Jennifer Deke ve Urszula Zarzenska onların bilimsel destek için teşekkür ederiz. Bu eser mali bir kariyer Tümleştirme Grant (çiğ, PCIG14-GA-2013-63 0734) tarafından 7 çerçeve programı, Litvanya-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung Hamburg) hibe ve DFG hibe (DFG KE 856_6-1) Avrupa Komisyonu tarafından desteklenen JK için verilmiştir.

1. örnekleme ve B. napus SAP'den phloem hazırlanması bitkiler 4,8,20
<ol><li>Örnekleme phloem sap için iyi sulanan 8-hafta-yaşlı kullanın B. napus polen contaminations önlemek için bu gösteri sadece ilk çiçekli bitkiler.</li>
	<li>Bir şırınga iğnesi kullanın (Ø 0.8 mm) ve punctate önümüzdeki birkaç kez kaynaklanıyor. Birkaç diğer önümüzdeki kaynaklanıyor ve yeterli phloem sap (şekil 2a) elde etmek için diğer bitkiler üzerinde yineleyin. Not: karmaşık analiz için phloem sap en az 600 µL ile başlatmak için önerilir. 4-5 bitkiler phloem sap 200 ila 700 µL arasında ortaya çıkarır.</li>
	<li>Filtre kağıdı ile yaralı sitelerden ilk damla yok etmek. Bu damlalar esas olarak yaralı doku çevreleyen yüksek oranda kirlenmiş malzeme içeren ve atılacak gerekiyor.</li>
	<li>Pipetting tarafından aşağıdaki damla toplamak ve toplanan çıktı önceden soğutulmuş konik 1,5 mL tepki tüp buz bir soğutma sistemi kullanarak-20 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Yok daha fazla damla oluşumu gözlemlenebilir ama 1 saat daha uzun kadar toplama devam. Bu yordamı, toplanan phloem sap önemli kaybı olmadan iki gün sonra tekrar edilebilir. Not: Toplanan phloem sap hemen kullanılabilir veya ilerideki analizleri için-80 ° C'de depolanan. -80 ° C depolama için şok-tepki tüp sıvı azot kıpırdama.</li>
	<li>Phloem örnek yaklaşık 1/6inci santrifüj yoğunlaştırıcıları (MWCO) 10.000 Dalton (Da) kesilmiş bir molekül ağırlığı ile kullanarak ilk birim için konsantre. Konsantre örnek 4 ° C ve 20.000 x g toz parçacıkları kaldırmak en az 15 dakika santrifüj kapasitesi. Not: Phloem sap toplama önemli bir protein kaybına yol açmaz.</li>
	<li>Daha sonraki karmaşık analiz için adım 3.1 ile devam edin.</li>
</ol>2. ters transkriptaz PCR (RT-PCR) 4,8,20 ile phloem sap saflık kontrolü
<ol><li>--Dan phloem su sıvı madde için standart bir RNA ayıklama yöntemini kullanan toplam RNA izole (örneğin TRIzol veya fenol kloroform çıkarma isopropanol yağış sulu faz ve adımları göre yıkama etanol tarafından takip üreticinin iletişim kuralı). Dikkat: Fenol kloroform zehirlidir. Uygun bireysel koruma araçları ile bir örtünün altında çalışır. Ayıklanan RNA etanol-80 ° C'de altı aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Dnaz ile sindirim tarafından DNA'ın kirlilik ben (1 u/µg) için 45 dk 37 ° C'de ve enzim için son bir konsantrasyon 5 mm EDTA ekleyerek devre dışı bırakın ve örnek için 10 dk. 75 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Saf RNA almak için arındırmak ve örnek bir arıtma adım (RNA Temizleme kitleri, üreticinin yönergelerine göre kullanarakörneğin ) tarafından konsantre ol.</li>
	<li>Ters transkriptaz PCR (RT-PCR) cDNA sentezi için 150 kullanarak cDNA sentez kiti ile gerçekleştirmek ng saf RNA'ın üretici tarafından açıklandığı gibi protokol. Not: CDNA-20 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklanır.</li>
	<li>CDNA 5 µL yuvası özel transkript yükseltmek ve özel Jel Elektroforez tarafından kontrol için üretici tarafından belirtildiği gibi standart bir PCR reaksiyon için şablon olarak kullanın. Phloem örnekleri saflığı örneğin rubisco küçük alt birimi, thioredoxin h ve polen kat protein (Şekil 1b, Tablo 1) için primerler kullanılarak onaylayın.</li>
</ol>3. mavi yerel sayfa 4,25,26,31
<ol><li>Ya kendi kendine döktü yerli degrade jelleri açıklandığı gibi başka bir yerde27 veya ticari Bis-Tris degrade jelleri kullanın.</li>
	<li>En az 20-30 µg yoğun protein örneği iyi jel üzerine başına triplicates yük.</li>
	<li>4 ° C ve 150 V jel çalışmasını Örnek 1/3rd jel (yaklaşık 20-30 dk, şekil 3a) geçti kadar koyu mavi katot tampon B ve anot tampon (Tablo 2) kullanarak. Not: Kuzey kurutma için bir tek jel lane, süre 3D sayfa ve kütle spektrometresi daha az bol protein konsantre olmaya en çok on jel şerit aynı gruptan birleştirmek için önerilen protein kompozisyon analizi için yeterlidir.</li>
	<li>Çalıştır duraklatmak ve ışık mavi katot ile Satım koyu mavi katot tampon B B/10 (Tablo 2) tampon ve Çalıştır devam. Mavi açık dışarı jel (ca. 120 ile 180 dk, şekil 3a) elute başladığında Çalıştır jel bitirmek. Not: Bitmiş mavi yerli jel en az bir hafta için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Uzun süreli depolama bantları diffüz yol açabilir ve kaçınılmalıdır. Koyu mavi arabellek B yeniden kullanılabilir.</li>
</ol>4. isteğe bağlı: Mavi yerel Kuzey kurutma 4 kullanarak RNA tespiti
<ol><li>Farklı bantları kesip veya tüm jel şeritli mavi yerli jel gelen kullanın onları yarı kuru 3,5 mA/cm2 60 dk için kurutma tarafından bir naylon membran transfer ve membran (şekil 4a) üzerinde bir kalem ile alt ve üst jel sınır işareti.</li>
	<li>Kurutma sonra membran DEPC tedavi su ile yıkayıp kurulayın arasında iki filtreyi bildiri.</li>
	<li>UV-zenginlikte membran ile 120.000 µJ/cm2 polietilenin gerçekleştirmek (85 Crosslinker Malzemeler tablokullanıyorsanız s).</li>
	<li>Membran hibridizasyon fırında (şekil 4a) 68 ° C'de 60 dk için hibridizasyon arabellek (ticari veya kendi kendine yapılan) 6 mL ile önceden melezlemek.</li>
	<li>Hibridizasyon arabellek 3'-biotinylated sondalar 4 µL içeren bir ek 1 mL ekleyin (100 nM).</li>
	<li>Membran ile probe gecede, 68 ° C fırında 37 ° C'ye soğutma kuluçkaya</li>
	<li>Membran unspecifically bağlı probları kaldırmak için oda sıcaklığında 5 min için 2 x SSC ve % 0.1 SDS içeren bir arabellek ile yıkayın. Dikkat: SDS tahrişleri neden olabilir. SDS ve çözümler içeren SDS ile çalışırken eldiven ve önlük giymek.</li>
	<li>3'-biotinylated sondalar tespiti membran örneğin Streptavidin-HRP-eşlenik ve luminol ile hassas bir chemiluminescent reaksiyon (şekil 4a) kaynaklanan bir horseradish peroksidaz (HRP) substrat olarak gerçekleştirin.</li>
</ol>5. ikinci Boyut: Tris-Tricine-üre sayfa 4,28
