Wir bedanken uns bei Christina Pyrgaki, Tao Tong und Alison North aus Bioimaging Resource Center an der Rockefeller University für Hilfe und Unterstützung. Wir danken auch Xiphias Ge Zhu zum Film bearbeiten. Diese Arbeit wurde von Human Frontier Science Programm Organisation (PC) unterstützt.

Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren genehmigt durch die institutionelle Tier Pflege und Nutzung Ausschuss an der Rockefeller University durchgeführt.
(1) Gewebe-Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie standard intrakardialen Perfusion mit ~ 20 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C, bis das Blut aus dem Gewebe vollständig entfernt wird.</li>
	<li>Wechseln Sie die Perfusat zu ~ 20 mL Fixativ Lösung (4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer) bei 4 ° C, bis der Hals und Schweif deutlich versteift haben. Achtung: PFA ist giftig. Berührung mit Haut, Augen und Schleimhäute. Lösungen sollten in einem Abzug erfolgen.</li>
	<li>Sezieren Sie die Fettpolster von Interesse sorgfältig, um die gesamte Fettpolster zu entfernen, ohne es zu beschädigen. Verwenden Sie stumpf endete Zangen um Kneifen oder Quetschen des Gewebes zu vermeiden. Vermeidung einer Kontamination der sezierten Gewebes mit jedem Fell.</li>
	<li>Nach dem Beheben des Gewebes bei 4 % PFA in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° c Für jedes Fettpolster Post-mit ~ 10 mL Fixierung-Lösung in einem 15 mL konische Rohr befestigen.</li>
	<li>Waschen Sie das Gewebe 3 mal (1 h) mit 1 X PBS bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Speichern Sie das Gewebe für kurzfristige (bis zu 2 Wochen) mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C und vor Licht geschützt werden. Für langfristige Lagerung (z.B.1-2 Jahre) wechseln Sie den Puffer zu 1 X PBS mit 0,05 % Natriumazid (als Konservierungsmittel). Achtung: Natriumazid ist hochgiftig, wenn oral oder über die Haut aufgenommen. Konzentriert Natriumazid Lösungen (bei 5 % oder mehr) unter einer Abzugshaube behandelt werden sollte.</li>
</ol>2. Delipidierung und Permeabilisierung
Timing: 1-2 Tage
<ol><li>Bereiten Sie 20 %, 40 %, 60 % und 80 % Methanol Steigung mit B1n Puffer (Tabelle 1), (V/V), z. B.für 20 % Methanol/B1n Puffer, mischen Sie 20 mL Methanol und 80 mL B1n Puffer. Speichern Sie alle Puffer bei 4 ° C. Von 60 % und 80 % Methanol/B1n Puffer aufgrund der Sättigung werden Glycin Kristalle ausgefällt. Zu vermeiden, entfernen die Kristalle; Verwenden Sie die flüssige Lösung für folgenden Waschungen. Achtung: Methanol ist flüchtig, reizend und brennbar. Vermeiden Sie Haut- oder Augenkontakt.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Haare aus der Probe unter dem Mikroskop Dissektion. Haare, Flusen oder Fremdkörper befestigt zum Beispiel verursacht Schatten während der Bildgebung. Übertragen Sie die gereinigte Probe in einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Führen Sie alle folgenden Schritte auf dem Eis oder bei 4 ° C, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie für kleine Proben (z.B. posterior subkutanen/Perigonadal Fettpolster von jungen schlanken Mäusen) 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben oder Proben mit hohem Fettgehalt (z.B., Fettpolster von fettleibigen Mäusen) 5 mL Röhrchen mit 4 mL der Lösung.<ol>
<li>Legen Sie die Rohre mit den Proben horizontal auf einem Orbitalschüttler festgesetzt ~ 100 Umdrehungen pro Minute. Stellen Sie sicher, dass die Proben im Inneren der Röhre frei bewegen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entwässern Sie die Probe in einer abgestuften Reihe von 20 %, 40 %, 60 %, 80 % und 100 % Methanol/B1n-Puffer für die angegebene Zeit (Tabelle 2). Minimieren Sie die Carry-over-Lösung.</li>
	<li>Delipidate der Probe mit 100 % Dichlormethan (DCM) (3 mal), jeweils mit der Inkubationszeit in Tabelle 2angegeben. Die Probe sollte auf den Boden des Röhrchens am Ende des zweiten und dritten DCM Waschungen sinken. Wenn nicht, erweitern die Inkubationszeit zu vollen delipidierung zu gewährleisten (z.B.reichen von 30 min bis 1-2 h). Achtung: DCM sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Verwenden Sie Glasbehälter für Lagerung und Microcentrifuge Röhren, die aus Polypropylen für Inkubationen. Die Mikrozentrifugenröhrchen sollte nicht für die langfristige Lagerung von DCM verwendet werden. Petrischalen und serologische Pipetten, die aus Polystyrol bestehen sind nicht kompatibel mit DCM. DCM ist sehr volatil. Übertragen Sie die Probe in frische Lösung schnell um Austrocknung zu verhindern.</li>
