Bu yöntem, yeni proteinlerin veya protein alanadlarının ek gösterimi, bilinen proteinlerin yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin karakterizasyonu, protein etkileşim ağlarının tanımı veya farklı koşullarda antijen antikor imzaları gibi protein bazlı araştırmalardaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek bir genden bütün bir genoma kadar her türlü çalışma için tamamen tarafsız, yüksek iş sahibi ve modüler olmasıdır. Domainone kütüphanesinin inşası fonksiyonel çalışmalar için çok yararlıdır.
Bir faj görüntüleme bağlamına aktarılabilir ve bağlayıcı proteinler veya saflaştırılmış antikorlar gibi farklı hedeflere karşı seçim için kullanılabilir. NGS ile bağlantı son derece hassas ve güçlü bir analiz sağlar. Aynı zamanda, özellikle geliştirilen web araçları tüm domainome ve etkileşimom kesin bir karakterizasyonu verir.
Önce ORF kütüphanesini inşa etmek için DNA'yı %100 çıkışta 30 saniyelik darbelerle sonicate edin. Sonication sonra, merdiven ve sonicated DNA yük 1.5% agarose jel. Daha sonra elektroforez ünitesini 15 dakika boyunca santimetre başına beş volta başlatın.
Agarose jel elektroforezi sonication doğrulayan DNA yayma varlığını gösterir. Bu, sonication tabi olmayan bir DNA elde edilen katı bant ile karşılaştırıldığında. Sonra parçalanmış DNA yayma ile jel kısmını kesin ve kolon bazlı jel çıkarma kiti kullanarak arındırın.
UV spektrofotometredeki saflaştırılmış DNA konsantrasyonuna dikkat edin. Daha sonra üreticinin talimatlarına uyun ve bir mikrolitre hızlı körelme enzim karışımı ile kesici uçbeş mikrogramı tedavi edin. Sonra enzim karışımını 70 derecede 10 dakika süreyle inaktive edin.
Filtreleme vektörü hazırlamak için, ilk ecorv restriksiyon enzimi ile saflaştırılmış klonlama vektörünün beş mikrogramını sindirin. Daha sonra sindirilmiş ve sindirilmemiş vektörleri ve moleküler belirteci %1'lik agarose jelüzerine yükleyin. Sonra ısı 80 santigrat derecede 20 dakika boyunca restriksiyon enzimini inaktive eder.
Daha sonra, sindirilmiş vektörü beş birim fosfataz enzimi ve 10X fosfataz tamponunun 1/10 hacmi ile fosforilasyon. Sonra karışımı 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra fosfataz enzimini 65 derecede 5 dakika süreyle inaktive edin.
Sonra, jel den plazmid ayıklayın ve DNA arındırın. Sonra UV spektrofotometre DNA konsantrasyonu ölçmek. Ligasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için, sindirilmiş vektörün bir mikrogramına fosforilize kesici uçlardan 400 nanogram, 10X T4 DNA ligaz tamponu ve T4 DNA ligazını 100 mikrolitrelik son hacmine ekleyin.
Sonra bir gecede ligasyon reaksiyonunu 16 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, ısı 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede ligaz inaktive. Daha sonra, ligasyon ürünçöktürmek için pH 5.2 ve% 100 etanol 2.5 hacimli üç molar sodyum asetat 1/10 hacmi ekleyin.
DNA'yı çökeltmek için reaktifleri karıştırın ve eksi 80 derecede 20 dakika dondurun. 20 dakika sonra, dört santigrat derecede 20 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüj. Santrifüjden sonra, süpernatant'ı kovun.
Pelet için, soğuk 500 mikrolitre ekleyin 70%etanol ve tekrar santrifüj. Santrifüjün sonundaki süpernatant'ı atın. Pelet hava kurutulduktan sonra çökelmiş DNA'yı 10 mikrolitre suda çözün.
Elektroporasyon yapmadan önce, uygun sayıda mikrosantrifüj tüpü ve buz üzerinde 0,1 santimetre elektroporasyon küratörleri ayarlayın. Daha sonra hücrelerin 25 mikrolitre saflaştırılmış ligasyon ürünü bir mikrolitre ekleyin. Sonra pipet DNA, hücre karışımı soğuk elektroporasyon cuvette ve tüp flick.
Sonra cuvette dış su silin ve elektroporasyon ünitesinde yer ve darbe vurdu. Elektroporasyon bittikten sonra, hızlı bir şekilde cuvette hücrelere herhangi bir antibiyotik olmadan sıvı 2X YT orta bir mililitre ekleyin. Sonra hücresel karışımı 10 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Bir saat boyunca 37 santigrat derece dakikada 220 devrimleri bir shaker üzerinde tüp bırakın. Plaka 10 santimetre 2X YT agar plakaları kloramfenikol, ampisilin ve sadece kloramfenikol ile desteklenen kütüphanenin seyreltme. Bu PCR tarafından test edilecek tek koloniler elde etmek ve titrasyon gerçekleştirmektir.