<ol><li>Mavi yerli jel tek grup tüketim. Paralel şerit karmaşık proteinleri (şekil 5) daha fazla konsantrasyon ulaşmak için çalıştırmak örnekleri grup birleştirin. Not: 4 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar tek tepki tüplerde eksize gruplarından saklanabilir</li>
	<li>% 12 Tris-Tricine-üre jel dökmek (kalınlığı 1 mm, 6.8 cm x 8,6 cm (genişlik x uzunluk)). 10 mL jel çözeltisi A ayıran jel (Tablo 2), için hazırlamak pour iki cam levha ve yerleşimi ile isopropanol arasında. Ve 4 mL jel ve 10 de tarak Ekle üzerine jel çözeltisi B (Tablo 2) yığın jel için transfer polimerizasyon tamamlandıktan sonra isopropanol çıkarın. Dikkat: Unpolymerized Akrilamid Nörotoksik olabilir ve TEMED Eğer inhale zararlıdır. Her zaman bireysel koruma araçları giymek ve bir başlık altında çalışma.</li>
	<li>Eksize jel bantları 1,5 mL tepki tüp içine aktarmak ve SDS örnek arabellek için denge jel adet (şekil 5, Tablo 2) x 2 1 mL ekleyin.<ol>
<li>Örnekleri, oda sıcaklığında (95 ° C) bir Isıtma blok veya bir mikrodalga kaynar önce 10 min için kuluçkaya ve başka bir 15 dakika oda sıcaklığında tekrar örnekleri kuluçkaya.</li>
		<li>Aynı kompleks bir tek jel cebine temsil eden birkaç dengelenmiş jel adet yığını.</li>
		<li>Anot ve katot arabellekleri koşma vasıl 150 V 45-60 dk kullanarak Elektroforez gerçekleştirmek ve bütün jel lane tüketim.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asidik arabellek (100 mM Tris, 100 mM Asetik asit) içinde 20 dk için kesme şerit kuluçkaya ve 125 mm Tris-HCl, pH 6.8 için başka bir 20 dk (şekil 5) equilibrate.</li>
</ol>6. üçüncü Boyut: SDS-sayfa 4,32
<ol><li>Jel Laemmli32 göre ayıran bir % 15 SDS dökün (kalınlığı: 1.5 mm, 6.8 cm x 8,6 cm (genişlik x uzunluk)) (Tablo 2) ve ince bir tabaka halinde % 4 jel yukarıdaki istifleme ekleyin. Dikkat: SDS, Akrilamid ve TEMED zehirli ve zararlı. Bir başlık altında iş ve kişisel koruyucu donanımları.</li>
	<li>Dengelenmiş jel lane SDS jel üzerine transfer ve jel bromophenol mavi (şekil 5) izleme ile desteklenmiş arabellek çalışan 1 x SDS % 0,5 (w/w) özel ile kaplayın.</li>
	<li>Arabellek önceden jel yükleme özel mikrodalga ile çalışan SDS kaynatın.</li>
	<li>Moleküler ağırlık tek bileşenlerinin tahmin etmek için bir protein marker çalıştırmak, özel katılaşmış kadar jel bir ucunda filtre kağıt yerleştirin veya genellikle IPG jeller için kullanılan özel bir tarak kullanın.</li>
	<li>Jel 150 V 60 dk ve leke için çalıştırılacak jel ile kolloidal Coomassie, gümüş leke veya herhangi bir diğer yöntemi daha sonraki kitle spektrometrik analiz için uygun boyama.</li>
	<li>Matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma gibi kitle spektrometrik yaklaşımlar kullanarak görünür protein noktalar analiz zaman uçuş (MALDI-TOF) veya LC-MS/MS kütle spektrometresi. Not: Zaten olarak açıklanan33boyama kolloidal Coomassie kullanmak için önerilir. Bizim ellerde daha az bol protein yeterince Boyanabilen ve makul veri kalitesiyle bir kitle spektrometrik analiz sağlar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symplasmic+connections+between+sieve+element+and+companion+cell+in+the+stem+phloem+ofVicia+faba+L.+have+a+molecular+exclusion+limit+of+at+least+10+kDa.">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li><li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots.">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li><li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues.">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li><li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes.">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li><li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -. P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+Transit:+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts.">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li><li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li><li>Lin, M. -. K., Lee, Y. -. J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function.">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li><li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap.">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li><li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants.">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li><li>Dinant, S., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+and+Analysis+of+Phloem+Sap.">Sampling and Analysis of Phloem Sap.</a> Plant Mineral Nutrients. 953, 185-194 (2013).</li><li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+obtaining+Phloem+Sap+via+the+Mouth-parts+of+Aphids.">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528 (1953).</li><li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents.">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li><li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution,+glutathione,+and+glutathione+reductase.">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li><li>Dinant, S., Bonnemain, J. -. L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding.">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li><li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method.">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111 (2013).</li><li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+(Solanum+lycopersicum).">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li><li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+(Lupinus+albus+L).">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36 (2011).</li><li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+(Lupinus+albus+L.).">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li><li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants.">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li><li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus.">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li><li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome.">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li><li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap.">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li><li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements.">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li><li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-C&#225;zares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA:+implications+for+supracellular+regulation+in+plants.">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164 (2011).