gösterdi, ancak Aa23-T hücrelerinde Wolbachia yoktu. Protein ekstraktlarının Western blot analizi, Aa23 için güçlü bir wsp sinyali gösterdi, ancak Aa23-T için sinyal tespit edilmedi. Dolaylı immünofloresan testi, Aa23 hücrelerinde wsp proteinini tespit ederken, Aa23-T hücrelerinde sadece DAPI boyalı DNA tespit edildi.
Kültür şişelerinin beş ila yedi gün boyunca% 5 atmosferik karbondioksit altında 28 santigrat derecede inkübe edildiğinden emin olun. Bu prosedürü, numune hazırlama ve kesitlemeye özellikle dikkat edilmesi gereken elektron mikroskobu takip edebilir. Bu çalışmada kullanılan dört deneysel yöntem, Wolbachia enfeksiyonunun hücrelerdeki tespit doğruluğunu doğruladı ve bu da diğer hücre ve doku tipleri için de geçerli.
