우리 크리스티나 Pyrgaki, 타오 통, 앨리슨 북쪽에 록펠러 대학 Bioimaging 리소스 센터에서 감사 하 고 지원 합니다. 우리는 또한 영화 편집: Xiphias Ge Zhu 감사합니다. 이 작품에서 인간 프론티어 과학 프로그램 조직 (PC)를 지원 했다.

동물 관리 및 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 록펠러 대학에 의해 승인 절차에 따라 수행 했다.
1. 조직 준비
<ol><li>혈액은 조직에서 완전히 제거 될 때까지 4 ° C에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 ~ 20 mL와 함께 표준 intracardiac 관류를 수행 합니다.</li>
	<li>목과 꼬리는 크게 굳 어 때까지 perfusate ~ 20 mL 통 솔루션 (4 %paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS에) 4 ° C에서의 전환. 주의: PFA 독성이 있다. 피부, 눈 및 점 막과의 접촉을 피하십시오. 솔루션은 증기 두건 안쪽 여야 한다.</li>
	<li>신중 하 게 그것을 손상 하지 않고 전체 지방 패드를 제거 하는 관심의 지방 패드를 해 부. 무뚝뚝한 끝난 집게를 사용 하 여 곤란 또는 조직을 압박을 피하기 위해. 모든 모피와 해 부 조직을 오염 하지 마십시오.</li>
	<li>후 4% PFA 1 x PBS에 4 ° c.에서 하룻밤에 조직 수정 각 지방 패드 15 mL 원뿔 튜브에 고정 솔루션의 ~ 10 mL와 수정 후.</li>
	<li>실 온 (RT)에서 조직 1 x PBS로 3 회 (각 1 시간)을 씻어.</li>
	<li>단기 (최대 2 주)에 대 한 조직 4 ° C에서 1 x PBS에 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 장기 저장 (예를 들어, 1-2 년)에 대 한 전환 버퍼 0.05% 나트륨 아 지 드와 1 x PBS (방부 제)로. 주의: 나트륨 아 지 드 구두로 섭취 또는 피부를 통해 흡수 하는 때 매우 독성이 있다. 나트륨 아 지 드 솔루션 (5% 이상) 증기 두건에서 처리 되어야 집중.</li>
</ol>2. Delipidation 및 Permeabilization
타이밍: 1-2 일
<ol><li>20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올 그라데이션 B1n 버퍼 (표 1) (v/v), 예를 들어, 20% 메탄올/B1n 버퍼에 대 한 준비, 메탄올의 20 mL와 B1n 버퍼의 80 mL를 혼합. 4 ° c.에 모든 버퍼 저장 글리신 결정 채도 인해 60% 및 80% 메탄올/B1n 버퍼에서 침전 한다. 크리스탈;를 제거 하지 마십시오 액체 솔루션을 사용 하 여 다음 세척에 대 한. 주의: 메탄올은, 자극성, 휘발성 및 가연성. 피부 또는 눈 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 머리를 제거 합니다. 어떤 머리, 보풀, 또는 파편 샘플에 연결 된 이미징 동안 그림자를 발생 합니다. 새로운 튜브로 청소 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>달리 명시 하지 않는 한 또는 얼음에 4 ° C에서 다음 단계를 모두 수행 합니다. (예를 들어, 젊은 마른 쥐에서 후부 피하/perigonadal 지방 패드) 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 (예를 들면, 비만 쥐에서 지방 패드) 높은 지질 콘텐츠로 샘플 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.<ol>
<li>가로로 설정 궤도 셰이 커에 샘플을 포함 하는 튜브를 놓고 ~ 100 rpm. 샘플 튜브 안에 자유롭게 이동할 수 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 20%, 40%, 60%, 80%, 및 100% 메탄올/B1n 버퍼의 등급된 시리즈에서 샘플을 탈수. 이어지기 솔루션을 최소화 합니다.</li>
	<li>Delipidate 100 %dichloromethane (DCM)와 샘플 (3 회), 부 화 시간에 각각 표 2에 표시. 샘플의 두 번째 및 세 번째 DCM 세척 끝 튜브의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우 전체 delipidation를 위해 보육 시간 연장 (예를 들어, 30 분에서 1-2 시간까지). 주의: DCM 연기 후드 안에 처리 되어야 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 튜브 외피에 대 한 폴 리 프로필 렌에서 만들어집니다. Microcentrifuge 튜브 DCM의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 serological 펫 폴리스 티 렌에서 DCM와 호환 되지 않습니다. DCM은 매우 휘발성 이다. 신속 하 게 건조를 방지 하기 위해 신선한 솔루션에는 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 100% 메탄올으로 두 번 세척.</li>