</li><li>Rais, I., Karas, M., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification.">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li><li>Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-SDS-PAGE.">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Eubel, H., Braun, H. -. P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-native+PAGE+in+plants:+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions.">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11 (2005).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+traffic+in+the+fast+lane:+long-distance+signalling+by+macromolecules.">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li><li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate.">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li><li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+(Q-TOF)+mass+spectrometry.">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li><li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins.">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li><li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes.">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li><li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+sap+proteins:+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects.">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li><li>Ham, B. -. K., Brandom, J. L., Xoconostle-C&#225;zares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polypyrimidine+tract+binding+protein,+pumpkin+RBP50,+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex.">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation.">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Photoassimilates için ana ulaşım yol teşkil eder ve aynı zamanda uzun mesafe farklı bitki parçaları9,20,34arasındasinyal için önemlidir beri phloem bir kompartıman yüksek ilgi var, 35. Küçük moleküller yanı sıra oluştururlar protein ve RNA gibi phloem bakım ve sinyal4,7,8ile karıştığı olmuştur. Phloem kompozisyon analizi tarafından sınırlı erişilebilirlik çoğu bitki türü phloem örnekleri için sınırlıdır. Böcek stylet tekniği yaygın olarak uygulanabilir, ancak deneysel olarak talep ve phloem örnekleri11çok küçük miktarlarda. Phloem örnekleme için kullanılan bir kolay EDTA kolaylaştırdı reaksiyon12tekniğidir. EDTA divalent iyonları kalsiyum gibi chelates ve böylece P-proteinler ve callose elek plakaların kapanış engeller. Bu kullanımı kolay, ancak kirlenme hasarlı hücreleri tarafından eğilimli ve örnekleri seyreltilmiş. EDTA tarafından divalent iyonları tüketen da varolan kompleksleri bir arıza neden olabilir. Ancak, örnekleme tür model bitki A. thaliana15dahil geniş bir dizi sağlar. İn phloem su kendiliğinden reaksiyon yalnızca az sayıda bitki türleri içinde oluşur. Bitki doku10önemli yaralanma içerir invaziv bir yöntemdir. Son zamanlarda şehirlerarası ulaşım4,8,20eğitim için bir modeli tür olarak B. napus kurulmuş. Burada, phloem sap küçük kesik, yaralama etkileri ve kirlenme kaynakları azaltan tatmak mümkündür.
Farklı örnekleme teknikleri kullanarak, farklı bitki türü phloem örnekleri Proteom son yıllarda7,8,17,36,37içinde, araştırmış 38,39. Bu Proteom çalışmalar için proteinler çıkarılan ve koşulları denaturing altında çöktürülmüş ve bu nedenle protein: protein ve protein hakkında sonuçlar izin verme: nükleik asit etkileşimleri mevcut yerel koşullar altında. Co-immunoprecipitation (COIP) ve bindirme deneyleri belirtilen büyük Ribonükleoprotein karmaşık phloem sap kabak40mevcut, ama o herhangi bir makromoleküllerin kompleksleri içinde yerel koşullar altında bulunduğunu gösterilmiştir değil phloem sistemi.
Schägger ve ark. tarafından tanıtılan mavi yerel sayfa 26, sonraki yüksek çözünürlüklü Jel Elektroforez adımları ile birlikte büyük protein kompleksleri her bileşeninin ayrılması etkinleştirin. Yerel B. napus 3D-sayfa analizleri kullanarak phloem çıktı, biz son zamanlarda göstermek birkaç yüksek molekül ağırlıklı protein: protein ve RNP kompleksleri phloem örnekleri var ve enzimatik aktif4vardır. RNPs yanı sıra protein kompleksleri boyutu dışlama Kromatografi gibi izole etmek için alternatif yöntemler var ama BN-sayfasına göre çözünürlük açısından başarısız. Ayrıca, karmaşık ayrılık makul kalitesi için boyutu dışlama sütun matrisler soruşturma altında genel olarak karmaşık moleküler ağırlık göre adapte olmak zorunda. Farklı büyüklükte konut projeleri analiz bu nedenle yoğun maliyet ve BN sayfası olarak yüksek odaklama gücü olarak izin vermez sütunları farklı türde talep edecek.
Kompleksleri B. napus üzerinden analiz etmek için kritik adımlar phloem sap malzeme başlangıç olarak kullanılan toplam miktarı içerir. Phloem örneği en az 600 µL gerekli olan ve beş iyi sulanan bitkilerden elde edilebilir. 3D-sayfa ve BN Kuzey kurutma için ilk BN jel phloem örnekleri yeterli miktarda ile başlatmak gereklidir. 20-30 µg protein her içine de ve en az yüklenebilir kadar bunu başarmak için phloem örnekleri triplicates aynı örneği paralel olarak çalıştır yoğunlaşmıştır. Çok düşük veya çok yüksek konsantrasyonları kompleksleri (şekil 3) algılanmasını azaltır. Phloem örnekleri içine buz üzerine tepki boruları toplanması ve daha sonra kullanmak üzere protein yıkımı ve ciro önlemek donmuş muhafaza edilmelidir. Proteaz inhibitörleri analiz bütün phloem proteomes bulduk, ama aynı zamanda tam etkin bir proteasome B. napus4phloem içinde tanımlanmıştır. Ayrıca, birim ve phloem örnekleri bileşimi örnekleme süresi-noktası ve çevre koşulları10bağlıdır. Bu nedenle benzer koşullar altında günün aynı zamanda toplamak için özen göstermelidir. Stres Tedaviler (örneğin kuraklık) toplanabilir phloem miktarını azaltabilirsiniz. Tek proteinler tarafından kütle spektrometresi tanımlamak için olası keratin contaminations tarafından giyen eldiven her zaman sınırlamak için zorunludur. Keratin ek sinyallere kitle spec Çözümleme sırasında yol açar ve protein kimlik engellemektedir. BN-sayfa daha yüksek bir voltaj veya ortam sıcaklığı çalışan Isıtma kırılgan kompleksleri sökme içinde sonuçlanabilir jel yol açabilir.
