Christina Pyrgaki, Tao Tong ve Bioimaging Kaynak Merkezi yardım için Rockefeller Üniversitesi'nde kuzeyden Alison teşekkür ediyoruz ve destek. Biz de Xiphias Ge Zhu film düzenleme için teşekkür ederiz. Bu eser insan sınır bilim programı organizasyonu (PC) tarafından desteklenmiştir.

Hayvan bakımı ve deney hayvan Kurulusları ve Rockefeller Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yordamlara göre yapıldı.
1. doku hazırlık
<ol><li>Kan tamamen dokudan kaldırılana kadar standart intrakardiyak perfüzyon ile ~ 20 mL 1 x 4 ° C'de fosfat tamponlu tuz (PBS) gerçekleştirin.</li>
	<li>Boyun ve kuyruk önemli ölçüde kasıldı kadar perfusate ~ 20 mL sabitleştirici çözeltisi (% 4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS içinde) 4 ° C'de geçin. Dikkat: PFA zehirlidir. Cilt, göz ve müköz membran ile temasından sakının. Çözümleri bir duman başlık içinde yapılmalıdır.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde zarar vermeden tüm yağ yastığı çıkarın ilgi yağ yastıkları incelemek. Künt uçlu forseps pinching veya doku sıkma önlemek için kullanın. Herhangi bir kürk ile disseke doku bulaşıcı kaçının.</li>
	<li>Dokuya %4 1 x PBS PFA gecede 4 ° C'de sonrası fix Her yağ yastığı, ~ 10 mL fiksasyon çözeltisi 15 mL konik tüp ile sonrası düzeltme için.</li>
	<li>Doku oda sıcaklığında (RT) 3 kez (1 h her) 1 x PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Kısa süreli (en fazla 2 hafta) için doku 1 x PBS 4 ° C'de depolayın ve ışıktan korunan. (Örneğin, 1-2 yıl) uzun süreli depolama için arabellek 1 x PBS ile % 0.05 sodyum azid (koruyucu olarak) geçiş yapar. Dikkat: Sodyum azid sözlü olarak yutulur veya deri yoluyla emilir çok zehirli. Sodyum azid çözümleri (% 5 ya da daha fazla) bir duman başlık altında ele alınmalıdır yoğunlaşmıştır.</li>
</ol>2. Delipidation ve Permeabilization
Zamanlama: 1-2 gün
<ol><li>% 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol degradeyle B1n arabellek (Tablo 1) (v/v), Örneğin, % 20 metanol/B1n arabelleği için hazırlamak, mix 20 mL metanol ve B1n arabelleği 80 mL. Tüm arabellekleri 4 ° C'de depolayın Glisin kristalleri doygunluk nedeniyle % 60 ve % 80 metanol/B1n arabellekleri çökelti. Kristalleri kaldırma kaçının; sıvı çözüm için aşağıdaki yıkar kullanın. Dikkat: Metanol uçucu, tahriş edici ve yanıcı. Cilt ve göz temasından kaçının.</li>
	<li>Yavaşça saç örnek bir diseksiyon mikroskop altında kaldırın. Herhangi bir saç, tüysüz veya örneğe bağlı enkaz gölgeler görüntüleme sırasında neden olur. Temizlenmiş örnek yeni bir tüp içine aktarın.</li>
	<li>Aksi belirtilmedikçe buz veya 4 ° C'de tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Küçük örnekleri için (Örneğin, posterior subkutan/perigonadal yağ yastıkları genç yalın fareler üzerinden), 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri ya da yüksek lipid içerikli (Örneğin, obez farelerin gelen yağ yastıkları) örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın.<ol>
<li>Yatay olarak ayarlanan bir orbital çalkalayıcı üzerinde örnekleri içeren tüpler yer ~ 100 rpm. Örnekleri tüp içinde özgürce hareket edebilirsiniz emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>% 20, % 40, %60, % 80 ve % 100 metanol/B1n arabellek kademeli bir dizi örnek belirtilen süre (Tablo 2) kurutmak. Etkilenmişimdir çözüm en aza indirmek.</li>
	<li>Delipidate ile % 100 diklorometan (DCM) örnek (3 kez), her kuluçka süresi ile Tablo 2' de belirtti. Örnek ikinci ve üçüncü DCM yıkar, sonundaki tüp altına lavabo. Aksi takdirde, tam delipidation emin olmak için kuluçka süresini uzatmak (Örneğin, 1-2 h 30 dk genişletmek). Dikkat: DCM duman çuval içinde ele alınmalıdır. Polipropilen incubations için yapılmış depolama ve microcentrifuge tüpler için cam kaplar kullanın. Microcentrifuge tüpler DCM uzun süreli depolama için kullanılmamalıdır. Petri yemekler ve polistiren yapılan serolojik pipetler DCM ile uyumlu değildir. DCM çok kırılgandır. Örnek hızlı kuruma önlemek için taze çözüm aktarın.</li>