Sonra, plaka 15 santimetre 2X YT agar plakaları kloramfenikol ve ampisilin ile takviye dönüştürülmüş yetkili hücreleri. Sonra tabakları bir gecede 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kolonileri sayar.
Ardından kitaplık boyutunu hesaplayın. Kitaplık boyutu aşağıdaki gibi hesaplanır, ortalama koloni sayısı sayısı seyreltme faktörü kat ları toplam kitaplık hacmi. Kütüphane boyutu altı klonların gücü 10 sırada olmalıdır.
Ampisilin konsantrasyonu daha fazla filtreleme gerçekleştirmek için en uygun ise, klon sayısı bu antibiyotik yokluğunda elde edilen bir ila 20 azaltır. Pozitif koloniler için test etmek için, yaklaşık 15-20 tek koloniler almak için bir ipucu kullanın. Sonra antibiyotik olmadan 2X YT orta 100 mikrolitre ile koloniler seyreltin.
Daha sonra, PCR Taq DNA polimeraz ile DNA şablonu olarak kültürün 0,5 mikrolitre yükseltmek. PCR sırasında, 55 santigrat derece tavlama sıcaklığı ve 72 santigrat derece 40 saniye uzatma süresi kullanarak amplifikasyon25 döngüleri çalıştırın. Kesici uç uzunluğunun beklenen 150 ile 750 baz çifti aralığında olup olmadığını kontrol edin.
Ve farklı koloniler farklı boyutlarda farklı ekler mevcut. Bu değişkenlik açısından iyi bir kütüphane hazırlık gösterir. Daha sonra, bakterileri toplamak için 150 milimetrelik plakalara üç mililitre taze 2X YT orta ekleyin.
Sonra steril bir kazıyıcı kullanarak bakteri hasat. Iyice karıştırdıktan sonra, 20% gliserol ekleyin ve eksi 80 derece santigrat gelecek kullanım için aliquots bırakın. Hemen kullanım için, gliserol eklemeden önce kütüphanenin aliquots birinden plazmid DNA arındırmak için sütun tabanlı plazmid çıkarma kiti gerçekleştirin.
UV spektrofotometredeki DNA konsantrasyonu ölçün ve numuneleri kullanıma kadar eksi 20 derecede saklayın. PCR amplifikasyon için DNA şablonu olarak kitaplığın 2,5 mikrolitresini kullanın. Termocycler koşullarını ayarlayın ve koşmaya başlayın.
Ardından, dizin PCR gerçekleştirmek için bir dizin PCR kiti kullanın. Bu, çok katlı Illumina çalıştırmaları içinde çift dizilimli kitaplıkları sıralar. Sonra termocycler koşullarını ayarlayın ve koşmaya başlayın.
AMPure XP boncukları ile saflaştırma sonra, boyutunu doğrulamak için, bioanalyzer son kütüphanenin bir ila 10 seyreltme bir mikrolitre çalıştırın. Ardından, son kitaplık izleme sinin bölgesini seçerek ölçün. Bu şematik temsiller, P filtre vektörü içine klonlama sonra, sadece ORFs karşılık koloniler antibiyotik varlığında fonksiyonel beta-laktamaz üretmek demonstate.
Filtreden sonra klon sayısında 20 kat azalma beklenmektedir. Yüksek antibiyotik konsantrasyonlarında büyüyen iyi klasör ORFs ile. Ayrıca, ORF parçaları filtrelenmiş kitaplıktan kolayca kurtarılabilir.
Hedef proteinlere veya antikorlara karşı faj görüntüleme seçimi yapmak için fajmid ORF kütüphanesi oluşturulur. Elde edilen tüm kütüphaneler ve çıktılar NGS tarafından derinlemesine analiz edilmektedir. NGS, seçilen parçaların her birinin kütüphane çeşitliliği, bolluğu ve kesin haritalaması hakkında tam bir bilgi sağlar.
Son olarak etkileşimom webtool geliştirmek ham sıralama genomik ek açıklamalar ile putatif etki alanları listesine değişen okur üretir. Bu videoyu izledikten sonra, nasıl oluşturmak ve istenilen BIR DNA kaynağından bir domainome kütüphane doğrulamak için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Ve yeni nesil sıralama ile kütüphanenin yüksek bir iş bölümü tarama gerçekleştirmek için.
ORF filtreleme kütüphanelerinin Illumina platformları ile dizilişi optimize ettik ve programlama becerilerine ihtiyaç duymadan bu tür verilerin analizini mümkün kılmış bir web aracı geliştirdik.