Burada sunulan Protokolü protein: protein kompleksleri analiz için uygundur. Ayrıca paralel komplekslerinde yer alan belirli RNA'ların algılamak için kullanılabilir gösterir. Bunu başarmak için biz yeni bir protokol BN4kurutma Kuzey tanıttı. RNA'ların RNAse contaminations tarafından bozulması yatkındır. Bu tür bozulma sınırlamak için DEPC-tedavi, su kullanılmalıdır.
Sunulan yönteminin ana sınırlamalarını boyut, şekil ve ardından değişiklikleri kompleksleri31bile geçiş davranışını bağlıdır beri BN-PAGE tarafından ayrılmış protein kompleksleri molekül ağırlığı tahmini dahil, 41. RNP kompleksleri boyut tahmini nükleik asitler etkisi geçiş davranışı nedeniyle daha karmaşıktır. Bu da kompleksleri aynı boyutta bir tek grupta birlikte geçirmek önlenebilir değil. Bu karmaşık besteleri hatalı tahmin için yol açabilir. Bu nedenle tamamlayıcı teknikleri ile gözlenen etkileşimleri doğrulama, örneğin fonksiyonel deneyleri4,-ebilmek var olmak gerekli. Ayrıca sadece zayıf veya geçici bir makromoleküllerin karmaşık ilişkili proteinler kullanılan BN arabellekte kaybetmiş. Bunu önlemek için örnekleri çapraz, ne de eserler neden olabilir ya da protein tanımlama, engel olabilir veya arabellek koşulları optimize edilebilir.
Klasik 2D-sayfa, aksine kasanın üre SDS sayfa, hydrophobicity ve molekül ağırlığı isoelectric noktası (PI) ve molekül ağırlığı 28yerine göre ayırma verir ve proteinler için ayırma sınırı yok bir belirli pI aralığı. Benzer Klasik 2D sayfa, ayrılmış proteinler, ama tek noktaları olarak görünür bir çapraz çizgi 4,28 (şekil 5, şekil 6). Hidrofilik proteinler daha satır28bulunur, ancak daha fazla hidrofobik proteinler bu çapraz, yukarıda noktalar görünür. Bu protokol için kullanılan polyacrylamide konsantrasyonları proteinler arasında 25-80 kDa de ayıracak. Bir ayrılık daha küçük veya daha büyük proteinlerin polyacrylamide izin vermek için konsantrasyon değiştirilebilir veya Degrade jelleri üçüncü boyutu kullanılabilir. 3D-sayfa (şekil 6) tarafından ayrılmış bileşenleri karmaşık IV (şekil 3) dışarı, sindirmek ve kütle spektrometresi tarafından analiz tripsin kesilmiş. Bu birkaç tRNA ligazlar tanımlaması içinde sonuçlandı. Diğer kompleksleri bileşenlerinin olmuştur son 4yayınlandı. 3D SAYFAMIZI farklı ligazlar, yani aspartat, asparagine, treonin, benzer moleküler ağırlıkları (Tablo 3) ile lizin ve glisin ligazlar ayrılması etkin. Metiyonin tRNA özgü sonda kullanarak, biz karmaşık IV içinde potansiyel olarak ilişkili tRNA algılamak başardık, ama tam uzunlukta tRNA veya tRNA parçaları karmaşık ise kullanılan problar ile ayrımcılık yapamam. Nükleik asitler gerçekten kompleksi içinde ilişkili ve eş geçirme iseniz, proteaz phloem sap sindirilmiş kontrol etmek için örnekleri uygun geçiş denetimleri hizmet verebilir.
Bu daha önce hemen hemen çoğu bileşen tüm ribozom hem de uzatma faktörlere phloem örnekleri4,7' bulduğumda protein çeviri phloem elek tüpler içinde oluşabilir spekülasyonlar. Bizim bulma tRNA ve tRNA ligazlar bu fikri destek gibi görünüyor. Ancak, tRNA parçaları kabak phloem örnekleri mevcut çeviri42 güçlü inhibitörleri olduğu gösterilmiştir ve fonksiyonel ribozomlara çeviri yer alamaz düşündüren4, görünmektedir.
Birlikte ele alındığında, burada sunulan Protokolü yerli protein: protein ve phloem örnekleri ve ayrılık bile RNP kompleksleri ayrılması ve yüksek çözünürlüklü bireysel bileşenleri tanımlaması sağlar. Bu yöntemin uygulama keşif phloem örneklerinde RNP kompleksleri ve roman protein sağlar ve bu nedenle bu çok özel bitki yerde yeni işlevler aydınlatmak.

Phloem uzun mesafe hatları daha yüksek bitkilerde organik besin tahsisi için gerekli olan, ama aynı zamanda birçok farklı işlemler önemli büyüme ve kalkınma, patojen savunma ve adaptasyon için olumsuz düzenlenmesinde katılmaktadırlar çevre koşulları. İyonlar, etki veya metabolitleri kendileri gibi küçük effectors yanı sıra oluştururlar protein ve RNA gibi son zamanlarda potansiyel sinyaller olarak ortaya çıkmıştır.
Çalışmalar proteinlerin phloem yükleme boyutu bağımlı ve dışlama boyutunda (SEL) eşlik eden hücreler (CC) bağlanma gözenek plasmodesmal birimleri tarafından kontrol olduğunu göstermiştir ve elek genellikle 10 aralığındaki öğeleri (SE) > 67 kDa1 , 2 , 3. ancak, rağmen bu boyutu sınırlamaları daha büyük protein ve protein kompleksleri boyutu dışlama4fikri zor phloem sistemi içinde bulundu ve se CC den proteinlerin bile nonspesifik kaybı önerilen5 oldu .
Multiprotein gibi büyük Ribonükleoprotein kompleksleri içinde biyosentezi ve hücre6yapısal bütünlüğünü korumak çok önemli rol oynarlar. Phloem-mobil protein-protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri4,7, mevcut kanıt ama bugüne kadar onların işlevi hakkında az şey bilinmektedir. Phloem elek elemanları uzun mesafe taşımacılığı ve / veya sinyal8,9ile protein: protein ve RNP kompleksleri karıştığı. Değişen altında çevre onların kompozisyon translocated kompleksleri fonksiyonları çözmek veya stres koşulları gereklidir. Bunu başarmak için yerel kompleksleri izole olmak zorunda ve bileşenlerinin yeterli çözünürlükte ayrılması gerekiyor.
Yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri phloem dan izole etmek için yeterli kalite ve miktar sap örneklerini almak için ilk gerekli olduğunu. Phloem örnekleme için kullanılan teknik faiz bitki türü üzerinde bağlıdır. Phloem su elde etmek için üç ana yöntem mevcut 10: böcek stylectomy11, EDTA kolaylaştırdı reaksiyon12ve spontan reaksiyon13.
Phloem örnekleri Arabidopsis thaliana (A. thaliana), laboratuvarlar dünya çapında, büyük modeli fabrikasında sadece EDTA kolaylaştırdı reaksiyon veya yaprak biti stylectomy14,15tarafından elde edilebilir. Her iki yöntem son derece seyreltik phloem sap veya çok düşük örnek tutarlar için yol. EDTA kolaylaştırdı reaksiyon da kontaminasyon için eğilimli ve gerçek phloem kompozisyon16gösterebilir değil. Spontan phloem reaksiyon nereye çıktığını bitki parçalar keserek kolayca toplanan13,17,18olabilir phloem sap spontan bir emisyon için cucurbits, lupine veya avize, gibi tür bitki sınırlıdır, 19. Son zamanlarda phloem analiz için uygun modeli sistemi olarak yağlı tohum tecavüz (Brassica napus) kurulmuş, ondan beri onun ' A. thaliana yakın akrabası ve birkaç microliters in phloem su için gösterilen küçük insizyon elde edilebilir yüksek saflıkta4,8,20olması. Ayrıca, B. napus genom sırası 201421yılında yayımlanmıştır.
Yaprak biti stylectomy dışında doku örnekleme sitesinde çevreleyen zarar açıklanan tüm phloem toplama yöntemleri içerir ve phloem sap bileşimi yaralanma yanıt olarak değişebilir. Bu nedenle phloem örnekleri, ne olursa olsun uygulanmış örnekleme kalitesini kontrol etmek için esastır. Toplanan phloem sap, örneğin belirlenmesi RNase etkinliği22,23, RT-PCR ile astar Rubisco8,24karşı veya şeker analizi tarafından kalite kontrolü için farklı yöntem vardır kompozisyon8.
Yalıtmak ve protein kompleksleri ayırmak için farklı yöntemler uygulanabilir, boyutu dışlama Kromatografi, sukroz yoğunluğu ultrasantrifüj veya örnek filtrasyon farklı molekül ağırlığı kesim ile membranlar yoluyla dahil olmak üzere off. Ancak, bu yaklaşımların yüksek çözünürlüklü izin vermez. İlk Schägger ve arktarafından açıklanan mavi yerel sayfa (BN SAYFALIK) olarak adlandırılan teknik. 25, çözünürlük açısından üstün. Bu şekilde büyük yerli protein kompleksleri çeşitli organelleri veya hücresel lysates ve onların göreceli zenginliği26,27moleküler ağırlıkları belirlemek için kullanıldı.
Daha fazla protein kompleksleri karmaşık bileşimi aydınlatmak için koşullar, karmaşık bileşenleri tam demontaj için önde gelen denaturing altında tek tek bileşenleri ayırmak gereklidir. Bu ikinci boyutu SDS-sayfa 28,29 veya isoelectric (yardımcı) odaklanan ikinci bir boyuta göre ardından SDS-sayfa30 third dimension ve sonraki tanımlaması daha yüksek çözünürlük elde etmek için elde edilebilir Kütle spektrometresi kullanılarak proteinler.
Bu protokol için saf phloem sap B. napus bitkilerden örnekleme ve protein kompleksleri BN-sayfa Tris-Tricine-üre-sayfa ve SDS-sayfa ile birleştiren bir 3D elektroforetik yaklaşım kullanarak böyle phloem örneklerinden analizini açıklar. Ayrılmış protein karmaşık bileşenleri daha sonra kütle spektrometresi kullanılarak tanımlanır. Buna ek olarak, biz mavi yerel Kuzey büyük RNP kompleksleri4' te, RNA'ların algılanmasını sağlayan bir yöntem olarak kurutma tanıtmak yaklaşımının uygulanabilirliği genişletme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 % Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>141101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxodisulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography papers e.g. 3 mm CHR</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolBox M30 System</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>BCS-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant Blue G-250</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs.</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kb plus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>141339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block TS1</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>846-051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601</td>
			<td>GFL</td>
			<td>7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle (0.8 mm)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4658309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPG gel comb, thickness 1 mm</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling of RNA e.g.Biotin 3&#39;end DNA Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4&#8211;16% Bis-Tris protein gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN1002BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane e.g. Hybond-N+</td>
			<td>Amersham Pharmacia</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortho-phosphoric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for Gel electrophoresis EPS</td>
			<td>Amersham Pharmacia</td>
			<td>18-1130-01</td>
			<td>available from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>846-015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>142363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>NC0477671</td>
			<td>from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific or BioRad</td>
			<td>EI0001 or 1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phloem sap sampling from brassica napus for 3d-page of protein and ribonucleoprotein complexes

Phloem daha yüksek bitkilerin örnekleme kez zahmetli ve önemli ölçüde bağlı olarak bitki türü. Ancak, koşullar denaturing altında Proteom çalışmaları farklı bitki türü içinde elde edilebilir. Yerli protein: protein ve protein: nükleik asit kompleksleri phloem örneklerinden henüz pek analiz, her ne kadar onlar bu özel bölümü bakım veya uzun mesafeli sinyal önemli roller oynamak. Büyük moleküler gruplar mavi yerli Jel Elektroforez (BN-sayfa) kullanarak ayrılmış olabilir. Protein bileşenleri bir sonraki Sodyum Lauryl Sülfat (SDS-sayfa) tarafından ayrılabilir. Ancak, protein benzer moleküler ağırlıkları ile ne tarafından kütle spektrometresi protein kimlik engel olabilir ortak göç eder. İki farklı denaturing Jel Elektroforez adımları ile yani Tris-Tricine-üre ve SDS-sayfa, BN-sayfa birleştirerek proteinler onların hydrophilicity/hydrophobicity göre ek ayrılması sağlar ve böylece çözünürlük ve başarı artırır protein tanımlaması. Hatta sadece onların ardından değişikliklerini farklı proteinler ayırt sağlar. Ayrıca, mavi yerel Kuzey kurutma makromoleküllerin komplekslerinde RNA bileşenlerini belirlemek için uygulanır. Bizim iletişim kuralı protein ve RNA bileşenlerini yerli protein: protein ve phloem örneklerinde meydana gelen Ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri çözülmeye uygun olduğunu göstereceğiz. Bir mavi birleştirerek iki farklı denaturing sayfa adımlar ile yerel sayfa büyük protein kompleksleri farklı türde ayırmak için yardımcı olabilir ve ayrıca tarafından kütle spektrometresi bileşenlerinin bir artan tanıma oranı sağlar. Ayrıca, aynı anda tek protein kompleksleri içinde potansiyel olarak ilişkili nükleik asitler algılamak için sağlam bir protokoldür.

Burada protein: protein analizi sağlayan bir protokol mevcut yanı sıra protein: RNA kompleksleri Brassica napusphloem örnekleri içinde. İş akışını şekil 1' de gösterilmiştir. B. napus diğer canlılar bir büyük avantajı nispeten kolay phloem örnek koleksiyon önümüzdeki kök küçük delikler imkanı vardır. Bu saf phloem örneklerini nispeten büyük miktarda almak için sağlar. Phloem örnekleme zaman, her zaman contaminations için örneğin RT-PCR8tarafından kontrol etmek için tavsiye edilir. Saf phloem örnekten elde edilen bir temsilcisi sonuç Şekil 2' de tasvir edilir. Sinyal rubisco ve polen kat protein için görünmelidir ise sigara-kirlenmiş phloem örnekleri thioredoxin h, görünür bir bantını göstermelidir. Rubisco küçük alt birim bir denetim yaprakları, örnekleri olarak hizmet verebilir önümüzdeki kaynaklanıyor olsa veya polen. Polen kat protein transkript sadece çiçek tomurcuk örneklerinde görünür gerekirken onun mRNA farklı tür, phloem içinde bulundu beri Thioredoxin h tüm örnekleri, tespit olmalıdır. Contaminations phloem örnekleme tam çiçekli bitkiler (polen kat protein) veya delikler örnekleme phloem gelen ilk damlacıkları düzgün atılır değil gerçekleştirildiğinde oluşabilir (rubisco).
BN-sayfa önce phloem sap konsantre zorunluluğu vardır. 20-30 µg protein iyi kullanarak, en az dört büyük protein karmaşık bant B. napus phloem sap, çok düşük BN sayfa sonra görünür hale gelir veya çok yüksek konsantrasyonda kompleksleri (şekil 3) net bir ayrım izin vermiyor. Bu aynı kompleks bir tek cep daha da aşağı akım işleme ve sonraki kitle spektrometrik kimlik tek her karmaşık gelen proteinler konsantre için ikinci boyut jel içine temsil eden birkaç jel bantları yüklemek için tavsiye edilir.
Phloem makromoleküllerin kompleksleri bireysel bileşenlerini belirlemek için biz ilk BN SAYFALIK bir ikinci boyut Tris-Tricine-üre ile kombine ve bir üçüncü bir ayrılık tek protein elde etmek için SDS-sayfa boyut. Burada, yüksek çözünürlüklü bir ayrılık nedeniyle de üre ve SDS-sayfa jelleri farklı protein geçiş davranışları görülebilir. Genellikle, proteinler için tek bir kompleks ait jel arasında çapraz bir çizgi görünür. Proteinler sınırının altında daha hidrofilik olanlar28 (şekil 5, şekil 6) temsil ise proteinler bu çizginin üzerinde artan bir hydrophobicity var.
RNP kompleksleri karakterizasyonu için BN Kuzey kurutma gerçekleştirmek için BN-sayfa jel bir parçası kullanılır. Bütün sokağın üstüne bir naylon membran ve çapraz UV radyasyon kurutma sonra RNA RNA özgü probları şekil 4' te gösterildiği gibi kullanarak görüntülenmeyecektir. Burada belirli bir tRNA sadece belirli bir kompleks mevcuttur gösterilir. Bu tRNA-bağlama kompleks protein bileşenleri yukarıda açıklanan 3D jel yaklaşım kullanarak daha fazla araştırılması. Kitle spektrometrik analizi bu tesis ne BN Kuzey Blot tarafından bulundu tRNA bağlama etkinliği onaylar özellikle tRNA ligazlar içerir gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig1.jpg"> Şekil 1: iş akışı Ribonükleoprotein kompleksleri analiz yağlı tohum tecavüz phloem sap. Örnekleme ve phloem örnekleri hazırlanması sonra BN-sayfa yerel kompleksleri ayırmak için gerçekleştirilir. Böyle BN-sayfa jelleri nükleik asitler BN Kuzey Blot tarafından paralel analizi ve kütle spektrometresi tarafından kompleksleri protein bileşenlerinin tanımlaması izin verir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig2.jpg"> Şekil 2: örnekleme ve saflık kontrolü B. napusözlerinin phloem. 8-10 haftalık yağlı tohum tecavüz bitkiler steril bir şırınga iğnesi ile önümüzdeki kök delinme sonra çıktı bir pipet ile toplanır ve RT-PCR gerçekleştirilen phloem örnekleri saflığı onaylamak için bir buz gibi tepki tüp için (a) transfer, thioredoxin h, rubisco küçük alt birim ve polen kat protein özel doku örneklerinde (b) transkriptaz olmadan RT-PCR transkript yükseltecek denetimi (-) olarak gerçekleştirildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig3.jpg"> Şekil 3: BN-sayfa. Mavi yerel sayfa şematik gösterim konsantre phloem örnekleri ile B. napus. (a) 15-20 µL in konsantre phloem su ile degrade protein jel yükleme sonra BN-sayfa 1 x koyu mavi katot arabellek B 150 V 20-30 dk soğuk bir odada ile gerçekleştirilir. Daha sonra arabellek karşı 1 x ışık mavi katot tampon B/10 değiştirilir ve sayfa açık çalışır jel dışında çalışan koyu mavi kadar 150 V 120-180 dakika bitti. BN-sayfa jelleri dört farklı yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri temsil eden dört farklı bant göster. (b) (c) çok az veya çok fazla (d) phloem proteinler yükleniyor bireysel kompleksleri görünürlüğünü azaltır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig4.jpg"> Şekil 4: BN Kuzey Blot. BN Blot yöntemi Kuzey şematik gösterimi. (a) bir lane BN sayfasının naylon membran yarı kuru Blot tarafından aktarılır. UV-çapraz ve öncesi hibridizasyon sonra membran biotinylated hibridizasyon fırında 3'-son gece boyunca olan RNA belirli problar (burada metiyonin tRNA özgü sonda), ile inkübe. Ücretsiz probları adımları yıkayarak kaldırılır ve RNA tespiti streptavidin-HRP eşlenik ve luminol tarafından yapılmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, biz BN sayfasından karmaşık IV metionin içerir gözlenen tRNA. (b) lekeli Coomassie jel ve tRNA leke geçiş farklılıkları önlemek için paralel olarak çalıştır iki farklı jel şeritli benzer. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig5.jpg"> Şekil 5: 3D-sayfa. 3D-sayfa yaklaşım şematik gösterimi. Aynı kompleks birkaç grup BN-sayfa jel eksize, arabellek yüklenirken inkübe ve ikinci boyutu Tris-Tricine-üre-sayfa bir kuyunun içine aktarılır. Elektroforez sonra bütün jel şerit kesip, asidik asit arabellekte yıkanmış, equilibrated ve % 15 SDS-sayfa jel yerleştirilir. Üçüncü boyut sayfa sonra lekeli ve kütle spektrometresi tarafından analiz Coomassie ayrılmış proteinlerdir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57097/57097fig6.jpg"> Şekil 6: temsilcisi sonuçlar 3D-sayfa sonra. İlk boyut BN-sayfa içinde birkaç kompleksleri ortaya çıktı. Protein bileşenleri daha fazla bir diyagonal nokta şeklinde sonuçlanan iki sonraki denaturing sayfaları tarafından ayrılmış. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57097/57097fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sonda</td>