	<li>İki kere % 100 metanol ile belirtilen süre (Tablo 2) yıkayın.</li>
	<li>İsteğe bağlı: örnek iyi perfused değilse, kalan kırmızı kan hücreleri hemoglobin rengini güçlü autofluorescence neden olabilir. Metanol (metanol, 5 cilt için % 30 H2O2 1 birim) içinde % 5 H2O2 ile gecede 4 ° C'de çamaşır suyu.</li>
	<li>Örnek bir ters metanol/B1n arabellek dizi rehydrate: %80, % 60, %40, % 20 metanol/B1n ve %100 B1n (2 kez) belirtilen süre (Tablo 2) arabellek.</li>
	<li>PTxwH arabellek (Tablo 1) için 2 h ile örnek RT. yıkama</li>
	<li>Delipidated örnek PTxwH arabellek 4 ° c (en fazla 1 yıl) depolamak veya hemen immunostaining adıma geçin.</li>
</ol>3. bütün Dağı Immunostaining
Zamanlama: 8-10 gün
Not: Aşağıdaki adımların tümünü RT aksi, sallayarak ve ışık koruma ile belirtilmediği sürece yapılmalıdır. Küçük örnekleri için 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın. Bu ilk küçük parçalar halinde dokusu veya doku metanol tedavi bölümleri üzerinde antikorlar doğrulamak için tavsiye edilir.
<ol><li>Önerilen konsantrasyonu PTxwH arabellekte birincil antikor sulandırmak. ~ 20.000 x g tanıtımı antikor precipitates veya toplamalardan önlemek 10 dk de seyreltilmiş antikor çözüm santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Delipidated örnek birincil antikor çözüm ile belirtilen süre (Tablo 2) için kuluçkaya.</li>
	<li>PTxwH arabellek ile örnek bir dizi kuluçka adımı yıkama: 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 1 h, 2 h, 4 h ve geceleme.</li>
	<li>Önerilen konsantrasyonu PTxwH arabellekte ikincil antikor sulandırmak. ~ 20.000 x g tanıtımı antikor precipitates veya toplamalardan önlemek 10 dk de seyreltilmiş antikor çözüm santrifüj kapasitesi. Not: kırmızı ve far-red bölgelerinde ışık yayarlar fluorophores ile Birleşik ikincil antikorları yüksek arka plan doku autofluorescence tarafından neden önlemek için tavsiye edilir. Lazer bir mikroskobunun kullanılabilir hatları sayısına bağlı olarak en çok 3-4 işaretleri aynı anda bir örnek yansıma.</li>
	<li>Örnek ikincil antikor çözüm ile belirtilen süre (Tablo 2) için kuluçkaya.</li>
	<li>PTxwH arabellek kuluçka adımları bir dizi ile yıkama örnek: 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 1 h, 2 h, 4 h ve geceleme.</li>
	<li>İsteğe bağlı: kırılgan doku türleri için %4 1 x PBS PFA gecede 4 ° C doku morfoloji korumaya yardımcı olmak ile lekeli doku düzeltmek. Not: Bu adım görüntüleme arka plan artabilir. Yağ dokusu için bu adımı gerçekleştirmek gerekli değildir.</li>
	<li>1 x PBS ile örnek bir dizi kuluçka adımı yıkama: 5 dk, 10 min ve 30 dak.</li>
	<li>Yavaşça tüysüz bir diseksiyon mikroskop altında örnek kaldırın.</li>
</ol>4. doku takas
Zamanlama: 1-2 gün
<ol><li>İsteğe bağlı: örnek örnek montaj ışık sayfalık Mikroskopi için kolaylaştırmak için özel katıştırın. Not: Bu adımı sırasında görüntüleme şeklini dengelemeye yağ dokusu için önemle önerilir.<ol>
<li>1 x PBS (w/v) % 1'özel gömme çözümle hazırlayın. Gömme çözümü cool ~ 40 ° C arasında aşırı sıcağa örnek kullanılmasını önlemek için.</li>
		<li>Temizlenmiş örnek (Örneğin, Petri kabına veya tekne tartı) bir kalıp yerleştirin ve istediğiniz pozisyona düzenlemek. Herhangi bir sıvı ertelenmiş kaçının. Yavaşça gömme çözüm örnek dökün. Herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.</li>
		<li>Tam olarak örnek içeren bir bloğun RT. keser kuvvetlendirmek özel izin. Not: Tüm gece incubations de dahil olmak üzere aşağıdaki adımları RT, sallayarak ve ışık koruma ile yapılmalıdır. Küçük örnekleri için 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Metanol gradient H2O: % 25, % 50, % 75 ve % 100 (3 kere) örnekte belirtilen süre (Tablo 2) kurutmak. Not: Örnek gecede %100 metanol adımda bırakılabilir.</li>