	<li>옵션: 없으면 샘플 잘 perfused, 나머지 적혈구에서 헤모글로빈의 색 될 수 있습니다 강한 autofluorescence. 4 ° c.에 하룻밤 메탄올 (메탄올의 5 볼륨 30% H2O2 의 1 볼륨)에서 5% H2O2 와 표 백제</li>
	<li>반전된 메탄올/B1n 버퍼 시리즈에서 샘플 rehydrate: 80%, 60%, 40%, 20% 메탄올/B1n, 및 100 %B1n 버퍼 (2 회) 지정 된 시간 (표 2).</li>
	<li>실시간에서 PTxwH 버퍼 (표 1) 2 시간에 대 한 샘플을 씻어</li>
	<li>Delipidated 샘플 4 ° C (최대 1 년)에서 PTxwH 버퍼에 저장 하거나 immunostaining 단계로 바로 진행 합니다.</li>
</ol>3. 전체 마운트 Immunostaining
타이밍: 8-10 일
참고: 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호, 언급 하지 않는 한. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다. 먼저 조직 또는 메탄올 처리 조직 단면도의 작은 조각에 항 체를 검사 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 1 차적인 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g에서 원심</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 1 차적인 항 체 솔루션 delipidated 샘플을 품 어.</li>
	<li>일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 샘플을 세척: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.</li>
	<li>권장된 농도에 PTxwH 버퍼에 이차 항 체 희석. 항 체 희석된 솔루션 소개 항 체 침전 또는 집계를 방지 하기 위해 10 분 ~ 20000 x g 에서 원심 참고: 조직 autofluorescence에 의해 발생 하는 높은 백그라운드를 방지 하려면 fluorophores 빨간색과 빨강 영역에 빛을 방출로 활용 된 이차 항 체는 권장 됩니다. 현미경에 레이저 라인 수에 따라 최대 3-4 마커 수 수 몇 군데 동시에 하나의 샘플에.</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 2 차 항 체 솔루션 샘플을 품 어.</li>
	<li>일련의 인큐베이션 단계에서 PTxwH 버퍼와 세척 샘플: 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 1 시간, 2 시간, 4 h와 하룻밤.</li>
	<li>옵션: 조직 유형 연약한, 수정 얼룩진된 조직 4% PFA 1 x PBS에 조직 형태를 유지 하기 위해 4 ° C에서 하룻밤. 참고:이 단계는 이미징 배경을 증가할 수 있습니다. 지방 조직에 대 한이 단계를 수행할 필요는 없습니다.</li>
	<li>1 x PBS와 샘플 일련의 인큐베이션 단계에서 세척: 5 분, 10 분, 그리고 30 분.</li>
	<li>부드럽게 해 부 현미경 아래 예제에서 린 트를 제거 합니다.</li>
</ol>4. 조직 개간
타이밍: 1-2 일
<ol><li>선택 사항: agarose 빛 시트 현미경 검사 법에 대 한 샘플 장착을 촉진 하기에 샘플을 포함 합니다. 참고:이 단계는 좋습니다 이미징 동안 모양을 안정화를 지방 조직에 대 한.<ol>
<li>1 x PBS (w/v)에서 1 %agarose 포함 솔루션을 준비 합니다. 포함 솔루션 쿨 ~ 40 ° C ~ 샘플 과도 한 열을 노출 하지 마십시오.</li>
		<li>(예, 페 트리 접시 또는 보트 무게) 금형 청소 샘플을 배치 하 고 원하는 위치에 정렬. 어떤 액체의 carryover를 하지 마십시오. 부드럽게 샘플 포함 솔루션을 붓는 다. 어떤 공기 방울을 피하십시오.</li>
		<li>완전 실시간 컷에 샘플을 포함 하는 블록을 공고히 하는 agarose를 하자. 참고: 하룻밤 외피를 포함 하 여 다음 단계를 모두 수행 되어야 합니다 밖으로 RT에 떨고와 빛 으로부터 보호. 작은 샘플에 대 한 솔루션의 1.6 mL와 함께 2 mL microcentrifuge 튜브를 사용 합니다. 큰 샘플에 대 한 솔루션의 4 mL와 5 mL 튜브를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지정 된 시간 (표 2)에 대 한 H2소개할 25%, 50%, 75% 및 100% (3 회)와 메탄올에서에서 샘플을 탈수. 참고: 샘플 100% 메탄올 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>(3 회)을 떨고와 1 시간에 대 한 100 %DCM 샘플을 품 어. 샘플 각 DCM 세척의 끝에 관의 바닥에 싱크 한다. 그렇지 않은 경우에 메탄올의 완전 제거를 보장 하기 위해 보육 시간 연장. 샘플은 100 %DCM 단계에서 하룻밤 남아 있을 수 있습니다.</li>