	<li>Waschen Sie sich zweimal mit 100 % Methanol für die angegebene Zeit (Tabelle 2).</li>
	<li>Optional: Wenn die Probe nicht gut PERFUNDIERTEN ist, kann die Farbe des Hämoglobins aus den verbleibenden Erythrozyten stark Autofluoreszenz führen. Bleichen Sie mit 5 % H2O2 in Methanol (1 Volumen von 30 % H2O2 bis 5 Bände von Methanol) über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Die Probe in einer umgekehrten Methanol/B1n Puffer Serie rehydrieren: 80 %, 60 %, 40 %, 20 % Methanol/B1n und 100 % B1n Puffer (2 mal) für die angegebene Zeit (Tabelle 2).</li>
	<li>Waschen Sie die Probe mit PTxwH Puffer (Tabelle 1) für 2 h bei RT</li>
	<li>Die Delipidated Probe in PTxwH Puffer bei 4° C (bis zu 1 Jahr) speichern oder sofort mit dem Immunostaining Schritt fortfahren.</li>
</ol>(3) ganze Mount Immunostaining
Timing: 8-10 Tage
Hinweis: Die folgenden Schritte sollten bei RT erfolgen soweit, mit schütteln und vor Licht geschützt. Verwenden Sie für kleine Proben 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben 5 mL Röhrchen mit 4 mL Lösung. Es empfiehlt sich, zuerst die Antikörper auf kleine Stücke des Gewebes oder Methanol behandelten Gewebeschnitte validieren.
<ol><li>Den primäre Antikörper in PTxwH Puffer der empfohlenen Konzentration zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung ~ 20.000 x g für 10 min Einführung Antikörper Ausscheidungen oder Aggregationen zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Delipidated Probe mit dem primären Antikörper-Lösung für die angegebene Zeit (Tabelle 2).</li>
	<li>Waschen Sie die Probe mit PTxwH Puffer in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h und Übernachtung.</li>
	<li>Der Sekundärantikörper in PTxwH Puffer der empfohlenen Konzentration zu verdünnen. Zentrifugieren Sie die verdünnte Antikörperlösung ~ 20.000 x g für 10 min Einführung Antikörper Ausscheidungen oder Aggregationen zu verhindern. Hinweis: Zur Vermeidung von hohen Hintergrund verursacht durch Gewebe Autofluoreszenz sind mit Fluorophore, die Licht in den Regionen rote und dunkelrote emittieren konjugierten Sekundärantikörper empfohlen. Abhängig von der Anzahl der Laserlinien auf ein Mikroskop zur Verfügung kann bis zu 3-4 Marker in einer Probe gleichzeitig dargestellt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe mit der Sekundärantikörper-Lösung für die angegebene Zeit (Tabelle 2).</li>
	<li>Waschen Probe mit PTxwH Puffer in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h und Übernachtung.</li>
	<li>Optional: Für Gewebetypen, die zerbrechlich sind, beheben Sie die gefärbte Gewebe mit 4 % PFA in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C zur Erhaltung der Gewebe Morphologie. Hinweis: Dieser Schritt kann Bildgebung Hintergrund erhöhen. Es ist nicht notwendig, führen Sie diesen Schritt für Fettgewebe.</li>
	<li>Waschen Sie die Probe mit 1 X PBS in einer Reihe von inkubationsschritte: 5 min, 10 min und 30 min.</li>
	<li>Fusseln entfernen Sie vorsichtig aus der Probe unter dem Mikroskop Dissektion.</li>
</ol>(4) Gewebe Clearing
Timing: 1-2 Tage
<ol><li>Optional: Einbetten der Probenmaterials in Agarose Probe Halterung für Licht-Blatt Mikroskopie zu erleichtern. Hinweis: Dieser Schritt ist dringend empfohlen für Fettgewebe, seine Form während der Aufnahme zu stabilisieren.<ol>
<li>Bereiten Sie die einbettende Lösung mit 1 % Agarose in 1 X PBS (w/V). Cool die einbettende Lösung für ~ 40 ° C zu vermeiden, dass die Probe übermäßiger Hitze.</li>
		<li>Legen Sie die gereinigte Probe in eine Form (z.B., Petrischale oder mit einem Gewicht von Boot) und ordnen sie in die gewünschte Position. Vermeiden Sie jede flüssige Übertragung. Die Einbettung Gemisch sanft über die Probe. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Lassen Sie die Agarose voll an RT. Schnitt aus einem Block mit der Probe zu festigen. Hinweis: Die folgenden Schritte einschließlich Übernachtung Inkubationen sollte bei RT, mit schütteln und vor Licht geschützt erfolgen. Verwenden Sie für kleine Proben 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,6 mL der Lösung. Verwenden Sie für große Proben 5 mL Röhrchen mit 4 mL Lösung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entwässern Sie die Probe in Methanol Farbverlauf mit H2o: 25 %, 50 %, 75 % und 100 % (3 mal) für die angegebene Zeit (Tabelle 2). Hinweis: Probe kann über Nacht bei 100 % Methanol Schritt gelassen werden.</li>