	<li>% 100 DCM (3 kere) sallayarak ile 1 h için örnekte kuluçkaya. Örnek tüp her DCM yıkama sonunda altına lavabo. Eğer değilse, metanol tam kaldırılmasını sağlamak için kuluçka süresini uzatmak. Örnek bir gecede %100 DCM adımda bırakılabilir.</li>
	<li>Örnek dibenzyl eter (DBE) gecede kırılma indisi eşleştirme elde etmek için hafif sallayarak ile kuluçkaya. Not: Örnek sonunda görünür ışık şeffaf olacak. Dikkat: DBE zararlıdır. Herhangi bir cilt ile temasından sakının. Çift katmanlı eldiven ile duman örtünün içinde hallederim. En kısa zamanda DBE ile kontamine eldiven atma. Cam kaplar için depolama ve microcentrifuge tüpler (Polipropilen) incubations için kullanın. Microcentrifuge tüpler DBE uzun süreli depolama için kullanılmamalıdır. Petri yemekler ve polistiren yapılan serolojik pipetler DBE ile uyumlu değildir. Temiz bir % 100 etanol ile bile ziyan.</li>
	<li>Taze ete ile örnek 2 h. deposu için örneği RT'karanlıkta sallayarak hafif kuluçkaya veya doğrudan görüntüleme için devam edin. Not: Örnekleri bir ay içinde yansıması için tavsiye edilir. Bazı fluorophores diğerlerinden daha kararlıdır olmakla birlikte, bu aşamada örnekleri uzun süreli depolama tavsiye edilmez.</li>
</ol>5. mikroskobu
<ol><li>DBE ile uyumlu olan ışık sayfalık mikroskop ile görüntüleme. Not: organik solvent bazlı görüntüleme için onaylanmış ve DBE kırılma indisi ile eşleşen tek amaçları hedefleri DBE dalmış görüntülemede daldırma olarak kullanılabilir.<ol>
<li>Görüntüleme sırasında hareketi engelleyen bir tutucu üzerine özel katıştırılmış örnek bağlayın. Örnek DBE dolu bir odaya sokmak.</li>
		<li>Bir z-yığın (Örneğin, 1-2 X büyütme) Bütün doku dağıtım/yapısı işaretin ilgi elde etmek için tüm örnek kapsayan toplamak.</li>
		<li>Bir amaç (Örneğin, 4-12 X büyütme) faiz detaylı yapıları görüntü bölgelerinde yakınlaştırmak için daha yüksek büyütme ile geçin. Not: Kollajen tüm yağ hücrelerinin13çevreleyen yağ dokusu hücre dışı matriks için büyük bir katkıda bulunuyor. Kolajen vardır yaklaşık 400 arasında değişen bir tipik emisyon spektrum nm 550 nm14. Örnek (yeşil) 488 lazer çizgi ile görüntüleme ve kollajen (Örneğin, 525-550 nm) emisyon spektrum içinde yatıyor bir dalga boyu aralığı verilmiş ışık toplama için daha önce gösterilen doku autofluorescence sinyal sağlayacak yağ hücre kontur ve genel doku mimari12betimlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir ters confocal görüntüleme veya iki fotonlu mikroskop.<ol>
<li>Özel katıştırılmış örnek cam alt odası slaytla herhangi bir plastik parçalar (veya mühürleyebilirsiniz diğer DBE uyumlu görüntüleme odası) dokunmadan yerleştirin. DBE kaçak değil emin olun.</li>
		<li>Objektif ile daha derin nüfuz elde etmek için daha uzun çalışma mesafeler seçin. Not: Görüntüleme odası slayt cam alt aracılığıyla ters bir confocal veya iki fotonlu mikroskop ile yapılmalıdır. Örnek ve daldırma DBE tabanlı görüntüleme için önerilen değil hedefleri arasında doğrudan temastan kaçının.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis.">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li><li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure.">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation.">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity.">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets.">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Adipo-temiz yağ dokusu, normal laboratuar kurulumunda kolayca gerçekleştirilebilir temizlenmesi için bir basit ve sağlam yöntemdir. İDISCO gibi diğer solvent bazlı temizleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear özellikle yağ dokusu ve diğer doku yüksek yağ içeriği ile temizlenmesi için optimize edilmiştir. Delipidation adım lipitler yağ tamamen kaldırır ve bu nedenle ...