	<li>일치 하는 굴절률을 달성 하기 위해 가벼운 떨고와 dibenzyl 에테르 (DBE)에 샘플 밤새 품 어. 참고: 샘플 결국 가시 광선에 투명 하 게 될 것 이다. 주의: DBE 위험입니다. 피부와 접촉을 하지 마십시오. 두 계층 장갑 연기 후드 안에 그것을 처리 합니다. 최대한 빨리 그것은 DBE와 함께 오염 된 장갑을 삭제 합니다. 유리 용기를 사용 하 여 저장 및 microcentrifuge 관 (폴 리 프로필 렌) 외피에 대 한. Microcentrifuge 튜브 DBE의 장기 저장을 위해 사용할 수 없습니다. 접시 및 폴리스 티 렌에서 혈 청 학적인 펫 DBE와 호환 되지 않습니다. 100% 에탄올으로 어떤 유출 청소.</li>
	<li>어둠 속에서 RT에서 샘플 2 h. 저장소 떨고 가벼운와 신선한 DBE와 함께 샘플을 품 어 나 영상에 직접 진행. 참고: 샘플은 한 달 내 이미지를 권장 됩니다. 특정 fluorophores 다른 사람 들 보다 더 안정 되어 있지만,이 단계에서 샘플의 장기 보관 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>5입니다. 현미경
<ol><li>빛-시트 현미경 DBE와 호환 되는 이미지입니다. 참고: 유기 용 매 기반 이미징에 대 한 승인 되 고 DBE의 굴절률과 일치 하는 유일한 목표는 DBE 몰입 이미징에서 목표를 찍기로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>Agarose 포함 샘플 영상 동안 움직임을 막을 수 있는 홀더에 탑재 합니다. DBE 채워진 챔버로 샘플을 담가.</li>
		<li>Z-스택 전체 샘플 (예를 들어, 1-2 배 확대) 전체 조직 유통/관심의 마커의 구조를 취재를 수집 합니다.</li>
		<li>(예를 들어, 4-12 배 확대) 자세한 구조를 이미지를 관심 영역을 확대 하려면 더 높은 확대와 함께 목표를 전환 합니다. 참고: 콜라겐 지방 조직, 주변 모든 지방 세포13의 기질에 큰 기여입니다. 콜라겐은 약 400에 이르기까지 일반적인 방출 스펙트럼 550 nm14nm. 488 레이저 선 (녹색)으로 샘플을 상상 하 고 내 콜라겐 (예를 들어, 525-550 nm)의 방출 스펙트럼 파장 범위에서 방출된 빛을 수집 이전에 보여 줬던 조직 autofluorescence 신호를 제공할 것입니다. 지방 세포 윤곽 및 전반적인 조직 아키텍처12를 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>거꾸로과 이미징 confocal 또는 두 광자 현미경.<ol>
<li>모든 플라스틱 부품 (또는 인감 수 있습니다 기타 DBE 호환 이미징 챔버)을 건드리지 않고 agarose 포함 샘플 챔버 슬라이드 유리 바닥에 놓습니다. DBE 밖으로 누출 되지 않는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>더 깊은 침투를 달성 하 긴 작동 거리를 가진 목표를 선택 하십시오. 참고: 이미지는 챔버 슬라이드의 유리 바닥을 통해 거꾸로 또는 2 광자 공초점 현미경으로 행해져야 한다. 샘플 및 찍기 DBE 기반 이미징에 대 한 제안 하지 목표 사이의 직접 접촉을 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis.">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li><li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure.">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation.">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li><li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity.">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li><li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets.">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Adipo 명확한 지방 조직, 일반 랩 설치에서 쉽게 실행 될 수 있는 삭제 위한 간단 하 고 강력한 방법입니다. IDISCO 등 다른 용 매 기반 개간 방법 비교 / iDISCO +10,,1112, Adipo 클리어는 특히 지방 조직 및 다른 조직 높은 지방 콘텐츠를 지우기. Delipidation 단계 완전히 지방에서 지질을 제거 합니다 및 따라서 전체 조직에 걸쳐 immunolabeling...

최근까지, 지방이 많은 직물 지방 세포의 비정 질 컬렉션으로의 잉태 했다. 지난 몇 년간 우리의 이해 지금 adipocytes, 체형 선구자의 종류, 면역 세포, 섬유 아 세포, 맥 관 구조, 및 신경 예측을 포함 하는 복잡 한 기관 수를 인식 하는 지방으로 더 정교한 성장 했습니다. 이 지방 주민 세포 간의 상호 작용 효과 지방 조직 및 organismal 생리학 및 이상1발음 있다. 신흥 연구 기본 특정 상호 작용 하는 중요 한 분자 메커니즘 unraveled 있다, 하지만 더 포괄적인 이해 안정적인 구조 프로 파일링 3 차원 (3D)에 전체 조직의 필요 합니다.
지방이 많은 직물 형태학의 우리의 현재 지식은 기반 상대적으로 높은 확대 화상 진 찰 (10 X) 가진 얇은 단면도 (5 μ m)의 조직학 분석2,3. 그러나,이 방법은 몇 가지 중요 한 제한이 있다. 첫째, 복잡 한 등 교감 신경 맥 관 구조, 많은 기능4,5,,67에 중요 한 역할을 알려져 있습니다 filamentous 구조는 평가 하기 어려운 통해 얇은 섹션입니다. 둘째, 겉보기 무 조직 모양 및 대표적인 구조 단위에 초점의 부족, 그것은 지방 조직 구조 섹션 얼룩에 기반으로 감사 어렵다. 셋째, 지방 조직 취득 3D 해 부 재건, 전체 두뇌 형태학8을 연구 하는 데 사용 하는 기존의 방법에 대 한 적합 한 일관 된 직렬 섹션에 과제를 만드는 매우 높은 지질 내용을 있습니다. 이러한 요소를 감안할 때, 아직도 세포 해상도 달성 하면서 전체 지방 서비스 센터의 3D 시각화를 제공할 수 있는 전체-마운트 접근에 대 한 중대 한 필요가 있다.
전체 장기의 3 차원 체적 영상 도전 가벼운 살포의 가려지는 효과 때문 이다. 생물 학적 조직의 빛 분산의 주요 원천이 지질 수성 인터페이스에서 온다. 지질을 제거 하 여 피해를 제거 하는 노력에 대 한 지속적인 세기 왔다, 하지만 많은 수의 최근 혁신9되었습니다. 하나 같은 새로 개발 조직-개간 방법은 용 매 허가 기관의 immunolabeling 기반 3D 이미징 (iDISCO / iDISCO +)10,11. 그러나 지방 조직 특정 도전 주어진 지질 높은 수준을 제공 하는, 따라서는 iDISCO 추가 수정 / iDISCO + 프로토콜 완전히 붕괴에서 조직을 보호 하면서 지질을 추출 하는 데 필요한. 수정된 프로토콜을 개발 했습니다, 지금은 Adipo 클리어 라는 고해상도 체적 영상12에 적합 최적의 투명도 달성 하기 위해 지방이 많은 직물의 메탄올/dichloromethane 기반 delipidation를 사용 합니다. delipidation 단계 크게 표현 endogenously 냉각 형광 단백질 GFP와 RFP, 때문에 immunolabeling에 의해 이러한 단백질의 시각화를 달성 해야 합니다. 전반적으로,이 간단 하 고 강력한 프로토콜 지방 주민 세포의 조직 수준 조직 연구에 적용할 수 있는 개발 하는 동안 체형 조상 세포, 그리고 지방 morphogenesis의 혈통 추적.