	<li>Inkubation der Probe in 100 % DCM 1 h unter Schütteln (3 mal). Probe sollte auf der Unterseite des Rohres am Ende von jedem DCM waschen sinken. Wenn dies nicht der Fall ist, erweitern die Inkubationszeit zur vollständigen Entfernung von Methanol zu gewährleisten. Probe kann über Nacht bei 100 % DCM Schritt gelassen werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in Dibenzyl Äther (DBE) über Nacht mit leichten schütteln um Brechungsindex passend zu erreichen. Hinweis: Probe wird schließlich im sichtbaren Licht transparent. Achtung: DBE ist gefährlich. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Im Inneren einer Abzugshaube mit doppellagige Handschuhe damit umgehen. Verwerfen Sie die Handschuhe, sobald es mit DBE verunreinigt ist. Verwenden Sie Glasbehälter für Lagerung und Microcentrifuge Rohre (Polypropylen) für Inkubationen. Die Mikrozentrifugenröhrchen sollte nicht für die langfristige Lagerung von DBE verwendet werden. Petrischalen und serologische Pipetten, die aus Polystyrol bestehen sind nicht kompatibel mit DBE. Reinigen Sie alle Spill mit 100 % Ethanol.</li>
	<li>Inkubation der Probe mit frischen DBE mit leichtem Schütteln für 2 h. Store die Probe bei RT im Dunkeln oder gehen Sie direkt zu Bildgebung. Hinweis: Proben sollten innerhalb eines Monats abgebildet werden. Obwohl bestimmte Fluorophore stabiler als andere sind, ist langfristige Lagerung der Proben in diesem Stadium nicht empfohlen.</li>
</ol>(5) Mikroskopie
<ol><li>Bildgebung mit einem Licht-Blatt-Mikroskop, das mit DBE kompatibel ist. Hinweis: Nur Ziele, die für organische Lösungsmittel Bildgebung zugelassen und abgestimmt mit dem Brechungsindex von DBE können verwendet werden, als Ziele in der DBE eingetaucht Bildgebung eintauchen.<ol>
<li>Montieren Sie die Agarose eingebettet Probe auf eine Halterung, die Bewegung während der Bildgebung verhindern kann. Tauchen Sie die Probe in einer DBE-gefüllte Kammer.</li>
		<li>Sammeln Sie einen Z-Stack für die gesamte Probe (z.B. 1-2 X Vergrößerung), ganze-Verteilung/Gewebestruktur des Markers von Interesse zu erhalten.</li>
		<li>Wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung (z.B. 4-12 X Vergrößerung) der Regionen von Interesse für feine Strukturen Bild vergrößern. Hinweis: Kollagen ist ein wesentlicher Faktor für die extrazelluläre Matrix des Fettgewebes, die alle Fettzellen13umgibt. Kollagen ist ein typisches Emissionsspektrum reichen rund 400 nm bis 550 nm14. Bildgebung der Probe mit 488 Laserlinie (grün) und sammeln das emittierte Licht in einem Wellenlängenbereich, der in das Emissionsspektrum von Kollagen (z.B. 525-550 nm) liegt liefern das Gewebe Autofluoreszenz Signal, die bisher gezeigt wurde Fettzelle Kontur und allgemeine Gewebe Architektur12abzugrenzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildgebung mit einer invertierten konfokale oder ein zwei-Photonen-Mikroskop.<ol>
<li>Legen Sie die Probe Agarose eingebettet in eine Kammer-Folie mit einem Glasboden, ohne alle Kunststoffteile (oder andere DBE-kompatible bildgebende Kammer, die versiegeln kann). Stellen Sie sicher, DBE nicht austreten.</li>
		<li>Wählen Sie die Ziele mit längeren Arbeitsabstand, tieferes Eindringen zu erreichen. Hinweis: Bildgebung sollte mit einem inversen konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskop durch den Glasboden der Kammer Folie erfolgen. Vermeiden Sie direkten Kontakt zwischen der Probe und Dippen Ziele, die nicht für die DBE-basierte Bildgebung vorgeschlagen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adipo-Clear ist eine einfache und robuste Methode für das clearing von Fettgewebe, die leicht in eine reguläre Laboraufbau durchgeführt werden kann. Im Vergleich zu anderen lösemittelhaltigen Clearing-Methoden wie iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear ist besonders optimiert für das clearing von Fettgewebe und andere Gewebe mit hohem Fettgehalt. Der delipidierung Schritt vollständig entfernt Lipide aus Fettgewebe, und dah...

