שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר מבוסס חלבון כגון ביאור של חלבונים חדשים או תחומי חלבון, אפיון תכונות מבניות ותפקודיות של חלבונים ידועים, הגדרת רשתות אינטראקציה עם חלבונים או חתימות נוגדנים אנטיגן בתנאים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא בלתי משוחדת לחלוטין, תפוקה גבוהה ומודולרית לכל סוג של מחקר החל וגן יחיד ועד גנום שלם. בניית ספריית דומיין שימושית מאוד למחקרים פונקציונליים.
ניתן להעביר אותו להקשר תצוגת פאג' ו לשמש לבחירה נגד מטרות שונות כגון חלבונים מחייבים או נוגדנים מטוהרים. הצימוד עם NGS מאפשר ניתוח רגיש ורב עוצמה ביותר. יחד עם זאת, כלי האינטרנט שפותחו במיוחד מעניקים אפיון מדויק של כל הדומיין והאינטראקציה.
כדי לבנות תחילה את ספריית ORF, יש להפוך את הדנ"א לפולסים של 30 שניות בתפוקה של 100%. לאחר sonication, לטעון את הסולם ואת ה-DNA sonicated על 1.5% ג'ל אגרוז. ואז להתחיל את יחידת אלקטרופורזה בחמישה וולט לסנטימטר במשך 15 דקות.
אלקטרופורזה ג'ל agarose מראה את הנוכחות של מריחת DNA המאשר sonication. זאת בהשוואה ללהקה המוצקה המתקבלת מדנ"א שלא היה נתון לניקציה. לאחר מכן חותכים את חלק הג'ל עם מריחת ה- DNA המפוצלת ומטהרים באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מבוססת עמודה.
למדוד את הריכוז של ה-DNA מטוהרים בספקטרופוטומטר UV. לאחר מכן בצע את הוראות היצרן ולטפל חמישה מיקרוגרם של הכנס עם microliter אחד של תערובת אנזים קהה מהיר. ואז להשבית את תערובת האנזים ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
כדי להכין את וקטור הסינון, לעכל תחילה חמישה מיקרוגרם של וקטור שיבוט מטוהר עם אנזים הגבלת EcoRV. לאחר מכן לטעון את הווקטורים מתעכלים ולא מעוכלים ואת הסמן המולקולרי על 1% ג'ל אגרוז. לאחר מכן מחממים את האנזים המגבלה ב 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
לאחר מכן, זרחן לווקטור מתעכל עם חמש יחידות של אנזים פוספטאז ונפח 1/10 של מאגר פוספטאז 10X. ואז להחגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ואז להשבית את האנזים פוספטאז ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן, לחלץ את הפלסמיד מן הג'ל לטהר את ה-DNA. ואז למדוד את הריכוז של ה-DNA בספקטרופוטומטר UV. כדי לבצע את תגובת הרצועה, להוסיף 400 ננוגרם של זרחן מוסיף מיקרוגרם אחד של וקטור מתעכל, 10X T4 מאגר רצועות DNA ו T4 DNA ligase לנפח הסופי של 100 microliters.
ואז לה הדגירה את תגובת הקשירה ב 16 מעלות צלזיוס ללילה. למחרת, חום להשבית את הליגה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1/10 נפח של שלושה אצטט נתרן טוחן ב pH 5.2 ו 2.5 כרכים של 100%אתנול כדי לזרז את המוצר קשירה.
כדי לזרז את הדנ"א, מערבבים את הריג'ים ומקפיאים במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, צנטריפוגה במהירות הגבוהה ביותר במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לגרש את העל-טבעי.
לכדור, להוסיף 500 microliters של קר 70% אתנול ושוב צנטריפוגה. השלך את העל-טבעי בסוף הצנטריפוגה. ברגע שהכדור מיובש באוויר, ממיסים את הדנ"א המוזרז ב-10 מיקרוליטרים של מים.
לפני ביצוע אלקטרופורציה, לארגן את המספר המתאים של צינורות microcentrifuge ו 0.1 ס"מ אלקטרופולציה cuvettes על קרח. לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של מוצר הקשירה המטוהר ל-25 מיקרוליטרים של התאים. ואז פיפטה ה-DNA, תערובת תאים כדי cuvette אלקטרופורציה קר להעיף את הצינור.
ואז לנגב את המים מהחלק החיצוני של cuvette ולמקם ביחידת אלקטרופורציה ופגע הדופק. לאחר אלקטרופורציה נגמר, להוסיף במהירות מיליליטר אחד של נוזל 2X YT בינוני ללא כל אנטיביוטיקה לתאים ב cuvette. ואז להעביר את התערובת התאית לצינור 10 מיליליטר.
השאירו את הצינור על שייקר ב 220 מהפכות לדקה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה. צלחת את הדילולים של הספרייה על 10 ס"מ 2X YT צלחות אגר בתוספת כלוראמפניקול, אמפיצילין רק כלוראמפניקול. זה כדי להשיג מושבות בודדות להיבדק על ידי PCR ולבצע טיטריות.
לאחר מכן, צלחת התאים המוכשרים טרנספורמציה על 15 ס"מ 2X YT צלחות אגר בתוספת כלוראמפניקול ואמפיצילין. ואז לה הדגירה את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס ללילה. למחרת, מחוזות המושבות בוחרים את הדילול שבו הם ניתנים לספירה.
לאחר מכן חשב את גודל הספריה. גודל הספריה מחושב באופן הבא, ממוצע מושבה מספר פעמים דילול גורם פעמים נפח הספריה הכולל. גודל הספרייה צריך להיות בסדר של 10 לעוצמה של שישה שיבוטים.
אם ריכוז אמפיצילין הוא אופטימלי לבצע סינון יותר, מספר השיבוט מקטין לאחד עד 20 מזה המתקבל בהיעדר אנטיביוטיקה זו. כדי לבדוק את המושבות החיוביות, השתמשו בטיפ כדי לקלוט כ-15 עד 20 מושבות בודדות. לאחר מכן לדלל את המושבות עם 100 microliters של מדיום YT 2X ללא אנטיביוטיקה.
לאחר מכן, PCR להגביר 0.5 microliter של התרבות כתבנית DNA עם פולימראז DNA Taq. במהלך PCR, לרוץ 25 מחזורים של הגברה באמצעות טמפרטורת חישול של 55 מעלות צלזיוס ותוספת של 40 שניות ב 72 מעלות צלזיוס. ודא שאורך ההוספה נמצא בטווח הצפוי של 150 עד 750 זוג בסיסים.
ומושבות שונות מציגות מוסיף שונה עם גודל שונה. הדבר מצביע על הכנת ספריה טובה במונחים של שונות. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של טרי 2X YT בינוני ל 150 מילימטר צלחות כדי לאסוף את החיידקים.
ואז לקצור את החיידקים באמצעות מגרד סטרילי. לאחר ערבוב יסודי, מוסיפים 20% גליצרול ומשאירים במינוס 80 מעלות צלזיוס באליקוטים לשימוש עתידי. לשימוש מיידי, בצע ערכת מיצוי פלסמיד מבוססת עמודה כדי לטהר את הדנ"א הפלסמיד מאחד האליקוצים של הספרייה לפני הוספת גליצרול.
למדוד את הריכוז של ה-DNA בספקטרופוטומטר UV ולאחר מכן לאחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד השימוש. השתמש 2.5 microliters של הספרייה כתבנית DNA עבור הגברה PCR. הגדר את תנאי התרמוצ'ילר והתחל את הריצה.
לאחר מכן, השתמש בערכת PCR של אינדקס כדי לבצע PCR אינדקס. פעולה זו תרצף את הספריות הכפולות הכלולות באינדקס בתוך הפעלת אילומינה מרובת ערכים. לאחר מכן הגדר את תנאי התרמוצ'ילר והתחל את הריצה.
לאחר טיהור עם חרוזים AMPure XP, כדי לאמת את הגודל, להפעיל microliter אחד של אחד עד 10 דילול של הספרייה הסופית על bioanalyzer. לאחר מכן כימת על-ידי בחירת האזור של המעקב אחר הספריה הסופית. ייצוגים סכמטיים אלה דמוניזציה כי לאחר שיבוט לתוך וקטור מסנן P, רק מושבות המתאימות ORFs לייצר בטא לקטם פונקציונלי בנוכחות אנטיביוטיקה.
לאחר סינון צפויה ירידה במספר השיבוטים של פי 20. עם ORFs תיקייה טובה גדל בריכוזים אנטיביוטיים גבוהים יותר. יתר על כן, ניתן לשחזר בקלות את שברי ORF מהספריה המסוננת.
ספריית ORF של פאגמיד בנויה כדי לבצע בחירת תצוגת פאג' נגד חלבוני מטרה או נוגדנים. כל הספריות והפלטים המתקבלים מנותחים עמוקות על ידי ה- NGS. ה- NGS מספק מידע מלא על מגוון הספריות, שפע ומיפוי מדויק של כל אחד מהקטעים שנבחרו.
לבסוף האינטראקטיביות לחפש webtool שפותחה מייצרת קריאות רצף גלם החל ברשימה של תחומים putative עם ביאורים גנומיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבנות ולאמת ספריית דומיין ממקור DNA הרצוי. ולבצע הקרנת תפוקה גבוהה של הספרייה על ידי רצף הדור הבא.
יש לנו אופטימיזציה של רצף של ספריות סינון ORF עם פלטפורמות Illumina ופיתחנו webtool המאפשרים ניתוח של סוג זה של נתונים ללא כל צורך של כישורי תכנות.