			<td>Sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thioredoxin h</td>
			<td>
 İleri: CTCAAGGCAGCCAAAGAATC geriye doğru: ATGGCCTGAACATCGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rubisco küçük bir zincir</td>
			<td>
 İleri: TTCACCGGCTTGAAGTCATC geriye doğru: CCGGGTACTCCTTCTTGCAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polen kat protein BRU77666</td>
			<td>
 İleri: TCAGAACTGGAGCTTCAACG geriye doğru: TTCCTTAATGGCCTCAGTGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: phloem örnek saflık kontrolü için kullanılan astar. Phloem örnek saflık onaylamak için astar rubisco küçük bir zincir, thioredoxin h ve polen kat protein için özel cDNA amplifikasyon için kullanılabilir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Arabellekleri ve çözümleri</td>
			<td colspan="2">İçerik</td>
			<td>Yorum</td>
		</tr>
<tr>
<td>koyu mavi katot arabellek B</td>
			<td colspan="2">15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine %0,02 (w/v) Coomassie mavi G250</td>
			<td>tarifi Fiala vd. 17 uyarlanmıştır pH 7,0 için ayarlanması gereken Arabellek 10 x stok olarak yapılabilir</td>
		</tr>
<tr>
<td>hafif mavi katot arabellek B/10</td>
			<td colspan="2">15 mM Bis-Tris pH 7,0 50 mM Tricine %0,002 (w/v) Coomassie mavi G250</td>
			<td>Arabellek katot katot arabellek Coomassie olmadan B önbellekle sulandrarak hazır olun</td>
		</tr>
<tr>
<td>anot arabellek</td>
			<td colspan="2">
 50 mM Bis-Tris pH 7,0</td>
			<td>Arabellek 10 x hisse senedi çözüm olarak hazırlanan</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS örnek arabellek x 2</td>
			<td colspan="2">
 125 mM Tris-HCl pH 6.8 %4 SDS % 20 gliserol 0,2 M DTT %0,02 (w/v) bromophenol mavi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Aktarım arabellek 1 x TBE arabellek</td>
			<td colspan="2">
 89 mM Tris pH 7,6 89 mM Borik asit 2 mM EDTA</td>
			<td>TBE tampon yapılan ve 5 x veya 10 x hisse senetleri depolanan. Kullanım RNase free deiyonize su için önemlidir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>SSC arabellek x 2</td>
			<td colspan="2">
 300 mM NaCl 30 mM Na3sitrat pH 7,0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 x jel arabellek</td>
			<td colspan="2">
 3 M Tris 1 M HCl %0,3 SDS pH 8.45</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine jel çözüm A</td>
			<td colspan="2">
 10 mL için: % 30 Akrilamid-bisacrylamide (29:1) 3.34 mL 6 M üre 3 x jel arabellek 3.34 mL % 70 gliserol 1.4 mL GKD2O 10 mL için eklemek % 10 APS 40 ΜL TEMED 4 ΜL</td>
			<td>6 M üre ağırlık ve 3 x jel arabellek, Akrilamid-bisacrylamide çözüm ve % 70 gycerol ekleyin. Üre solubilize için bir su banyosunda 60 ° c ısı. GKD2O 10 mL, % 10 ekleyin APS ve nihayet TEMED polimerizasyon için.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine jel çözüm B</td>
			<td colspan="2">
 6 mL için: % 30 Akrilamid-bisacrylamide (29:1) 0.8 mL 6 M üre 3 x jel arabellek 1,5 mL GKD2O 6 mL için eklemek % 10 APS 45 ΜL TEMED 4.5 ΜL</td>
			<td>6 M üre ağırlık ve 3 x jel tampon ve Akrilamid-bisacrylamide çözüm ekleyin. Üre solubilize için bir su banyosunda 60 ° c ısı. GKD2O 10 mL, % 10 ekleyin APS ve nihayet TEMED polimerizasyon için.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine çalışan arabellek (anot) x 1</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 22.5 mM HCl pH 8,9</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-Tricine çalışan arabellek (katot) x 1</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 100 mM Tricine % 1 SDS pH 8,25</td>
			<td>Schägger 19 adapte tarifi
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Asidik arabellek</td>
			<td colspan="2">
 100 mM Tris 100 mM Asetik asit</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>%4 SDS yığın jel</td>
			<td colspan="2">
 2 mL için: GKD2O 1.4 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide (37.5:1) 0.33 mL 1 M Tris pH 6.8 0.25 mL % 10 SDS 20 ΜL % 10 APS 20 ΜL TEMED 2 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Jel ayıran % 15 SDS</td>
			<td colspan="2">
 10 mL için: GKD2O 2.3 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide (37.5:1) 5 mL 1.5 M Tris pH 8,8 2.5 mL % 10 SDS 100 ΜL % 10 APS 100 ΜL TEMED 4 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS çalışan arabellek x 1</td>
			<td colspan="2">
 25 mM Tris 192 mM glisin %0.1 SDS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çözüm boyama Coomassie</td>
			<td colspan="2">
 %5 (w/v) alüminyum sülfat-(14-18)-hidrat % 10 (v/v) etanol (% 96) %2 (v/v) dezenfektan maddeler (% 85) %0,02 (w/v) Coomassie parlak mavi G-250 
			 </td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ULTRAhyb vericiyi hibridizasyon arabellek</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>Ambion, yaşam teknolojileri</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: çözümler ve arabellek tarifleri. Liste-in tüm arabellekleri ve çözümleri 3D-sayfa analizi için gerekli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hayır nokta.</td>
			<td>MW obs. [kDa]</td>
			<td colspan="2">Kimlik</td>
			<td>Organizma</td>