Yakın zamana kadar yağ dokusu ve yağ hücrelerinin amorf bir topluluğu olarak tasarlandı. Son birkaç on yıl içinde anladığımız kadarıyla şimdi farklı türde adiposit yanı sıra adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, damarlara ve sinir projeksiyonlar içeren karmaşık bir organ olduğu kabul yağ ile daha sofistike büyüdü. Bu yağ yerleşik hücreler arasındaki etkileşimler yağ dokusu ve organizma fizyolojisi ve patofizyolojisi1etkileri belirgin. Her ne kadar ortaya çıkan çalışmalar bazı etkileşimler yatan önemli moleküler mekanizmaları sökülmüş, daha kapsamlı bir anlayış tüm doku üç boyutlu (3D) güvenilir yapısal profilleme gerektirir.
Geçerli bilgimizi yağ dokusu morfolojisi histolojik Analize ince kesitler (5 mikron) nispeten yüksek büyütme görüntüleme (daha--dan 10 X) ile büyük ölçüde dayalı2,3. Ancak, bu yaklaşım bazı önemli sınırlamaları vardır. İlk, karmaşık ipliksi yapılar adipose işlev4,5,6,7' önemli roller oynamak için bilinir, sempatik sinirler ve damarlara gibi değerlendirmek zordur ince kesitler. İkinci olarak, görünüşte amorf şeklini ve odaklanmak için temsilcisi yapısal birim eksikliği nedeniyle, yalnızca bölüm boyama temel yağ dokusu yapıları takdir etmek zordur. Üçüncü olarak, yağ dokusu 3D anatomik imar, tüm beyin morfoloji8çalışma için kullanılan geleneksel bir yöntem için uygun tutarlı seri bölümler elde etmek zorluklar oluşturma bir çok yüksek lipid içeriğe sahiptir. Bu faktörler göz önüne alındığında, hala hücresel çözünürlük elde ederken tüm yağ depo 3D görselleştirme sağlayabilir bir bütün-mount yaklaşım için büyük bir ihtiyaç var.
3D hacimsel görüntüleme tüm bir organ ışık saçılım belirsiz etkileri nedeniyle meydan okuyor. Biyolojik dokuların içinde ışık saçılım önemli bir kaynağı lipid sulu arabirimlerden geliyor. Çabaları dağılım lipidler kaldırarak ortadan kaldırmak için bir yüzyıl boyunca devam edecek olmasına rağmen çok sayıda son yenilikleri9olmuştur. Bir tür yeni geliştirilen doku Temizleme immunolabeling etkin 3D görüntüleme solvent seçilmemiş organların yöntemidir (iDISCO / iDISCO +)10,11. Ancak, yağ dokusu lipidler, onun yüksek düzeyde verilen belirli bir meydan okuma sunuyor ve bu nedenle, iDISCO ek değişiklikler / iDISCO + Protokolü tamamen çöken gelen doku koruyarak lipidler ayıklamak için gereklidir. Geliştirdiğimiz, şimdi Adipo-temiz, adı değiştirilmiş Protokolü metanol/diklorometan tabanlı delipidation yağ dokusunun en iyi şeffaflık yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleme12için uygun elde etmek için kullanır. Çünkü büyük ölçüde endogenously ifade quenches floresan proteinler GFP ve RFP gibi delipidation adım, görselleştirme gibi proteinlerin immunolabeling tarafından sağlanmalıdır. Genel olarak, bu basit ve sağlam iletişim kuralı yağ yerleşik hücre, doku düzeyinde organizasyon eğitim için uygulanabilir adipocyte progenitör hücrelerin ve yağ morfogenez soy izleme geliştirme sırasında.

