Laboratuvarımız, gelişim ve fizyolojik homeostaz sırasında mitokondriyal işlevi düzenleyen genleri ve yolları tanımlamak ve karakterize etmek için Drosophila melanogaster kullanır. Burada sunulan protokolde, oksidatif hasarın erişkin Drosophila yumurtalığındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki etkilerini görselleştirmek için hidrojen peroksit ilavesi ile canlı görüntüleme sunulmuştur. Mutasyonların kadın mikrop hücrelerinde normal mitokondriyal lokalizasyonu ve hareketi nasıl değiştirdiğini incelemek için sık sık görüntüleme protokollerini kullanırız.
Çalışmalarımız boyunca diseksiyon veya diğer hücre stresörleri tarafından ortaya konan stresin mitokondriyal lokalizasyon üzerinde derin bir etkisi olduğunu gördük. Deneysel tedavinin aksine, genel stresin, hücre altı yapıların lokalizasyonu veya davranışındaki herhangi bir değişikliğin nedeni olup olmadığını belirlemek için bir kontrol olarak. Hidrojen peroksit kullanarak kontrol stresünü tanıtmak için bu protokolü geliştirdik.
Bu videoda hidrojen peroksitin neden olduğu oksidatif hasarın mitokondri ve ribonükleoprotein Clu'nun dağılımını nasıl değiştirdiğini göstereceğiz. Bu canlı görüntüleme tekniği için en uygun medya, Schneider'ın Drosophila medyasını içeriyordu ve bundan sonra Schneider'ın medyası olarak adlandırılan mikroliter sığır insülini başına% 15 ısı inaktive fetal sığır serumu, 0.6 X Pen-Strep ve 200 mikrogram içeriyordu. Ortam hazırlamanın steril koşullarda yapılması kirlenmemesini sağlayacaktır.
İçeriği iyice karıştırın ve dört derecede gece boyunca saklayın. İnsülin Schneider'ın tam medyasında tamamen çözülmez ve tüpün altına bir çökeltinin yerleştiğini fark edeceksiniz. Görüntülemeyi engelleyeceğinden bu çökeltmeyi bıraktığından emin olarak aliquot yapın.
Bu çözelti, dört derecede aliquotlarda saklanırsa bir ay boyunca kullanılabilir. Optimal dişi mikrop hücresi görüntüleme için, önce fıstık ezmesi kıvamı olan bir dab ıslak maya macunu içeren bir şişe hazırlayın. Bu, kadınların iyi beslenmesini sağlar ve görüntüleme için tüm folikül gelişim aşamalarını üretecektir.
En sağlıklı sinekler için, sıfır ila bir günlük dişileri toplayın ve erkeklerle birlikte ıslak maya macunu içeren bir sinek gıda şişesine aktarın. Uyuyan sineklerin maya ezmesine yapışabilecekleri için temas etmediklerine emin olun. Sinekleri üç ila yedi gün besleyin, maya ezmesini günlük olarak değiştirin.
Maya ezmesinin sinek yiyeceğini temas ettirdiğinden emin olun, böylece kurumaz. Oksidatif hasara neden olmak için% 30 hidrojen peroksit stok çözeltisi kullanacağız ve mitokondrileri görselleştirmek için 100 milimolar TMRE stok çözeltisi kullanacağız. Ortam çözümlerini taze hazırlamak önemlidir, çünkü hidrojen peroksit oksidasyona karşı hassastır ve TMRE zamanla bozulur.
Diseksiyondan hemen önce, Schneider'in medyasında, iki mikromoler hidrojen peroksit, 46 nanomoler TMRE'lik taze bir aliquot ve 46 nanomoler TMRE'lik taze bir aliquot artı iki mikromoler hidrojen peroksit hazırlayın. Yumurtalık diseksiyonu için iki çift ince forsepse ve bir çift elektrolitik olarak keskinleştirilmiş tungsten iğneye ihtiyacınız olacak. Yumurtalıkları parçalamak için bir saat camını oda sıcaklığına ısıtılmış schneider'in tam ortamıyla doldurun, ardından tokmak kullanarak medyaya tek bir sinek yerleştirin.
Bir çift ince yabanarı kullanarak sineği toraksla hafifçe kavrayın. Diğer kümeslerle, arkayı kavrayın ve yumurtalıkları çıkarmak için hafifçe çekin. Herhangi bir yabancı manikül veya dokuyu çıkarın, ardından yumurtalığı taze ortam içeren yeni bir kuyuya aktarın.
Yumurtalıklar hala çevredeki kas kılımından hareket ediyor olmalıdır. Keskinleştirilmiş tungsten iğnelerini kullanarak, çevredeki kas kılımını çıkarmaya özen ederek yumurtalıkları hafifçe parçalayın. Kas kılıma çıkarılmazsa, burada gösterildiği gibi, yumurtalık seğirir ve görüntü alımında sorunlara neden olur.
Yumurtalıklar temiz bir şekilde parçalandıktan sonra, endojen olarak etiketlenmiş yapıları görselleştiriyorsanız, 100 mikroliterlik bir medya damlasında mattek kabına aktarın. TMRE ile etiketlenmiş mitokondrileri görselleştiriyorsanız, 100 mikroliterlik bir TMRE medya damlasındaki yumurtalıkları matTek kabına aktarın. Yumurtalıklar damlacıkların dibine batar.
Dokuyu mümkün olduğunca çabuk görüntülemeye başlamak için diseksiyon uygulamak önemlidir. Yumurtalıklar monte edildikten sonra, yemeği ters mikroskop üzerine yerleştirin ve ön işlem koşullarının bir kaydı olarak durağan görüntüler veya kısa videolar elde edin. Bu yapıldıktan sonra, canlı görüntülemeyi duraklatın, kapağı çıkarın ve hazırlanan iki mikromoler hidrojen peroksitin 100 mikrolitresini dikkatlice ekleyin.
Altta kalan yumurtalıkları yerinden etmemek için mevcut ortam damlacıklarının yüzeyini kırmaktan veya çözeltiyi çok hızlı eklemekten kaçının. Bulaşık kapağını değiştirin, istediğiniz yumurtayı yeniden yerleştirin ve odaklayın ve görüntülemeye devam edin. Deneysel tedavi zamana duyarlı olduğu için görüntülemeye mümkün olduğunca çabuk devam etmeye özen gösterir.
Burada gösterilen, hidrojen sonrası peroksit tedavisi çekilen bir filmden hareketsiz görüntüler. Mitokondri ve dişi mikrop hücreleri, sinekler iyi beslendiğinde ve sağlıklı olduğunda sitoplazma boyunca dağılır. Hidrojen peroksit ilavesi sonrası, oksidatif hasar mitokondrilerin topaklanarak tedaviden 10 dakika sonra görülebilmesine neden olur.
20 dakika sonra, hasar mitokondriyal membran potansiyelinin dağılmasına neden olur. Böylece, mitokondrilerin çoğunluğu kaybolur. Sürecin bu canlı filminde, mitokondri hızla topaklanabilir ve mitokondrilerin çoğunluğu nihayetinde kaybolur.
Sitoplazmada, özellikle çevredeki folikül hücrelerinde yanıp sönen titreşim, TMRE ilavesinin karakteristiği olarak ortaya çıkar. Daha önce de belirtildiği gibi, görüntüleme hidrojen peroksit ilavesinden sonra hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Burada gösterildiği gibi, çok fazla zaman geçmesi durumunda, mitokondriyal membran potansiyeli zaten kaybolur ve TMRE etiketlemesi dağılır ve verileri yorumlanamaz hale getirir.
Bu video durağan görüntülerde, GFP endojen olarak etiketlenmiş Clu parçacıkları, iyi beslenen kadınların germplazmında sağlam ve bol miktarda bulunur. Hidrojen peroksit ilavesi sonrası, Clu parçacıkları 10 dakika içinde dağılır. Bu, eşlik eden videoda gösterilmiştir.
Hidrojen peroksit ilavesi sonrası, Clu mutluluk parçacıkları hızla dağılır. Bu protokolü, Drosophila dişi mikrop hücrelerindeki mitokondri ve Clu mutluluk parçacıklarının vahşi tip lokalizasyonunun doğru görüntülenmesini sağlamak için yararlı bir araç olarak bulduk. Bu protokol çok çeşitli canlı görüntüleme çalışmaları için geçerli olmalı ve fiksasyondan önce dokuları tedavi etmek için de kullanılabilir.
En önemli adımlar, ovarioles'i kas kılımlarından arındırmak, yumurtalıkları yerinden çıkarmak için hidrojen peroksiti hafifçe eklemek ve hidrojen peroksit ilavesi sonrası hızlı bir şekilde görüntü almaktır. Bunu çeşitli hücre altı yapıları canlı görüntüleme için yararlı bir kontrol bulacağınızı umuyoruz. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.
