Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях на основе белка, таких как аннотация новых белков или белковых доменов, характеристика структурных и функциональных свойств известных белков, определение сетей взаимодействия белков или подписей антигенных антител в различных условиях. Основным преимуществом этой техники является то, что она является абсолютно беспристрастной, высокой пропускной способностью и модульной для любого вида исследования, начиная от одного гена до целого генома. Строительство библиотеки domainone очень полезно для функциональных исследований.
Он может быть передан в контекст фагового отображения и использоваться для отбора против различных целей, таких как связывающие белки или очищенные антитела. Связь с NGS позволяет чрезвычайно чувствительный и мощный анализ. В то же время, веб-инструменты, специально разработанные дает точную характеристику всего domainome и interactome.
Чтобы построить библиотеку ORF во-первых, sonicate ДНК с 30 секунд импульсов на 100% выход. После соникации загрузите лестницу и звуковую ДНК на гель 1.5%agarose. Затем запустите электрофорезный блок на пять вольт в течение 15 минут.
Электрофорез агарозного геля показывает наличие мазка ДНК, подтверждающего сонику. Это по сравнению с твердой полосой, полученной из ДНК, не подвергаемой соникации. Затем вырезать гель часть с фрагментированной мазок ДНК и очистить с помощью колонки на основе геля извлечения комплекта.
Измерьте концентрацию очищенной ДНК в УФ-спектрофотометре. Затем следуйте инструкциям производителя и обработать пять микрограммов вставки одним микролитером быстрой притупляем ферментной смеси. Затем инактивировать ферментную смесь при 70 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Чтобы подготовить вектор фильтрации, сначала переварите пять микрограммов очищенного вектора клонирования с ферментом ограничения EcoRV. Затем загрузите переваренные и непереваренные векторы и молекулярный маркер на гель 1%agarose. Затем нагрейте инактивировать фермент ограничения при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут.
Далее фосфорилат переваренный вектор с пятью единицами фермента фосфатазы и 1/10 тома 10X фосфатазы буфера. Затем инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Затем инактивировать фермент фосфатазы при 65 градусах цельсия в течение пяти минут.
Затем извлекайте плазмиду из геля и очищаете ДНК. Затем измерьте концентрацию ДНК в УФ-спектрофотометре. Для выполнения реакции перевязки добавьте 400 нанограммов фосфорилированных вставок в один микрограмм переваренного вектора, буфер ДНК-лигазы 10X T4 и липсию ДНК T4 к окончательному объему в 100 микролитров.
Затем инкубировать реакцию перевязки при 16 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день, тепло инактивировать лигазы при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Далее добавьте 1/10 тома трех ацетат молярного натрия при рН 5,2 и 2,5 тома 100% этанола для осаждения перевязки продукта.
Чтобы вызвать ДНК, смешайте реагенты и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Через 20 минут центрифуга на максимальной скорости в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугации изгнать супернатанта.
К гранулам добавьте 500 микролитров холодного 70%этанола и снова центрифугу. Откажитесь от супернатанта в конце центрифугации. Как только гранулы высушиваются, растворяйте осажденную ДНК в 10 микролитров воды.
Перед выполнением электропорации организуйте соответствующее количество микроцентрифуговых трубок и 0,1 сантиметра электропорации кюветов на льду. Затем добавьте один микролитер очищенного продукта перевязки в 25 микролитров клеток. Затем пипетка ДНК, клеточная смесь к холодной электропорации cuvette и Флик трубки.
Затем протрите воду с внешней стороны кюветта и поместите в электропорацию и ударяет импульс. После электропорации, быстро добавить один миллилитр жидкости 2X YT среды без каких-либо антибиотиков в клетках в кювете. Затем перенесите клеточную смесь в 10 миллилитровую трубку.
Оставьте трубку на шейкере при 220 оборотов в минуту при 37 градусах по Цельсию в течение часа. Плита разбавления библиотеки на 10 сантиметров 2X YT агар пластины дополнены хлорамфеникол, ампициллин и только хлорамфеникол. Это необходимо для получения одиночных колоний для тестирования ПЦР и выполнения титрова.
Далее пластины преобразованы компетентные клетки на 15 сантиметров 2X YT агар пластины дополнены хлорамфеникол и ампициллин. Затем инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день подсчитайте колонии, выбирающих разбавление там, где они подсчитываются.
Затем вычислите размер библиотеки. Размер библиотеки рассчитывается следующим образом, среднее время разбавления коэффициента библиотеки общего объема библиотеки. Размер библиотеки должен быть порядка 10 до власти шести клонов.
Если концентрация ампициллина оптимальна для выполнения более фильтрации, число клонов уменьшается до одного до 20, что получено в отсутствие этого антибиотика. Чтобы проверить положительные колонии, используйте наконечник, чтобы забрать около 15 до 20 одиночных колоний. Затем разбавить колонии 100 микролитров 2X YT среды без антибиотиков.
Далее, PCR усиливают 0,5 микролитр культуры в качестве шаблона ДНК с полимеразой Taq DNA. Во время ПЦР запустите 25 циклов усиления с использованием температуры 55 градусов по Цельсию и времени продления на 40 секунд при температуре 72 градуса по Цельсию. Убедитесь, что длина вставки находится в ожидаемом диапазоне от 150 до 750 базовых пар.
И что различные колонии представляют различные вставки с разным размером. Это свидетельствует о хорошей подготовке библиотеки с точки зрения изменчивости. Затем добавьте три миллилитров свежей среды 2X YT к 150-миллиметровым пластинам для сбора бактерий.
Затем урожай бактерий с помощью стерильного скребка. После тщательного смешивания добавьте 20%глицерол и оставьте в минус 80 градусов по Цельсию в алицитах для дальнейшего использования. Для немедленного использования выполните набор для извлечения плазмидной плазмиды на основе столбца, чтобы очистить плазмидную ДНК от одной из алицитов библиотеки перед добавлением глицерола.
Измерьте концентрацию ДНК в ультрафиолетовом спектрофотометре, а затем храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию до их использования. Используйте 2,5 микролитера библиотеки в качестве шаблона ДНК для усиления ПЦР. Установите условия термоциклера и начните бег.
Далее используйте набор индексных ПЦР для выполнения индексного ПЦР. Это позволит секвенировать двойные индексы библиотек в мультиплексных работает Illumina. Затем установите условия термоциклера и начните бег.
После очистки бисером AMPure XP, чтобы проверить размер, запустите один микролитер от одного до 10 разбавления окончательной библиотеки на биоанализе. Затем количественно, выбрав область окончательного следа библиотеки. Эти схематические представления демонизируют, что после клонирования в вектор фильтра P, только колонии, соответствующие ORFs производят функциональную бета-лактамазу в присутствии антибиотиков.
После фильтрации ожидается уменьшение числа клонов в 20 раз. С хорошей папкой ORFs растет при более высоких концентрациях антибиотиков. Кроме того, фрагменты ORF можно легко восстановить из фильтрованной библиотеки.
Фагемид ORF библиотека построена для выполнения выбора фагов дисплей против целевых белков или антител. Все библиотеки и полученные результаты затем глубоко анализируются NGS. NGS предоставляет полную информацию о разнообразии библиотек, изобилии и точном отображении каждого из выбранных фрагментов.
Наконец interactome искать webtool разработан генерирует сырья секвенирования читает, начиная со списка осядой доменов с геномными аннотациями. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как построить и проверить библиотеку domainome из желаемого источника ДНК. И для выполнения высокой пропускной способности скрининга библиотеки следующего поколения последовательности.
Мы оптимизировали секвенирование библиотек фильтрации ORF с платформами Illumina и разработали веб-инструмент, который позволяет анализ такого рода данных без необходимости навыков программирования.
