Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación basada en proteínas como la anotación de nuevas proteínas o dominios proteicos, la caracterización de las propiedades estructurales y funcionales de las proteínas conocidas, la definición de redes de interacción proteica o las firmas de anticuerpos antigen en diferentes condiciones. La principal ventaja de esta técnica es que es completamente imparcial, de alto rendimiento y modular para cualquier tipo de estudio que va desde un solo gen hasta un gen completo. La construcción de una biblioteca domainone es muy útil para estudios funcionales.
Se puede transferir a un contexto de visualización de fagos y se puede utilizar para la selección contra diferentes objetivos como proteínas de unión o anticuerpos purificados. El acoplamiento con NGS permite un análisis extremadamente sensible y potente. Al mismo tiempo, las herramientas web desarrolladas específicamente dan una caracterización precisa de todo el dominio e interacto.
Para construir primero la biblioteca ORF, sonicar el ADN con pulsos de 30 segundos al 100% de salida. Después de la sonicación, cargue la escalera y el ADN sonicado en un gel de 1,5% agarosa. A continuación, inicie la unidad de electroforesis a cinco voltios por centímetro durante 15 minutos.
La electroforesis de gel de agarosa muestra la presencia de frotis de ADN que confirman la sonicación. Esto es en comparación con la banda sólida obtenida de un ADN no sometido a sonicación. A continuación, corte la porción de gel con el frotis de ADN fragmentado y purifique utilizando un kit de extracción de gel basado en columnas.
Mida la concentración del ADN purificado en el espectrofotómetro UV. A continuación, siga las instrucciones del fabricante y trate cinco microgramos de la plaquita con un microlitro de mezcla de enzimas de contundencia rápida. Luego inactivar la mezcla enzimática a 70 grados Celsius durante 10 minutos.
Para preparar el vector de filtrado, primero digiere cinco microgramos del vector de clonación purificado con enzima de restricción EcoRV. A continuación, cargue los vectores digeridos y no digeridos y el marcador molecular en un gel de 1% de agarosa. Luego, el calor inactivar la enzima de restricción a 80 grados Celsius durante 20 minutos.
A continuación, fosforilar el vector digerido con cinco unidades de enzima fosfatasa y 1/10 volumen del tampón de fosfatasa 10X. Luego incubar la mezcla a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego inactivar la enzima fosfatasa a 65 grados Celsius durante cinco minutos.
A continuación, extrae el plásmido del gel y purifica el ADN. A continuación, mida la concentración del ADN en el espectrofotómetro UV. Para realizar la reacción de ligadura, añada 400 nanogramos de las inserciones fosforiladas a un microgramo de vector digerido, tampón de ligasa de ADN 10X T4 y ligasa de ADN T4 a un volumen final de 100 microlitros.
Luego incubar la reacción de ligadura a 16 grados celsius durante la noche. Al día siguiente, el calor inactiva la ligasa a 65 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, agregue 1/10 volumen de tres molares de acetato de sodio a pH 5.2 y 2.5 volúmenes de 100%etanol para precipitar el producto de ligadura.
Para precipitar el ADN, mezcle los reactivos y congele a menos 80 grados Celsius durante 20 minutos. Después de 20 minutos, centrifugar a la velocidad más alta durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, expulse el sobrenadante.
Al pellet, añadir 500 microlitros de 70% de etanol frío y otra centrífuga. Deseche el sobrenadante al final de la centrifugación. Una vez que el pellet esté secado al aire, disolver el ADN precipitado en 10 microlitros de agua.
Antes de realizar la electroporación, organice el número adecuado de tubos de microcentrífuga y cubetas de electroporación de 0,1 centímetros sobre hielo. A continuación, agregue un microlitro del producto de ligadura purificada a 25 microlitros de las células. A continuación, pipetear el ADN, la mezcla celular a la cubeta de electroporación en frío y mover el tubo.
A continuación, limpie el agua del exterior de la cubeta y colóquela en la unidad de electroporación y golpee el pulso. Una vez finalizada la electroporación, agregue rápidamente un mililitro de medio líquido 2X YT sin ningún antibiótico a las células de la cubeta. Luego transfiera la mezcla celular a un tubo de 10 mililitros.
Deje el tubo en una coctelera a 220 revoluciones por minuto a 37 grados centígrados durante una hora. Placar las diluciones de la biblioteca en placas de agar de 10 centímetros 2X YT complementadas con cloramphenicol, ampicilina y sólo cloramphenicol. Esto es para obtener colonias individuales para ser probadas por PCR y para realizar la valoración.
A continuación, placar las células competentes transformadas en placas de agar de 15 centímetros 2X YT complementadas con cloramphenicol y ampicilina. Luego incubar las placas a 30 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, cuente las colonias eligiendo la dilución donde se pueden contar.
A continuación, calcule el tamaño de la biblioteca. El tamaño de la biblioteca se calcula de la siguiente manera, el número medio de colonias multiplica por el volumen total de la biblioteca. El tamaño de la biblioteca debe estar en el orden de 10 a la potencia de seis clones.
Si la concentración de ampicilina es óptima para realizar más filtrado, el número de clon se reduce a uno a 20 de los obtenidos en ausencia de este antibiótico. Para probar las colonias positivas, utilice una punta para recoger alrededor de 15 a 20 colonias individuales. Luego diluir las colonias con 100 microlitros de 2X YT medio sin antibióticos.
A continuación, PCR amplifica 0,5 microlitro del cultivo como plantilla de ADN con polimerasa de ADN Taq. Durante la PCR, ejecutar 25 ciclos de amplificaciones utilizando la temperatura de recocido de 55 grados Celsius y un tiempo de extensión de 40 segundos a 72 grados Celsius. Compruebe que la longitud de la plaquita está en el rango esperado de 150 a 750 pares base.
Y que diferentes colonias presentan diferentes inserciones con diferente tamaño. Esto indica una buena preparación de la biblioteca en términos de variabilidad. A continuación, agregue tres mililitros de medio 2X YT fresco a las placas de 150 milímetros para recoger las bacterias.
Luego cosecha las bacterias usando un rascador estéril. Después de mezclar bien, añadir 20%glicerol y dejar en menos 80 grados Celsius en alícuotas para uso futuro. Para su uso inmediato, realice un kit de extracción de plásmido basado en columnas para purificar el ADN plásmido de una de las alícuotas de la biblioteca antes de añadir glicerol.
Mida la concentración del ADN en el espectrofotómetro UV y luego almacene las muestras a menos 20 grados centígrados hasta su uso. Utilice 2,5 microlitros de la biblioteca como plantilla de ADN para amplificación de PCR. Establezca las condiciones del termociclador e inicie la carrera.
A continuación, utilice un kit de PCR de índice para realizar el PCR de índice. Esto secuenciará las bibliotecas indizadas dobles dentro de las ejecuciones de Illumina multiplexed. A continuación, establezca las condiciones del termociclador e inicie la carrera.
Después de la purificación con cuentas AMPure XP, para verificar el tamaño, ejecute un microlitro del uno a 10 dilución de la biblioteca final en el bioanalizador. A continuación, cuantifique seleccionando la región del seguimiento final de la biblioteca. Estas representaciones esquemáticas demuestran que después de la clonación en el vector de filtro P, sólo las colonias correspondientes a los ORF producen beta-lactamasa funcional en presencia de antibióticos.
Después de filtrar una disminución en el número de clon de 20 veces se espera. Con ORFs de buena carpeta creciendo a mayores concentraciones de antibióticos. Además, los fragmentos ORF se pueden recuperar fácilmente de la biblioteca filtrada.
Se construye una biblioteca ORF de fagos para realizar la selección de la pantalla del fago contra proteínas o anticuerpos diana. Todas las bibliotecas y las salidas obtenidas son analizadas profundamente por el NGS. El NGS proporciona una información completa sobre la diversidad de la biblioteca, la abundancia y el mapeo preciso de cada uno de los fragmentos seleccionados.
Por último, la webtool de búsqueda interactome desarrollada genera lecturas de secuenciación sin procesar que van a la lista de dominios putativos con anotaciones genómicas. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo construir y validar una biblioteca de dominio desde una fuente de ADN deseada. Y para realizar un examen de alto rendimiento de la biblioteca mediante la secuenciación de próxima generación.
Hemos optimizado la secuenciación de las bibliotecas de filtrado ORF con las plataformas Illumina y hemos desarrollado una webtool que hace posible el análisis de este tipo de datos sin necesidad de conocimientos de programación.