			<td>Hayır katılım.</td>
			<td>MW [kDa]</td>
			<td>Maskot puanı</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_1</td>
			<td>130</td>
			<td colspan="2">Sözde hastalık direnci protein At4g19050</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>CDX78917</td>
			<td>131.1</td>
			<td>110</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_2</td>
			<td>130</td>
			<td colspan="2">Sözde hastalık direnci protein At4g19050</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>CDX78917</td>
			<td>131.1</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_3</td>
			<td>100</td>
			<td colspan="2">Isı şok 70 kDa protein 14 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_013748865</td>
			<td>89.9</td>
			<td>113</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_4</td>
			<td>90</td>
			<td colspan="2">Ökaryotik uzama faktör 2 Hücre bölünmesi kontrol protein 48 homolog A</td>
			<td>B. napus B. napus</td>
			<td>CDX90241 CDY41316.1</td>
			<td>89,5 89,5</td>
			<td>111 197</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_5</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="2">Isı şok protein 90-2-gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009132342</td>
			<td>79,8</td>
			<td>172</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_6</td>
			<td>80</td>
			<td colspan="2">Treonin--tRNA ligaz Glisin--tRNA ligaz</td>
			<td>B. oleracea B. napus</td>
			<td>XP_013599115 CDY43195</td>
			<td>81,5 80.8</td>
			<td>110 88</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_7</td>
			<td>70</td>
			<td colspan="2">Isı şok protein 70 kDa Lizin - tRNA ligaz benzeri</td>
			<td>B. oleracea B. napus</td>
			<td>XP_013685267 XP_013747530</td>
			<td>67,8 69.9</td>
			<td>230 150</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_8</td>
			<td>65</td>
			<td colspan="2">Myrosinase Aspartat--tRNA ligaz 2 Asparagine--tRNA ligaz 1</td>
			<td>B. napus B. napus B. napus</td>
			<td>ABQ42337 XP_013670803 XP_013729126</td>
			<td>60.6 61.6 63,5</td>
			<td>183 141 153</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_9</td>
			<td>60</td>
			<td colspan="2">Myrosinase</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>ABQ42337</td>
			<td>60.6</td>
			<td>164</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_10</td>
			<td>55</td>
			<td colspan="2">Adenosylhomocysteinase 2 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009135865</td>
			<td>53.1</td>
			<td>139</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_11</td>
			<td>55</td>
			<td colspan="2">Uzama faktör 1-alfa 1-gibi</td>
			<td>B. oleracea</td>
			<td>XP_013586115</td>
			<td>51,9</td>
			<td>161</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_12</td>
			<td>50</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_013653143</td>
			<td>48.1</td>
			<td>237</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_13</td>
			<td>44</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>213</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_14</td>
			<td>38</td>
			<td colspan="2">Fruktoz-bisphosphate aldolaz</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009115993</td>
			<td>38.4</td>
			<td>226</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_15</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>219</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_16</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>CDY69765</td>
			<td>46.9</td>
			<td>209</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_17</td>
			<td>38</td>
			<td colspan="2">Fruktoz-bisphosphate aldolaz</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009115993</td>
			<td>38.4</td>
			<td>124</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_18</td>
			<td>18</td>
			<td colspan="2">Peptit-prolyl CIS-trans izomeraz CYP18 3 gibi</td>
			<td>B. napus</td>
			<td>XP_009101932</td>
			<td>18,3</td>
			<td>128</td>
		</tr>
<tr>
<td>CIV_19</td>
			<td>45</td>
			<td colspan="2">Sistin liyaz CORI3 gibi</td>
			<td>B. rapa</td>
			<td>XP_009108611</td>
			<td>48.3</td>
			<td>177</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: tanımlanan protein bileşenler karmaşık IV. Birkaç tRNA ligazlar ve daha fazla protein tRNA bağlayıcı kompleksi içinde bulunan 3D-sayfa sonra kitle spektrometrik analizi MALDI-TOF kullanarak.

Watch this Scientific Journal Video about Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

Protein ve Ribonükleoprotein Komplekslerinin 3D-PAGE'i için Brassica napus'tan Floem Sap Örneklemesi | Biyoloji | Video

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Burada büyük yerli protein: protein ve protein protein bileşimi çözümlemek için bir protokol mevcut: yağlı tohum tecavüzünün nükleik asit kompleksleri (B. napus) mavi birleştiren 3D polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) yaklaşımı kullanılarak, phloem çıktı yerli (BN) tarafından kitle spektrometrik kimlik ardından iki tane denaturing sayfa.

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

13.7K Görüntüleme.  Universität Hamburg. Burada büyük yerli protein: protein ve protein protein bileşimi çözümlemek için bir protokol mevcut: yağlı tohum tecavüzünün nükleik asit kompleksleri (B. napus) mavi birleştiren 3D polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) yaklaşımı kullanılarak, phloem çıktı yerli (BN) tarafından kitle spektrometrik kimlik ardından iki tane denaturing sayfa.

Video: Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biyoloji

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Rat Yanal Kuyruk Ven gelen Kan Örnekleme

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...