<table><tbody><tr><td>1x phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl ether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3628</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>Light sheet microscope</td><td>LaVision BioTec</td><td>Ultramicroscope II</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector software</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy visualization software</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Yağ dokusu enerji homeostazı ve termoregülasyon merkezi bir rol oynar. Adipositler, hem de adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, kan damarları ve sinir projeksiyonlar farklı türde oluşur. Her ne kadar hücre türü belirtimi moleküler kontrolü ve bu hücreler arasındaki etkileşimle giderek tarif, bu yağ yerleşik hücreler daha kapsamlı bir anlayış, kendi dağıtım ve mimari görselleştirme tarafından elde edilebilir Bütün doku. Adipose Histoloji analiz etmek için varolan immünhistokimya ve ayirt yaklaşımlar üzerinde ince parafin gömülü kısımlar dayanmaktadır. Ancak, ince kesitler doku yalnızca küçük bir bölümünü yakalamak; Sonuç olarak, sonuçları doku hangi bölümünü analiz tarafından önyargılı. Bu nedenle teknik, moleküler ve hücresel kalıplarının kapsamlı üç boyutlu görselleştirme içinde tüm yağ doku izin vermek için Adipo-temiz, takas bir yağ dokusu geliştirdik. Adipo-net iDISCO adapte / iDISCO +, belirli değişiklikler ile yapılan için tamamen doğal doku morfoloji koruyarak doku içinde depolanan lipid kaldırmak. Işık sayfalık floresans mikroskobu ile birlikte, biz burada tüm bir yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüler elde etmek için Adipo-Clear yöntemi kullanımını göstermektedir.

