Protokolün genel amacı canlı yetişkin insan beyin dokularından birincil mikroglia hücreleri izole etmektir. Bizim durumumuzda ameliyat sırasında cerrahi pencere olarak toplanmıştır. Bu başlangıçta buz soğuk PBS beyin dokuları toplayarak gerçekleştirilir, doku sonra 1-mm küp küçük parçalar halinde doğranmış, ve ben sadece trippsin EDTA yardımıyla yaptım.
Bunu takiben, hücreler santrifüj ile hasat edilir ve 48 saat boyunca androjen hücre kültürüne uygun bir şişe ye kaplanır. Hücreler bir kez daha şişeden hasat edilir ve daha fazla kullanıma kadar kültürlenir. Birincil insan mikroglia hücreleri artık immünositokimya kullanılarak karakterize edilebilir ve daha fazla deney için kullanılabilir.
Yetişkin insan beyin dokularından mikroglia hücrelerini izole etmek için protokolümüzün en büyük avantajı, birincil yetişkin insan mikroglia hücrelerini çok uygun maliyetli bir şekilde etkin bir şekilde sağlamasıdır. Protokol sağlamdır ve varolan protokollerde kullanılan adım sayısını azaltarak hücre kaybını azaltır. 10 mL buz gibi aCSF içeren 50 mL'lik falcon tüpünde dokuyu toplayın.
Toplama tüpünü %70 alkolle dikkatlice silin ve aseptik laminar hava akış odasına aktarın. ACSF'yi dikkatlice atın ve Falcon tüpündeki dokuyu tartının. Boş Falcon tüpünün ağırlığını hesaplayarak dokunun yaklaşık ağırlığını hesaplayın.
37 santigrat derece sıcak taze aCSF. Beş dakika boyunca sıcak aCSF doku tutun. Bu adım hücre ölümü önlemek için önemlidir.
aCSF'yi dikkatlice atın. Ve 1X PBS ile bir kez doku yıkayın 37 santigrat dereceye ısıtılır. Tüm kanın gerektiğinde tekrarlanan PBS yıkıntıları ile yıkandığından emin olun.
5 dakika sıcak PBS doku kuluçka. PBS'nin yarısını dikkatlice atın. Kalan PBS ile birlikte dokuyu sterilize edilmiş petri kabına aktarın.
Kalan PBS'yi 1 mL pipetle dikkatlice çıkarın. Bu doku kaybını önleyecektir. Steril bir neşter kullanarak en az 1 mm küp küçük parçalar halinde bu sorunu zar.
Petri kabına %0,25 tripsin EDTA'dan 2 mL ekleyin ve pipet yardımıyla tabağı iyice yıkayın. Doğranmış dokuyu gram başına 10 mL ve %0.25 tripsin EDTA içeren 50 mL'lik falcon tüpüne aktarın. 10 mL serolojik pipet ile pipetleme ile karıştırın.
37 santigrat derece ve 250 rpm hızda 30 dakika boyunca bir shaker üzerinde tüp kuluçka. Tripsin nötralize etmek için 10 mL nötralize ortamı ekleyin. 10 mL serolojik pipet ile iyice karıştırın.
Tüpü 2000G'de 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve kültür orta 1 mL pelet resuspend. Hücreleri androjen hücreleri için uygun bir T25 şişesine yerleştirin ve 4 mL ek kültür ortamı ekleyin.
Kültür ortamı %20 L929 supernatant ve %1 streptomisin içerecektir. Bu stok kültür ortamına ekleyerek yerine şişelerde ayrı ayrı L929 supernatant eklenmesi önerilir. Dokuyu homojen bir şekilde atmak için şişeyi bitirdik.
Bu kontaminasyon şansını artırabilir gibi sallayarak şişenin boynuna medya getirerek kaçının. Şişeyi 37 santigrat derecede %5 CO2 ile 48 saat kuluçkaya yatırın. T25 kültür şişesi santrifüj tüpler de gün 0 hazırlanan medya toplamak.
Toplanan medyayı 1, 466G'de 4 derece santigrat derecede 4 dakika santrifüj edin. Toplanan ortam santrifüj edilirken, günü 1X PBS ile bir kez 0 şişeyı yıkayın. Sol herhangi bir kalıntı doku parçaları kaldırmak için yavaşça şişe çalkalayın.
Herhangi bir kalıntı parçaları kültürü olumsuz etkilemez gibi şişe sert sallayarak kaçının. Şişeye 5 mL taze kültür ortamı ekleyin. Santrifüjlü tüplerden supernatant atın.
Tüplerden birine 1 mL kültür ortamı ekleyin ve pipetle iyice karıştırın. Seri diğer tüplere hücreleri ile karışık ortam ekleyin ve iyice karıştırın. Hücreleri androjen hücreler için uygun ayrı bir T25 şişesine yatırın.
Şişeye 4 mL taze kültür ortamı ekleyin. Her iki şişeyi de 37 santigrat derecede %5 CO2 ile 48 saat kuluçkaya yatırın. Ortamı her iki şişeden atın ve yeni 5 mL kültür ortamı ekleyin.
Şişeleri 37 santigrat derecede %5 CO2'de 48 saat kuluçkaya yatırın. Altıncı gün, hücreler daha fazla deney için hazır olacak. Burada gösterilen görüntülerde.
Bölümün ilk paneli A astrositleri GFAP ile boyanmış, yeşil renkli. İkinci panelde, rca ile bölüm A mikroglia leke, renkli yeşil. B mikroglia rca ile boyanmış bölümünde, hangi renk yeşil, ve astrositler GFAP ile boyanmış, renkli kırmızı.
Görüntülerin yer kaplaması birlikte microglia ve astrositler gösterir. Resimlerden, kültürdeki hücrelerin çoğunun mikroglia olduğu açıktır. Görüntüler kör kontrol ile ölçüldü ve sonuç bölüm C.The sonuçlar hazırlanan kültür hücrelerinin yaklaşık% 80 mikroglia hücreleri olduğunu gösterdi temsil edilmektedir.
Bu teknik yaklaşık bir buçuk saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben yetişkin insan beyin dokularından priming mikroglia nasıl seçebilirim iyi bir anlayışa sahip olmalıdır, hangi daha fazla downstream deneyler için kullanılabilir.
