Ringraziamo Christina Pyrgaki, Tao Tong e Alison North da centro di risorse di Bioimmagini presso la Rockefeller University per assistenza e supporto. Ringraziamo anche Xiphias Ge Zhu per l'editing di film. Questo lavoro è stato supportato da Human Frontier Science programma organizzazione (PC).

Sperimentazione e cura degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal comitato di utilizzo presso la Rockefeller University e istituti di cura degli animali.
1. tessuto preparazione
<ol><li>Eseguire standard perfusione intracardiaca con ~ 20 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS) a 4 ° C fino a quando il sangue viene completamente rimosso dal tessuto.</li>
	<li>Passare il perfusato ~ 20 mL di soluzione fissante (4% paraformaldeide (PFA) in PBS 1X) a 4 ° C fino a quando il collo e la coda sono notevolmente irrigidito. Attenzione: PFA è tossico. Evitare il contatto con pelle, occhi e mucose. Soluzioni dovrebbero essere fatto all'interno di una cappa aspirante.</li>
	<li>Sezionare i rilievi grassi di interesse attentamente per rimuovere il cuscinetto di grasso intero senza danneggiarlo. Utilizzare forcipe smussato-conclusa per evitare di pizzicare o comprimendo il tessuto. Evitare di contaminare il tessuto dissecato con qualsiasi pelliccia.</li>
	<li>Post-fissare il tessuto in 4% PFA in PBS 1X durante la notte a 4 ° C. Per ogni rilievo grasso, post-fissare con ~ 10 mL di soluzione di fissazione in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Lavare il tessuto 3 volte (1 h ciascuna) con 1x PBS a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Conservare il tessuto per a breve termine (fino a 2 settimane) in PBS 1X a 4 ° C e al riparo dalla luce. Per l'archiviazione a lungo termine (ad es., 1-2 anni), passare il buffer 1X PBS sodio azide 0.05% (come conservante). Attenzione: La sodio azide è altamente tossica se ingerito per via orale o assorbito attraverso la pelle. Concentrato di soluzioni (almeno 5% o superiore) devono essere gestite sotto una cappa di sodio azide.</li>
</ol>2. delipidizzazione e permeabilizzazione
Timing: 1-2 giorni
<ol><li>Preparare il 20%, 40%, 60% e 80% di pendenza metanolo con B1n buffer (tabella 1) (v/v), ad esempio, per il 20% metanolo/B1n buffer, mescolare 20 mL di metanolo e 80 mL di tampone B1n. Memorizzare tutti i buffer a 4 ° C. Cristalli di glicina precipiterà dal buffer di metanolo/B1n 60% e 80% a causa della saturazione. Evitare di rimuovere i cristalli; utilizzare la soluzione liquida per i seguenti lavaggi. Attenzione: Il metanolo è volatile, irritante ed infiammabile. Evitare il contatto di occhio e pelle.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente i capelli dal campione sotto un microscopio di dissezione. Tutti i capelli, pelucchi o detriti attaccato al campione causerà ombre durante la formazione immagine. Trasferire il campione pulito in una nuova provetta.</li>
	<li>Eseguire tutti i passaggi seguenti in ghiaccio o a 4 ° C se non diversamente indicato. Per i piccoli campioni (ad es., posteriore cuscinetti adiposi sottocutanei/perigonadal da giovani topi magri), è possibile utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1,6 mL della soluzione. Per campioni di grandi dimensioni o campioni con un contenuto lipidico elevato (ad es., cuscinetti adiposi da topi obesi), è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione.<ol>
<li>Disporre le provette contenenti i campioni orizzontalmente su agitatore orbitale a ~ 100 giri/min. Assicurarsi che i campioni possono muoversi liberamente all'interno del tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disidratare il campione in una serie graduata di 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanolo/B1n tampone per il tempo indicato (tabella 2). Ridurre al minimo la soluzione di riporto.</li>
	<li>Delipidate il campione con 100% diclorometano (DCM) (3 volte), ciascuno con il tempo di incubazione indicato nella tabella 2. Il campione dovrebbe affondare sul fondo del tubo all'estremità dei lavaggi DCM secondo e terzi. Se non, estendere il tempo di incubazione per garantire delipidizzazione completo (ad esempio, si estendono da 30 min a 1-2 h). Attenzione: DCM dovrebbe essere gestito all'interno di una cappa aspirante. Utilizzare contenitori di vetro per deposito e microcentrifuga tubi che sono realizzati in polipropilene per le incubazioni. La microcentrifuga non dovrebbe essere utilizzato per l'archiviazione a lungo termine di DCM. Capsule di Petri e pipette sierologiche che sono realizzati in polistirene non sono compatibili con DCM. DCM è altamente volatile. Trasferire il campione nella soluzione fresca rapidamente per evitare la disidratazione.</li>
	<li>Lavare due volte con 100% di metanolo per il tempo indicato (tabella 2).</li>
	<li>Opzionale: Se il campione non è ben irrorato, il colore dell'emoglobina dai globuli rossi restanti potrebbe causare forte autofluorescenza. Candeggiare con 5% H2O2 in metanolo (1 volume di 30% H2O2 fino a 5 volumi di metanolo) durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Reidratare il campione in una serie di buffer di metanolo/B1n invertita: 80%, 60%, 40%, 20% metanolo/B1n e 100% B1n tampone (2 volte) per il tempo indicato (tabella 2).</li>
	<li>Lavare il campione con un tampone di PTxwH (tabella 1) per 2 h a TA.</li>
	<li>Conservare il campione di delipidated nel buffer di PTxwH a 4° C (fino a 1 anno) o procedere immediatamente con il passaggio di immunostaining.</li>
</ol>3. l'intero Monte Immunostaining
Timing: 8-10 giorni
Nota: Tutti i passaggi seguenti dovrebbero essere eseguiti presso RT se non diversamente indicato, con agitazione e protezione dalla luce. Per i piccoli campioni, utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1.6 mL di soluzione. Per campioni di grandi dimensioni, è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione. Si consiglia di convalidare prima gli anticorpi su piccoli pezzi di tessuti o sezioni di tessuto metanolo-trattati.
<ol><li>Diluire l'anticorpo primario nel buffer di PTxwH per la concentrazione consigliata. Centrifugare la soluzione di anticorpo diluito a ~ 20.000 x g per 10 min impedire l'introduzione dell'anticorpo precipitati o aggregazioni.</li>
	<li>Incubare il campione di delipidated con la soluzione di anticorpo primario per il tempo indicato (tabella 2).</li>
	<li>Lavare il campione con il tampone di PTxwH in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2h, 4h e pernottamento.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di PTxwH per la concentrazione consigliata. Centrifugare la soluzione di anticorpo diluito a ~ 20.000 x g per 10 min impedire l'introduzione dell'anticorpo precipitati o aggregazioni. Nota: Per evitare l'alta priorità bassa causata da tessuto autofluorescenza, anticorpi secondari coniugati con fluorofori che emettono luce nelle regioni rosse e da' raccomanda. A seconda del numero di linee laser disponibili su un microscopio, fino a 3-4 marcatori possa essere imaged simultaneamente in un campione.</li>