Adipo-Clear tüm Yağ yastıkları 3D doku Morfoloji ve hücresel etkileşimlerin yalın ve obez Amerika'da nasıl etkilendiğini analiz etmek için yansıma hazırladı. Bu yöntem doku autofluorescence sinyal yeşil kanal toplayarak genel yağ yapısı analiz etmek için kolayca uygulanabilir. Biz daha önce autofluorescence göstermiştir sinyal olumlu perilipin boyama, Olgun adiposit12anahat için yaygın olarak kullanılan bir marker ile yağ bindirmeleri. Ör...

Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Yüksek lipid içeriği nedeniyle yağ dokusu geleneksel histolojik yöntemlerle görselleştirmek için zor oldu. Adipo-temiz sağlam etiketleme ve yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel floresan görüntüleme sağlayan tekniği temizleyerek bir dokudur. Burada, numune hazırlama, ön, boyama, takas ve montaj için görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır.

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K Görüntüleme.  The Rockefeller University. Yüksek lipid içeriği nedeniyle yağ dokusu geleneksel histolojik yöntemlerle görselleştirmek için zor oldu. Adipo-temiz sağlam etiketleme ve yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel floresan görüntüleme sağlayan tekniği temizleyerek bir dokudur. Burada, numune hazırlama, ön, boyama, takas ve montaj için görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır.

Video: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Nörobilim

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Tıp

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

Kan damarları ve sinir lifleri yağ dokusu içinde Co boyama

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Biyoloji

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Metiyatisilin Temizleme ve 3D Görüntüleme ile Yağ Dokusu Yapısının Araştırılması

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

<meta charset="utf8"></head><body>İnsan SATMVEC'leri: İzolasyon ve Adiposit Çapraz Konuşma Çalışmaları

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Deri Altı Yağ Dokusu Mikrovasküler Yüzey Çalışmaları ile Kardiyometabolik Hastalıklara Bakış

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic wasting has been proposed to be stimulated by several inflammatory mediators, which may disrupt the integrative physiology of adipose tissues and other tissues such as the brain and muscle. In this scenario, the tumor can survive at the host&#39;s expense. In recent clinical research, the intensity of depletion of the different fat deposits has been negatively correlated with the patient&#39;s survival outcome. Studies have also shown that various metabolic disorders can alter white adipose tissue (WAT) remodeling, especially in the early stages of cachexia development. WAT dysfunction resulting from tissue remodeling is a contributor to overall cachexia, with the main modifications in WAT consisting of morpho-functional changes, increased adipocyte lipolysis, accumulation of immune cells, reduction of adipogenesis, changes in progenitor cell population, and the increase of &#34;niches&#34; containing beige/brite cells.
To study the various facets of cachexia-induced WAT remodeling, particularly the changes&#160;progenitor cells and beige remodeling, two-dimensional (2D) culture has been the first option for in vitro studies. However, this approach does not adequately summarize WAT complexity. Improved assays for the reconstruction of functional AT ex vivo&#160;help the comprehension of physiological interactions between the distinct cell populations. This protocol describes an efficient three-dimensional (3D) printing tissue culture system based on magnetic nanoparticles. The protocol is optimized for investigating WAT remodeling induced by cachexia induced factors (CIFs). The results show that a 3D culture is an appropriate tool for studying WAT modeling ex vivo and may be useful for functional screens to identify bioactive molecules for individual adipose cell populations applications and aid the discovery of WAT-based cell anticachectic therapy.

This protocol describes a three-dimensional (3D) magnetic printing culture system that permits dissection of white adipose tissue (WAT) remodeling induced by a conditioned medium from cancer cells. Using a 3D culture system of UCP1+ adipocytes that express a green fluorescent protein (GFP) allows the study of beige adipocytes contributing to adipose tissue remodeling.

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic ...

Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Kan damarları ve sinir lifleri yağ dokusu içinde Co boyama

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Bütün Dağı boyama kullanarak 3D beyaz yağ doku yapısı görselleştirme

Metiyatisilin Temizleme ve 3D Görüntüleme ile Yağ Dokusu Yapısının Araştırılması

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

İnsan Subkutan Yağ Dokusunda Adipoz Endotel Hücresi/Adiposit Çapraz Konuşmasının İncelenmesi

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling