Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de la recherche sur les protéines telles que l’annotation de nouvelles protéines ou domaines protéiques, la caractérisation des propriétés structurelles et fonctionnelles des protéines connues, la définition des réseaux d’interaction protéique ou les signatures d’anticorps antigènes dans différentes conditions. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est complètement impartiale, à haut débit et modulaire pour tout type d’étude allant d’un seul gène jusqu’à un génome entier. La construction d’une bibliothèque domainone est très utile pour les études fonctionnelles.
Il peut être transféré dans un contexte d’affichage des phages et utilisé pour la sélection contre différentes cibles telles que les protéines liantes ou les anticorps purifiés. Le couplage avec NGS permet une analyse extrêmement sensible et puissante. Dans le même temps, les outils web spécifiquement développés donnent une caractérisation précise de l’ensemble du domaine et interactome.
Pour construire d’abord la bibliothèque ORF, soniquez l’ADN avec des impulsions de 30 secondes à 100% de sortie. Après la sonication, chargez l’échelle et l’ADN sonique sur un gel d’agarose de 1,5%. Puis commencer l’unité d’électrophorèse à cinq volts par centimètre pendant 15 minutes.
L’électrophoresis de gel d’agarose montre la présence du frottis d’ADN confirmant la sonication. Ceci est par rapport à la bande solide obtenue à partir d’un ADN non soumis à la sonication. Ensuite, coupez la partie de gel avec le frottis fragmenté d’ADN et purifiez à l’aide du kit d’extraction de gel à base de colonne.
Mesurer la concentration de l’ADN purifié dans le spectrophotomètre UV. Suivez ensuite les instructions du fabricant et traitez cinq microgrammes de l’insert avec un microlitre de mélange rapide d’enzymes émoussées. Puis inactiver le mélange d’enzymes à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Pour préparer le vecteur de filtrage, digérer d’abord cinq microgrammes du vecteur de clonage purifié avec l’enzyme de restriction EcoRV. Chargez ensuite les vecteurs digérés et non digérés et le marqueur moléculaire sur un gel agarose de 1 %. Puis la chaleur inactive l’enzyme de restriction à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, phosphorylate le vecteur digéré avec cinq unités d’enzyme phosphatase et 1/10 volume du tampon de phosphatase 10X. Puis incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Puis inactiver l’enzyme phosphatase à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, extraire le plasmide du gel et purifier l’ADN. Mesurez ensuite la concentration de l’ADN dans le spectrophotomètre UV. Pour effectuer la réaction de ligature, ajouter 400 nanogrammes des inserts phosphorylatés à un microgramme de vecteur digéré, 10X T4 adn ligase tampon et ligase d’ADN T4 à un volume final de 100 microlitres.
Puis incuber la réaction de ligature à 16 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, la chaleur inactive la ligase à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 1/10 volume de trois acétate de sodium molaire au pH 5,2 et 2,5 volumes d’éthanol à 100 % pour précipiter le produit de ligature.
Pour précipiter l’ADN, mélanger les reagents et congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après 20 minutes, centrifugeuse à la vitesse la plus élevée pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, expulser le surnatant.
À la pastille, ajouter 500 microlitres de 70% d’éthanol froid et encore une centrifugeuse. Jeter le supernatant à la fin de la centrifugation. Une fois la pastille séchée à l’air, dissoudre l’ADN précipité dans 10 microlitres d’eau.
Avant d’effectuer l’électroporation, prévoir le nombre approprié de tubes de microcentrifugeuse et les cuvettes d’électroporation de 0,1 centimètre sur la glace. Ajouter ensuite un microlitre du produit de ligature purifiée à 25 microlitres des cellules. Puis pipette l’ADN, mélange cellulaire à la cuvette d’électroporation froide et feuilleter le tube.
Essuyez ensuite l’eau de l’extérieur de la cuvette et placez-la dans l’unité d’électroporation et frappez l’impulsion. Une fois l’électroporation terminée, ajouter rapidement un millilitre de liquide 2X YT moyen sans aucun antibiotique pour les cellules de la cuvette. Transférer ensuite le mélange cellulaire dans un tube de 10 millilitres.
Laissez le tube sur un shaker à 220 révolutions par minute à 37 degrés Celsius pendant une heure. Plaquez les dilutions de la bibliothèque sur des plaques d’agar 2X YT de 10 centimètres complétées par du chloramphénicol, de l’ampicilline et seulement du chloramphéniphénol. Il s’agit d’obtenir des colonies simples à tester par PCR et d’effectuer la titration.
Ensuite, plaquez les cellules compétentes transformées sur des plaques d’agar 2X YT de 15 centimètres complétées par du chloramphéniphénol et de l’ampicilline. Puis incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, comptez les colonies en choisissant la dilution là où elles sont dénombrables.
Calculez ensuite la taille de la bibliothèque. La taille de la bibliothèque est calculée comme suit, le nombre moyen de colonies fois le facteur de dilution fois le volume total de la bibliothèque. La taille de la bibliothèque devrait être de l’ordre de 10 à la puissance de six clones.
Si la concentration d’ampicilline est optimale pour effectuer plus de filtrage, le nombre de clones réduit à un à 20 de celui obtenu en l’absence de cet antibiotique. Pour tester les colonies positives, utilisez une pointe pour ramasser environ 15 à 20 colonies simples. Ensuite, diluer les colonies avec 100 microlitres de 2X YT moyen sans antibiotiques.
Ensuite, PCR amplifier 0,5 microlitre de la culture comme modèle d’ADN avec polymése d’ADN Taq. Pendant le PCR, exécutez 25 cycles d’amplifications utilisant la température d’annealing de 55 degrés Celsius et un temps d’extension de 40 secondes à 72 degrés Celsius. Vérifiez que la longueur de l’insert est de l’étendue prévue de 150 à 750 paires de base.
Et que différentes colonies présentent différents inserts de taille différente. Cela indique une bonne préparation de la bibliothèque en termes de variabilité. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu frais 2X YT aux plaques de 150 millimètres pour recueillir les bactéries.
Puis récolter les bactéries à l’aide d’un grattoir stérile. Après avoir bien mélangé, ajouter 20% de glycérol et laisser en moins 80 degrés Celsius en aliquots pour une utilisation future. Pour une utilisation immédiate, effectuez une trousse d’extraction de plasmides à base de colonnes pour purifier l’ADN plasmide de l’un des aliquots de la bibliothèque avant d’ajouter du glycérol.
Mesurez la concentration de l’ADN dans le spectrophotomètre UV, puis stockez les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Utilisez 2,5 microlitres de la bibliothèque comme modèle d’ADN pour l’amplification PCR. Réglez les conditions thermocycler et démarrez la course.
Ensuite, utilisez un kit PCR index pour effectuer l’index PCR. Cela séquencera les bibliothèques indexées doubles dans les séries d’Illumina multiplexées. Réglez ensuite les conditions thermocycler et démarrez la course.
Après purification avec des perles AMPure XP, pour vérifier la taille, exécutez un microlitre de la dilution d’un à 10 de la bibliothèque finale sur le bioanalyseur. Quantifiez ensuite en sélectionnant la région de la trace finale de la bibliothèque. Ces représentations schématiques diabolisent qu’après clonage dans le vecteur de filtre de P, seules les colonies correspondant aux ORF produisent la bêta-lactamase fonctionnelle en présence d’antibiotiques.
Après le filtrage, une diminution du nombre de clones de 20 fois est attendue. Avec des ORF bon dossier qui poussent à des concentrations d’antibiotiques plus élevées. De plus, les fragments orf peuvent être facilement récupérés à partir de la bibliothèque filtrée.
Une bibliothèque phagemid ORF est construite pour effectuer la sélection de l’affichage des phages contre les protéines cibles ou les anticorps. Toutes les bibliothèques et les sorties obtenues sont ensuite analysées en profondeur par la NGS. Le NGS fournit une information complète sur la diversité des bibliothèques, l’abondance et la cartographie précise de chacun des fragments sélectionnés.
Enfin, l’interactome chercher webtool développé génère des lectures de séquençage brut s’étendant à la liste des domaines putatifs avec annotations génomiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire et de valider une bibliothèque domainome à partir d’une source d’ADN désirée. Et d’effectuer un criblage à haut débit de la bibliothèque par séquençage de prochaine génération.
Nous avons optimisé le séquençage des bibliothèques de filtrage ORF avec les plateformes Illumina et développé un webtool qui permet l’analyse de ce type de données sans aucune nécessité de compétences en programmation.