	<li>Incubare il campione con la soluzione di anticorpo secondario per il tempo indicato (tabella 2).</li>
	<li>Esempio di lavare con buffer di PTxwH in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2h, 4h e pernottamento.</li>
	<li>Facoltativo: Per i tipi di tessuto che sono fragili, fissare il tessuto macchiato con 4% PFA in 1X PBS durante la notte a 4 ° C per aiutare a preservare la morfologia del tessuto. Nota: Questo passaggio può aumentare la formazione immagine di sfondo. Non è necessario eseguire questo passaggio per il tessuto adiposo.</li>
	<li>Lavare il campione con PBS 1X in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min e 30 min.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il panno dal campione sotto un microscopio di dissezione.</li>
</ol>4. tessuto schiarimento
Timing: 1-2 giorni
<ol><li>Opzionale: Incorporare il campione in agarosio per facilitare il montaggio del campione per microscopia luce-foglio. Nota: Questo passaggio è fortemente consigliato per il tessuto adiposo stabilizzare la sua forma durante la formazione immagine.<ol>
<li>Preparare la soluzione di incasso con 1% di agarosio in 1X PBS (w/v). Raffreddare la soluzione incorporamento a ~ 40 ° C per evitare di esporre il campione ad un calore eccessivo.</li>
		<li>Posizionare il campione pulito in uno stampo (per esempio, capsula di Petri o barca di pesatura) e disporlo nella posizione desiderata. Evitare qualsiasi residuo liquido. Delicatamente e versare la soluzione incorporamento sopra il campione. Evitare eventuali bolle d'aria.</li>
		<li>Lasciate che l'agarosio solidificare completamente alla RT. Cut un blocco contenente il campione. Nota: Tutti i passaggi seguenti, tra cui le incubazioni overnight dovrebbe essere eseguiti alla RT, con agitazione e protezione dalla luce. Per i piccoli campioni, utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1.6 mL di soluzione. Per campioni di grandi dimensioni, è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disidratare il campione sfumatura di metanolo con H2o: 25%, 50%, 75% e 100% (3 volte) per il tempo indicato (tabella 2). Nota: Il campione può essere lasciato durante la notte presso il passo di 100% di metanolo.</li>
	<li>Incubare il campione in DCM 100% per 1 h con agitazione (3 volte). Campione dovrebbe affondare sul fondo del tubo alla fine di ogni lavaggio DCM. In caso contrario, estendere il tempo di incubazione per assicurare la completa rimozione del metanolo. Campione può essere lasciato durante la notte presso il passo di DCM 100%.</li>
	<li>Incubare il campione in dibenzyl etere (DBE) durante la notte con lieve agitazione per ottenere l'indice di rifrazione di corrispondenza. Nota: Esempio finirà per diventare trasparente alla luce visibile. Attenzione: DBE è pericoloso. Evitare il contatto con la pelle. Essere gestito all'interno di una cappa aspirante con guanti a doppio strato. Scartare i guanti, non appena fosse stato contaminato da DBE. Utilizzare contenitori di vetro per tubi deposito e microcentrifuga (polipropilene) per le incubazioni. La microcentrifuga non dovrebbe essere utilizzato per l'archiviazione a lungo termine di DBE. Capsule di Petri e pipette sierologiche che sono realizzati in polistirene non sono compatibili con DBE. Pulire qualsiasi fuoriuscita con etanolo al 100%.</li>
	<li>Incubare il campione con DBE fresco con lieve agitazione per 2 h. Store il campione a temperatura ambiente al buio o procedere direttamente all'imaging. Nota: I campioni sono raccomandati per essere imaged entro un mese. Anche se alcuni fluorofori sono più stabili rispetto ad altri, stoccaggio a lungo termine dei campioni in questa fase non è raccomandato.</li>
</ol>5. microscopia
<ol><li>Imaging con un microscopio di luce-foglio che è compatibile con DBE. Nota: Solo gli obiettivi che sono approvati per l'imaging di solvente organico e abbinati con l'indice di rifrazione di DBE utilizzabile come immersione obiettivi nell'imaging DBE-immerso.<ol>
<li>Montare il campione dell'agarosi-incastonato su un supporto che possa impedire il movimento durante la formazione immagine. Immergere il campione in una camera piena di DBE.</li>
		<li>Raccogliere uno z-stack che copre la totalità del campione (ad es., ingrandimenti di 1-2) per ottenere tutto-tessuto distribuzione/struttura del marcatore di interesse.</li>
		<li>Passare a un obiettivo con ingrandimento maggiore (ad es., ingrandimento X 4-12) per ingrandire le regioni di interesse all'immagine dettagliata strutture. Nota: Il collagene è un contributore importante alla matrice extracellulare del tessuto adiposo, che circonda tutte le cellule di grasso13. Il collagene ha un tipico spettro di emissione che vanno circa 400 nm a 550 nm14. Il campione con la linea di 488 laser (verde) di imaging e raccogliendo la luce emessa ad una gamma di lunghezza d'onda che si trova all'interno dello spettro di emissione del collagene (ad es., 525-550 nm) fornirà il segnale di autofluorescenza del tessuto, che precedentemente è stato indicato per delineare il contorno delle cellule grasse e complessivo tessuto architettura12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging con un invertito confocale o un microscopio a due fotoni.<ol>
<li>Inserire l'esempio dell'agarosi-incorporato in una diapositiva di camera con un fondo di vetro senza toccare le parti in plastica (o altra camera imaging DBE-compatibile che può sigillare). Assicurarsi di che DBE non fuoriuscire.</li>
		<li>Scegliere gli obiettivi con distanze di lavoro più a lungo per ottenere una penetrazione più profonda. Nota: La formazione immagine dovrebbe essere fatto con un microscopio invertito confocale o due fotoni attraverso il fondo di vetro della diapositiva da camera. Evitare il contatto diretto tra il campione e obiettivi che non sono suggeriti per acquisizione di immagini basata su DBE di immersione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Adipo-Clear è un metodo semplice e robusto per l'eliminazione del tessuto adiposo, che può essere facilmente eseguito in una configurazione di laboratorio regolari. In confronto ad altri metodi di schiarimento solvente come iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear è particolarmente ottimizzata per la rimozione del tessuto adiposo e altri tessuti con alto contenuto di grassi. Il passo di delipidizzazione rimuove completamente i ...

Fino a poco tempo, il tessuto adiposo fu concepito come un insieme amorfo di cellule adipose. Negli ultimi decenni, la nostra comprensione è cresciuta più sofisticato, con grasso ora riconosciuta per essere un organo complesso contenente diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, il sistema vascolare e proiezioni del nervo. Interazioni tra queste cellule adiposo residenti hanno pronunciato effetti sul tessuto adiposo e organismal fisiologia e patofisiologia1. Anche se gli studi emergenti hanno dipanato importanti meccanismi molecolari alla base di determinate interazioni, una comprensione più completa richiede affidabile analisi strutturale del tessuto intero in tre dimensioni (3D).
Nostra attuale conoscenza della morfologia del tessuto adiposo è in gran parte basata sull'analisi istologica di sezioni sottili (5 μm) con formazione immagine relativamente ad alto ingrandimento (più di 10 volte)2,3. Tuttavia, questo approccio presenta diverse limitazioni significative. Prime, intricate strutture filamentose quali nervi simpatici e il sistema vascolare, che sono conosciuti per svolgere un ruolo importante nella funzione adiposa4,5,6,7, sono difficili da valutare attraverso sezioni sottili. In secondo luogo, grazie alla sua forma apparentemente amorfo e la mancanza di unità strutturali rappresentativi di concentrarsi su, è difficile apprezzare il tessuto adiposo strutture basate solo sulla sezione macchiatura. In terzo luogo, il tessuto adiposo ha un contenuto di lipidi molto alta, la creazione di sfide nell'ottenere sezioni di serie coerente che sono adatte per 3D ricostruzione anatomica, un metodo convenzionale utilizzato per studiare il cervello intero morfologia8. Considerati questi fattori, c'è un grande bisogno di un approccio di intero-monta che può fornire una visualizzazione 3D di un intero deposito adiposo ottenendo ancora cellulare ad alta risoluzione.
Imaging 3D volumetrico di un intero organo è impegnativo a causa degli effetti di oscuramento della dispersione della luce. Delle principali fonti di dispersione della luce nei tessuti biologici proviene da interfacce del lipido-acquosa. Anche se gli sforzi per eliminare dispersione rimuovendo i lipidi sono in corso da oltre un secolo, ci sono stati un gran numero di recenti innovazioni9. Un tale metodo di recente sviluppato del tessuto-schiarimento è abilitato immunolabeling imaging 3D degli organi solvente-deselezionata (iDISCO / iDISCO +)10,11. Tuttavia, il tessuto adiposo presenta una sfida particolare, data il suo alto livello di lipidi e di conseguenza, ulteriori modifiche per il iDISCO / iDISCO + protocollo sono necessaria per estrarre completamente i lipidi, proteggendo il tessuto dal collasso. Il protocollo modificato che abbiamo sviluppato, ora chiamato Adipo-Clear, impiega basate su metanolo/diclorometano delipidizzazione del tessuto adiposo per ottenere trasparenza ottima per imaging volumetrico ad alta risoluzione12. Perché la delipidizzazione passo in gran parte placa in modo endogeno espresse proteine fluorescenti come GFP e RFP, visualizzazione di tali proteine dovrà essere raggiunti da immunolabeling. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare organizzazione di livello del tessuto delle cellule adiposo-residente, l'analisi di lignaggio di cellule progenitrici degli adipociti e adiposa morfogenesi durante lo sviluppo.