<table><tbody><tr><td>1x phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl ether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3628</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>Light sheet microscope</td><td>LaVision BioTec</td><td>Ultramicroscope II</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector software</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy visualization software</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

지방 조직 에너지 항상성 및 체온 조절에 중심 역할을 한다. 그것은 다른 유형의 adipocytes, 뿐 아니라 체형 선구자, 면역 세포, 섬유 아 세포, 혈관 및 신경 예측 구성 됩니다. 셀 형식 지정의 분자 제어 하 고 이러한 세포의 상호 작용 점점 입각, 비록이 지방 주민 세포의 보다 포괄적인 이해 그들의 배포 아키텍처를 시각화 하 여 달성 될 수 있다 통해 전체 조직. 기존 immunohistochemistry 면역 형광 접근 지방 조직학 분석을 얇은 파라핀 포함 된 섹션에 의존 합니다. 그러나, 얇은 섹션 조직;의 작은 부분만 캡처 그 결과, 결론 조직의 어떤 부분을 분석 하 여 편견 수 있습니다. 따라서 전체 adipose 조직에 분자 및 세포 패턴의 포괄적인 3 차원 시각화를 허용 기법, Adipo-명확 하 고, 삭제 하는 지방 조직 개발 했습니다. Adipo 클리어 iDISCO에서 적응 / iDISCO +, 특정 수정에 게 완전히 제거 하는 기본 조직 형태를 유지 하면서 조직에 저장 된 지질. 함께 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 여기는 전체 지방 조직의 고해상도 체적 이미지를 Adipo Clear 메서드를 사용 하 여를 설명 합니다.

Adipo 명확한 준비 전체 지방 패드 조직 형태 및 세포질 상호 작용 고 비만 상태에 영향을 분석 하는 차원에서 몇 군데 있습니다. 이 메서드는 녹색 채널에 조직 autofluorescence 신호를 수집 하 여 일반 지방 구조 분석에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리가 이전 것으로 나타났습니다는 autofluorescence 지방 오버레이 perilipin 얼룩, 성숙한 adipocytes12개요 일반적으로 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue at JoVE.com

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K 조회수.  The Rockefeller University. 높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

비디오: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

연구

신경과학

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

의학

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 공동 얼룩

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

면역학 및 감염병학

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

생물학

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

<meta charset="utf8"></head><body>인간 SATMVEC: 분리 및 지방세포 누화 연구

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 피하 지방 조직 미세혈관 연구를 통한 심장 대사 질환에 대한 통찰력

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic wasting has been proposed to be stimulated by several inflammatory mediators, which may disrupt the integrative physiology of adipose tissues and other tissues such as the brain and muscle. In this scenario, the tumor can survive at the host&#39;s expense. In recent clinical research, the intensity of depletion of the different fat deposits has been negatively correlated with the patient&#39;s survival outcome. Studies have also shown that various metabolic disorders can alter white adipose tissue (WAT) remodeling, especially in the early stages of cachexia development. WAT dysfunction resulting from tissue remodeling is a contributor to overall cachexia, with the main modifications in WAT consisting of morpho-functional changes, increased adipocyte lipolysis, accumulation of immune cells, reduction of adipogenesis, changes in progenitor cell population, and the increase of &#34;niches&#34; containing beige/brite cells.
To study the various facets of cachexia-induced WAT remodeling, particularly the changes&#160;progenitor cells and beige remodeling, two-dimensional (2D) culture has been the first option for in vitro studies. However, this approach does not adequately summarize WAT complexity. Improved assays for the reconstruction of functional AT ex vivo&#160;help the comprehension of physiological interactions between the distinct cell populations. This protocol describes an efficient three-dimensional (3D) printing tissue culture system based on magnetic nanoparticles. The protocol is optimized for investigating WAT remodeling induced by cachexia induced factors (CIFs). The results show that a 3D culture is an appropriate tool for studying WAT modeling ex vivo and may be useful for functional screens to identify bioactive molecules for individual adipose cell populations applications and aid the discovery of WAT-based cell anticachectic therapy.

This protocol describes a three-dimensional (3D) magnetic printing culture system that permits dissection of white adipose tissue (WAT) remodeling induced by a conditioned medium from cancer cells. Using a 3D culture system of UCP1+ adipocytes that express a green fluorescent protein (GFP) allows the study of beige adipocytes contributing to adipose tissue remodeling.

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic ...

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 공동 얼룩

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling