Protokol, drosophila'yı kimyasal güvenlik testi için standart bir model olarak kurmak ve yaygın olarak NAM olarak adlandırılan yeni yaklaşım metodolojileri geliştirmek için önemli bir adımı temsil etmektedir. Protokol, yetişkin drosophila melanogaster'in yaşayabilirliği üzerindeki kimyasal toksik etkilerin etkilerini değerlendirmek için sıvı ortam kullanan verimli ve ucuz bir yöntemi açıklamaktadır. Dört tabaka birinci sınıf selüloz kromatografi kağıdını istifleyerek ve bunları iki inç genişliğinde şeritler halinde keserek başlayın.
Çiçek şeklinde bir boya içeren 1,5 inçlik bir kağıt zımba kullanarak çiçek şeklindeki filtre kağıdı eklerini delin. Filtre kağıdı yığınını, 22 x 220 milimetre verniksiz ahşap dübel kullanarak 28,5 milimetre çapında bir polipropilen şişenin dibine itin. Yığının şişenin altına güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
Hazırlanan şişeleri plastik veya karton tepsilerde saklayın ve tepsileri kullanana kadar büyük plastik torbalara yerleştirin. Sinekleri içeren cam şişeyi açın, hazırlanan plastik şişenin ağzına yerleştirin ve plastik şişenin tabanını bir tezgah üstüne vurarak sıralanmış seks uyumlu sinekleri açlık şişesine aktarın. Plastik şişeyi selüloz asetat tapası veya flug ile kapatın ve bu transferde kaybolan sinekleri kaydedin.
Dişi sinekler içeren açlık şişelerini bir şeritle işaretleyin. Yanlışlıkla karışmasını önlemek için, şişeleri posta sinekleri ile işaretlenmemiş olarak bırakın. Tabana altı standart kağıt havlu yerleştirerek nem odasını gece boyunca maruz kalmaya hazırlayın.
Daha sonra kağıt havluları 100 mililitre suyla ıslatın ve şişelerin doymuş kağıt havlularla temas etmemesini sağlamak için plastik ızgarayı ıslak havluların üzerine yerleştirin. Açlık şişelerinin tepsilerini nem odası içinde yatay bir konuma yerleştirdikten sonra, nem odasını gece boyunca inkübasyon için 25 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın. Kimyasal maruz kalma şişelerini hazırlamak için, flakon başına 20 sinek içeren dört şişe açlıktan ölmüş dişi sinekleri, her kimyasal konsantrasyonun dört maruz kalma şişesine aktarın.
Bu şişeleri dişi olarak etiketleyin. Her kimyasal konsantrasyon için açlıktan ölmüş dişi sineklerin bir şişesini mavi maruz kalma şişesine aktararak mavi boya içeren kimyasal maruz kalma şişeleri hazırlayın. Bu şişeyi dişi olarak etiketleyin.
Transferden sonra her şişede bulunan sinek sayısını kaydedin ve ölen veya kaçan sayıyı not edin. Normalde, 20 sineğin tümü bir gecede açlıktan ve transferden kurtulmalıdır. Pozlama şişelerini, odayı yaklaşık% 60 nem oranına sahip 25 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirmeden önce taze hazırlanmış bir nem odasına yatay olarak yerleştirin ve 12 ila 12 saat arasında bir ışık karanlık döngüye girer.
Kimyasal maruziyetin başlamasından 24 ve 48 saat sonra maruz kalma şişelerini inceleyin. Her zaman noktasında her şişedeki ölü sinekleri sayın ve kaydedin. Maruz kalan sineklerin, kimyasal maruziyetten 24 saat sonra mavi maruz kalma şişelerindeki mavi maruz kalma ortamını tüketip tüketmediğini belirlemek için, flakon duvarlarını, maruz kalma şişesinin ve flug'un yanında küçük noktalar olarak görünen mavi dışkı endikasyonları açısından inceleyin.
Daha sonra, karınları mavi boya varlığı açısından incelemeden önce sinekleri karbondioksit kullanarak uyuşturun. Sinekleri, yetersizlik, mahsul distansiyonu ve bağırsak bariyer fonksiyonunun bozulması gibi anormal beslenme davranışları açısından inceleyin. İşiniz bittiğinde, kirlenmiş tüm şişeleri, filtre kağıdını, fişleri ve sinekleri uygun kimyasal atık kaplarına atın.
Canlı sinekler şişelerde kalırsa, şişeleri uygun atık kabına atmadan önce dondurun. Protokol etkinliği, yetişkin organın veya erkek ve dişi sineklerin, 48 saatlik maruziyetten sonra ölümcüllüğü puanlamak için sıfırdan iki milimolara kadar sodyum kundakçı konsantrasyonları aralığına maruz bırakılmasıyla belirlendi. Sonraki deneylerde, sodyum kundakçı doz yanıt eğrisini daha kesin olarak tanımlayan sıfır ila beş milimolar konsantrasyon seçildi.
Bu modele dayanarak, sodyum kundakçılıkla beslenen erkek sineklerin son ölümcül dozu veya LD 10, LD 25 ve LD 50 sırasıyla 0.30 milimolar, 0.50 milimolar ve 0.65 milimolar idi. Bu değerler, LD 10'u 0.30 milimolar, LD 25'i 0.65 milimolar ve LD 50'si 0.90 milimolar olan dişi sinekler için biraz daha yüksekti. Sodyum kundakçı çözeltileri içeren% 1 F D ve C mavisi ile beslenen erkek ve dişi sineklerde, yutulan gıda bazen dişiler için 0.2 milimolar ve erkekler için 0.5 milimolar üzerindeki dozlarda yetersizleştirildi, bu da yetersizliğin arsenik zehirlenmesine dross filia tepkisinde anahtar rol oynayabileceğini düşündürmektedir.
Bu maruz kalma protokolünü takiben, sinekler genomik ve metabolomik çalışmalar da dahil olmak üzere daha ileri analizler için kolayca toplanabilir. Bu protokol, meyve sineği drosophila melanogaster'in hassas toksikolojinin büyük ölçekli çalışmalarını yürütmek için ortak bir genetik model olarak kurulmasında ilk adımdır.