<table><tbody><tr><td>1x phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl ether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3628</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>Light sheet microscope</td><td>LaVision BioTec</td><td>Ultramicroscope II</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector software</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy visualization software</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Tessuto adiposo gioca un ruolo centrale nell'omeostasi energetica e termoregolazione. Esso è composto da diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, vasi sanguigni e le proiezioni del nervo. Sebbene il controllo molecolare di specifica del tipo di cellula e come interagiscono queste cellule sono state sempre più delineate, una comprensione più completa di queste cellule adiposo-residente si può visualizzare la loro distribuzione e architettura durante l'intero tessuto. Approcci attuali di immunoistochimica e immunofluorescenza per analizzare l'istologia adiposa si basano su sezioni sottili di paraffina. Tuttavia, sezioni sottili catturano solo una piccola porzione di tessuto; di conseguenza, le conclusioni possono essere prevenute da quale parte del tessuto è analizzato. Abbiamo quindi sviluppato un tessuto adiposo compensazione tecnica, Adipo-Clear, per consentire la completa visualizzazione tridimensionale di modelli cellulari e molecolari in tessuti adiposi interi. Adipo-Clear è stato adattato da iDISCO / iDISCO +, con specifiche modifiche apportate a rimuovere completamente il lipido immagazzinato nel tessuto, preservando la morfologia del tessuto nativo. In combinazione con microscopia di fluorescenza di luce-foglio, dimostriamo qui l'uso del metodo Adipo-Clear per ottenere immagini ad alta risoluzione volumetriche di un intero del tessuto adiposo.

Adipo-Clear preparato intero grasso pastiglie possono essere imaged in 3D per analizzare come interazioni cellulari e morfologia del tessuto sono interessate negli stati magri ed obesi. Questo metodo può essere applicato facilmente per analizzare la struttura adiposa generale raccogliendo il segnale di autofluorescenza del tessuto nel canale verde. Precedentemente abbiamo indicato che l'autofluorescenza segnale in overlay adiposo favorevolmente con perilipina macchiatura, un indicatore c...

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Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K Views.  The Rockefeller University. A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.

Video: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Ricerca

Neuroscienze

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

Localizzazione, identificazione, e l&#39;escissione dei Depositi Murine adipose

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Medicina

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

Co-macchiatura dei vasi sanguigni e fibre nervose nel tessuto adiposo

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Immunologia e infezioni

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Biologia

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Esplorazione della struttura dei tessuti adiposa mediante la compensazione methylsalicylate e l'imaging 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

<meta charset="utf8"></head><body>SATMVEC umane: isolamento e studi cross-talk con gli adipociti

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Approfondimenti sulle malattie cardiometaboliche con studi di microvascolarizzazione del tessuto adiposo sottocutaneo

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

Studio del cross-talk tra cellule endoteliali adipose e adipociti nel tessuto adiposo sottocutaneo umano

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic wasting has been proposed to be stimulated by several inflammatory mediators, which may disrupt the integrative physiology of adipose tissues and other tissues such as the brain and muscle. In this scenario, the tumor can survive at the host&#39;s expense. In recent clinical research, the intensity of depletion of the different fat deposits has been negatively correlated with the patient&#39;s survival outcome. Studies have also shown that various metabolic disorders can alter white adipose tissue (WAT) remodeling, especially in the early stages of cachexia development. WAT dysfunction resulting from tissue remodeling is a contributor to overall cachexia, with the main modifications in WAT consisting of morpho-functional changes, increased adipocyte lipolysis, accumulation of immune cells, reduction of adipogenesis, changes in progenitor cell population, and the increase of &#34;niches&#34; containing beige/brite cells.
To study the various facets of cachexia-induced WAT remodeling, particularly the changes&#160;progenitor cells and beige remodeling, two-dimensional (2D) culture has been the first option for in vitro studies. However, this approach does not adequately summarize WAT complexity. Improved assays for the reconstruction of functional AT ex vivo&#160;help the comprehension of physiological interactions between the distinct cell populations. This protocol describes an efficient three-dimensional (3D) printing tissue culture system based on magnetic nanoparticles. The protocol is optimized for investigating WAT remodeling induced by cachexia induced factors (CIFs). The results show that a 3D culture is an appropriate tool for studying WAT modeling ex vivo and may be useful for functional screens to identify bioactive molecules for individual adipose cell populations applications and aid the discovery of WAT-based cell anticachectic therapy.

This protocol describes a three-dimensional (3D) magnetic printing culture system that permits dissection of white adipose tissue (WAT) remodeling induced by a conditioned medium from cancer cells. Using a 3D culture system of UCP1+ adipocytes that express a green fluorescent protein (GFP) allows the study of beige adipocytes contributing to adipose tissue remodeling.

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic ...

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

Localizzazione, identificazione, e l'escissione dei Depositi Murine adipose

Co-macchiatura dei vasi sanguigni e fibre nervose nel tessuto adiposo

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto

Esplorazione della struttura dei tessuti adiposa mediante la compensazione methylsalicylate e l'imaging 3D

Studio del cross-talk tra cellule endoteliali adipose e adipociti nel tessuto adiposo sottocutaneo umano

Studio del cross-talk tra cellule endoteliali adipose e adipociti nel tessuto adiposo sottocutaneo umano

Studio del cross-talk tra cellule endoteliali adipose e adipociti nel tessuto adiposo sottocutaneo umano

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling