Yöntemlerimiz, hücre ölüm türlerini incelemek ve reaktif oksijen türlerinin üretimini incelemek gibi nanotoksisiteyi incelemek için basit ve tekrarlayıcı bir yöntem ortaya konmaktadır. Floresan aktif hücre sıralaması bize hücrelerin alt nüfus ve hücre ölüm büyüyen farklı türleri çalışma sağlayan sıkı bir biçimidir. DHE prob çalışma yöntemi, reaktif oksijen türlerini tespit etmemizi ve ölçmemizi ve ardından akış sitometrisi, mikroskobik yüksek içerikli görüntüleme ve beyit bazlı floresan analizini yapmamızı sağlar.
Başlamak için, çinko oksit nanopartikül ler içeren bir Eppendorf tüp 15 dakika boyunca bir sonicator içine çinko oksit nanopartikül stok çözeltisi yerleştirin. Bir miligram-mililitre çinko oksit nanopartikül stok kullanarak çeşitli konsantrasyonlarda çinko oksit nano tanecikleri hazırlayın. Sonra, bir biyogüvenlik kabine, tohum MRC5 insan akciğer fibroblastlar üç altı iyi kültür plakaları üzerine bir kez 10 konsantrasyonu beş hücre başına.
Hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bir gün sonra, sekiz saat, 16 saat veya 24 saat boyunca çinko oksit nano tanecikleri iki mililitre ile hücreleri tedavi. Her zaman noktasında, 15 mililitrelik santrifüj tüp içine hücreleri toplamak ve beş dakika için 300 kez g santrifüj.
Hücre peletlerini fosfat tamponlu tuzlu ile iki kez yıkayın ve 1X bağlama tamponu ile hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra, propidium iyodür DNA lekebeş mikrolitre FITC Annexin V leke beş mikrolitre ekleyin. Lekeli hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Hücreleri akış sitometrisine göre sıralamadan önce, numuneleri 400 mikrolitre lik 1X bağlama tamponu yla toplayın. Elde edilen ortanca yoğunluğu kullanarak çubuk grafiği tabloya alın. Şimdi şişeler içine farklı konsantrasyonlarda nano tanecikleri bir mililitre eklemek için bir pipet kullanın, mililitre başına 0.1 miligram nihai konsantrasyon yapmak için sinek gıda dokuz mililitre takip, mililitre başına 0.25 miligram, veya mililitre çinko oksit nano tanecikleri başına 0.5 miligram.
Pipet yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için. Çinko oksit nano tanecikleri içeren sinek gıda kullanmadan önce en az 2-3 saat soğumasını bekleyin. Sonra yetişkin erkek ve dişi karbondioksit içeren bir şişede sinekleri anestezik ve beş gün boyunca her şişeye beş erkek sinek ve beş dişi sinek sok.
Onları çiftleşmek ve gıda yüzeyinde yumurtlamak için izin verin. Anesteziden sonra, ebeveyn sinekleri çıkarın ve dört farklı gelişim aşamalarından oluşan oda sıcaklığında daha fazla gelişme geçmesine izin. Embriyonik, larva, pupal ve erişkin evre.
72 ila 120 saat sonra, taze yumurtlu yumurta geç üçüncü instar larvaları haline gelişir. Forseps kullanarak, analizler için şişeduvarından larvatoplamak. Diseksiyon orta veya PBS ile bir diseksiyon çanak bir kuyuda, çözelti içine larva yerleştirin.
Stereomikroskop altında, küçük bir delik yapmak için çillerin ucunu kullanın ve larvaların manikür tabakasını açın. Bağırsaklarını dikkatlice çıkar. Schneider'ın Drosophila Medium içeren 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine bağırsak yerleştirin.
Bir mikrolitre DHE probu ekleyin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya yatın. Schneider's Medium'u her beş dakikada bir kullanarak bağırsakları üç kez yıkayın. Bağırsağı cam kaydırakları üzerine monte edin ve DAPI içeren 10 mikrolitre antifade montaj ortamı ile tedarik edin.
Konfokal mikroskop altında görüntüleri yakalayın. Floresan'ı ölçmek için, floresan mikroskobu veya konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak elde edilen yakalanan floresan görüntülerini ImageJ yazılımına aktarın. Analiz menüsüne tıklayın ve ölçümleri ayarla'yı seçin.
Alan tümleşik yoğunluğu ve ortalama gri değeri gibi çıktı ölçüsünü seçin. Arka planı ayarlamak için floresan olmayan bir bölge seçin. Ölçü'ye tıklayın.
Verileri elektronik tabloya dışa aktarın ve düzeltilmiş toplam hücre floresanını belirleyin. Bir çubuk grafik oluşturve istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bu çalışmada, çinko oksit nanopartikül tedavi hücreleri kontrol hücreleri R5 daha erken R3 veya geç apoptotik R6 hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi sergiler. Nekrotik hücre ölümü R4 ile ifade edildi. Drosophila larvasından çıkarılan bağırsak, farklı gelişimsel kökenli üç ayrı etki alanına bölündü.
Yani, foregut, midgut ve hindgut. DHE stok oldukça hızlı bir şekilde sona erme eğilimindedir, bu yüzden kullandığınız stok çözümü dikkatli olun. Alternatif olarak, yeşil sinyallerdeki hücre içi ROS'u tespit etmek için tasarlanmış ve DHE'den daha fotografik olan Roche hücresi gibi diğer sondaları deneyebilirsiniz.
Protokolümüz, hücre içi ROS üretiminin incelenmesi ve nanotoksisite çalışması için ROS düzeyinin ölçülmesi için genel bir anahat sağlamaktadır. DMSO, DHE için PBS'den daha iyi bir çözücü olduğu bilinmektedir. Ancak, DMSO toksiktir.
Bu nedenle, kullanıcıya en fazla 30 dakika eğitim için tüm süreci kısıtlamak için tavsiye etmek istiyorum. DMSO hücre ölümüne neden olabilir gibi yanlış bir pozitif sonuç gözlemleyebilir olmasıdır.
