위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

이 방법은 새로운 단백질 또는 단백질 도메인의 음장, 알려진 단백질의 구조적 및 기능적 특성의 특성화, 단백질 상호 작용 네트워크 또는 다른 조건에서 항원 항체 시그니처의 정의와 같은 단백질 기반 연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 유전자에서 전체 게놈에 이르기까지 모든 종류의 연구에 대해 완전히 편견이 없고 높은 처리량및 모듈식이라는 것입니다. 도메인 라이브러리의 구성은 기능 연구에 매우 유용합니다.

그것은 파지 디스플레이 문맥으로 옮겨지고 결합 단백질 또는 정제 항체와 같은 다른 표적에 대하여 선택을 위해 사용될 수 있다. NGS와의 커플링은 매우 민감하고 강력한 분석을 가능하게 합니다. 동시에, 특별히 개발 된 웹 도구는 전체 도메인 및 상호 작용의 정확한 특성을 제공합니다.

먼저 ORF 라이브러리를 구성하려면 100%의 출력으로 30초 펄스로 DNA를 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 사다리와 초음파 처리 된 DNA를 1.5 % 아가로즈 젤에 적재하십시오. 그런 다음 전기 전도 장치를 센티미터 당 5 볼트로 15 분 동안 시작합니다.

아가로즈 겔 전기포고증은 초음파 처리를 확인하는 DNA 얼룩의 존재를 나타낸다. 이는 초음파 처리를 거치지 않는 DNA로부터 얻은 고체 밴드와 비교된다. 그런 다음 단편화된 DNA 얼룩으로 젤 부분을 자르고 컬럼 기반 젤 추출 키트를 사용하여 정화합니다.

UV 분광계에서 정제된 DNA의 농도를 측정합니다. 그런 다음 제조업체의 지시에 따라 빠른 무딘 효소 믹스의 마이크로 리터 1개로 5마이크로그램의 인서트를 치료합니다. 그런 다음 효소 믹스를 섭씨 70도에서 10분 동안 비활성화합니다.

여과 벡터를 준비하려면 먼저 EcoRV 제한 효소로 정제된 복제 벡터의 5마이크로그램을 소화한다. 그런 다음 소화되고 소화되지 않은 벡터와 분자 마커를 1% 아가로즈 젤에 적재합니다. 그런 다음 가열은 제한 효소를 섭씨 80도에서 20분 동안 비활성화합니다.

다음으로, 소화된 벡터를 5단위의 인산효소와 10X 인산염 버퍼의 1/10부피를 증식한다. 그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 인산염 효소를 섭씨 65도에서 5분간 비활성화합니다.

다음으로, 젤에서 플라스미드를 추출하고 DNA를 정화합니다. 그런 다음 UV 분광계에서 DNA의 농도를 측정합니다. 결찰 반응을 수행하기 위해 소화된 벡터 1마이크로그램에 인산체 400나노그램, 10X T4 DNA 리구아제 버퍼 및 T4 DNA 리구아제를 100 마이크로리터의 최종 부피에 추가한다.

그런 다음 하룻밤 동안 16섭씨에서 결찰 반응을 배양합니다. 다음 날, 열은 10 분 동안 65섭씨에서 리그아제비활성화. 다음으로, 3개의 어금니 나트륨 아세테이트의 1/10 부피를 pH 5.2 및 2.5부량의 100% 에탄올을 추가하여 결찰 생성물을 침전시한다.

DNA를 침전시키기 위해 시약을 섞고 섭씨 영하 80도에서 20분 동안 동결하십시오. 20분 후, 섭씨 4도에서 20분 동안 최고 속도로 원심분리기. 원심 분리 후, 상체를 추방.

펠릿에 차가운 70% 에탄올과 원심분리기 500마이크로리터를 넣습니다. 원심 분리의 끝에 상체를 폐기합니다. 펠릿이 공기건조되면 침전된 DNA를 10마이크로리터의 물에 녹입니다.

전기 포기를 수행하기 전에, 얼음에 미세 원심 분리기 튜브와 0.1 센티미터 전기 포기큐벳의 적절한 수를 준비합니다. 그런 다음 세포의 25 마이크로 리터에 정제 된 결찰 제품의 마이크로 리터 1 개를 추가합니다. 그런 다음 DNA, 세포 혼합물을 차가운 전기 기화 큐벳에 피펫하고 튜브를 쓸어 넘깁니다.

그런 다음 큐벳의 외부에서 물을 닦아 전기 기장치에 배치하고 펄스를 명중. 전기 포기가 끝난 후, 큐벳의 세포에 항생제없이 액체 2X YT 배지 의 1 밀리리터를 신속하게 추가하십시오. 그런 다음 세포 혼합물을 10 밀리리터 튜브로 옮김합니다.

분당 220회전에서 1시간 동안 37도의 회전에서 튜브를 흔들어 두십시오. 10센티미터 2X YT 아가 플레이트에 클로람페니콜, 암피실린, 클로람페니콜만 으로 보충한 10센티미터 2X YT 아가 플레이트에 보관물의 희석을 플레이트. 이것은 PCR에 의해 시험되고 적정을 능력을 발휘하기 위하여 단 하나 식민지를 얻는 것입니다.

다음으로, 15센티미터 2X YT 아가 플레이트에 변형된 유능한 세포를 클로람페니콜과 암피실린으로 보충합니다. 그런 다음 하룻밤 동안 섭씨 30도에서 접시를 배양합니다. 다음 날, 식민지들이 계산할 수 있는 희석을 선택하는 것을 세어라.

그런 다음 라이브러리 크기를 계산합니다. 라이브러리 크기는 다음과 같이 계산되며, 평균 콜로니 수 시간 희석 계수 시간 총 라이브러리 볼륨이 계산됩니다. 라이브러리 크기는 6개의 클론의 힘에 10의 순서로 되어 있어야 합니다.

암피실린 농도가 더 많은 여과를 수행하는 것이 최적인 경우, 클론 수는 이 항생제가 없는 상태에서 얻은 것의 1내지 20으로 감소한다. 긍정적인 식민지에 대 한 테스트, 주위 를 데리러 팁을 사용 하 여 15 받는 것 20 단일 식민지. 그런 다음 항생제없이 2X YT 배지의 100 마이크로 리터로 식민지를 희석시하십시오.

다음으로, PCR은 Taq DNA 폴리머라제와 DNA 템플릿으로 배양의 0.5 마이크로리터를 증폭시다. PCR 동안 섭씨 55도의 어너링 온도와 섭씨 72도에서 40초의 연장 시간을 사용하여 25사이클의 증폭을 실행합니다. 인서트 길이가 150 ~ 750베이스 쌍의 예상 범위에 있는지 확인합니다.

그리고 다른 식민지는 다른 크기의 다른 인서트를 제시한다. 이는 가변성 측면에서 좋은 라이브러리 준비를 나타냅니다. 다음으로, 박테리아를 수집하기 위해 150mm 플레이트에 신선한 2X YT 배지 3 밀리리터를 추가합니다.

그런 다음 멸균 스크레이퍼를 사용하여 박테리아를 수확하십시오. 철저하게 혼합 한 후, 추가 20% 글리세롤과 향후 사용을 위해 알리코에 영하 80도에 둡니다. 즉시 사용하려면 컬럼 기반 플라스미드 추출 키트를 수행하여 글리세롤을 추가하기 전에 라이브러리의 알리쿼트 중 하나에서 플라스미드 DNA를 정화합니다.

UV 분광광계에서 DNA의 농도를 측정한 다음 사용전까지 샘플을 섭씨 영하 20도에 저장합니다. PCR 증폭을 위한 DNA 템플릿으로 라이브러리의 2.5 마이크로리터를 사용합니다. 열순환기 조건을 설정하고 실행을 시작합니다.

다음으로 인덱스 PCR 키트를 사용하여 인덱스 PCR을 수행합니다. 이렇게 하면 멀티플렉스 일루미나 실행 내의 이중 인덱싱 된 라이브러리가 시퀀싱됩니다. 그런 다음 열순환기 조건을 설정하고 실행을 시작합니다.

AMPure XP 구슬로 정화한 후 크기를 확인하기 위해 바이오 분석기에 최종 라이브러리의 1~10희석을 1마이크로리터로 실행합니다. 그런 다음 최종 라이브러리 추적 영역을 선택하여 정량화합니다. 이러한 회로도 표현은 P 필터 벡터로 복제 한 후, ORFs에 대응하는 식민지만이 항생제의 존재에서 기능성 베타 - 락타마아를 생산한다는 것을 악마.

20배의 클론 수의 감소를 필터링한 후 예상된다. 좋은 폴더 ORFs 높은 항생제 농도에서 성장. 또한 ORF 조각은 필터링된 라이브러리에서 쉽게 복구할 수 있습니다.

파지미드 ORF 라이브러리는 표적 단백질 또는 항체에 대한 파지 디스플레이 선택을 수행하기 위해 구성됩니다. 그런 다음 얻은 모든 라이브러리와 출력은 NGS에 의해 깊이 분석됩니다. NGS는 선택한 각 조각의 라이브러리 다양성, 풍부하고 정확한 매핑에 대한 완전한 정보를 제공합니다.

마지막으로 상호 작용 추구 웹툴개발은 유전체 성모가 있는 퍼디지도메인 목록에 이르는 원시 시퀀싱 판독을 생성합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 원하는 DNA 소스에서 도메인 라이브러리를 구성하고 검증하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 그리고 차세대 시퀀싱에 의한 라이브러리의 높은 처리량 스크리닝을 수행한다.

우리는 일루미나 플랫폼으로 ORF 필터링 라이브러리의 순서를 최적화하고 프로그래밍 기술없이 이러한 종류의 데이터를 분석 할 수있는 웹 도구를 개발했습니다.