Bis vor kurzem war Fettgewebe als eine amorphe Sammlung von Fettzellen konzipiert. In den vergangenen Jahrzehnten hat unser Verständnis mit Fett jetzt erkannt, um ein komplexes Organ, enthält verschiedene Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, das Gefäßsystem und Nerv Projektionen werden anspruchsvoller, gewachsen. Interaktionen zwischen diesen Fettgewebe-Resident-Zellen haben Auswirkungen auf Fettgewebe und organismal Physiologie und Pathophysiologie1ausgesprochen. Obwohl neue Studien wichtigere molekularen Mechanismen, die bestimmte Interaktionen entwirrt haben, erfordert ein umfassenderes Verständnis zuverlässige strukturelle Profilierung des gesamten Gewebes in drei Dimensionen (3D).
Unseren derzeitigen Kenntnissen von Fettgewebe Morphologie basiert größtenteils auf histologische Analyse von Dünnschliffen (5 μm) mit relativ hoher Vergrößerung Bildgebung (mehr als 10 X)2,3. Dieser Ansatz hat jedoch einige erhebliche Einschränkungen. Erste, komplizierte faserigen Strukturen wie sympathischen Nerven und das Gefäßsystem, die bekanntermaßen die adipösen Funktion4,5,6,7eine wichtige Rolle spielen, sind schwer zu bewerten durch dünne Abschnitte. Zweitens aufgrund seiner scheinbar amorphe Form und das Fehlen von repräsentativen strukturelle Einheiten zu konzentrieren, ist es schwierig, Fettgewebe Strukturen basierend nur auf Abschnitt Färbung zu schätzen wissen. Drittens, Fettgewebe hat einen sehr hohen Fettgehalt, schaffen Herausforderungen bei der Beschaffung konsequent Serienschnitte, die geeignet sind für 3D anatomische Rekonstruktion, einer konventionellen Methode verwendet, um ganze Gehirn Morphologie8zu studieren. Angesichts dieser Faktoren gibt es ein großer Bedarf für einen ganzen-Mount-Ansatz, der 3D-Visualisierung eines gesamten Fettgewebe-Depots und noch eine zelluläre Auflösung bieten kann.
Volumetrische 3D-Bildgebung eines ganzen Organs ist schwierig wegen der verhüllenden Auswirkungen der Lichtstreuung. Eine wichtige Quelle der Lichtstreuung in biologischen Geweben kommt von Lipid-wässrige Schnittstellen. Obwohl die Bemühungen um die Streuung zu beseitigen, indem Sie Lipide entfernen laufende für über ein Jahrhundert gewesen, gab es eine große Anzahl von jüngsten Innovationen9. Eine solche neu entwickelte Gewebe-Clearing-Methode ist Immunolabeling-fähigen 3D-Bildgebung Lösungsmittel geclearte Organe (iDISCO / iDISCO +)10,11. Fettgewebe stellt jedoch eine besondere Herausforderung dar, die aufgrund ihrer hohen Lipide, und daher zusätzliche Änderungen an der iDISCO / iDISCO + Protokoll sind erforderlich, um vollständig die Lipide extrahieren und schützt das Gewebe vor dem Kollaps. Das geänderte Protokoll, die, das wir entwickelt haben, jetzt genannt Adipo-Clear, beschäftigt Methanol/Dichlormethan-basierte delipidierung von Fettgewebe, geeignet für hochauflösende Volumetrische Bildverarbeitung12optimalen Transparenz zu erreichen. Da die delipidierung Schritt weitgehend Quenchen endogen ausgedrückt fluoreszierende Proteine wie GFP und RFP, muss Visualisierung solcher Proteine durch Immunolabeling erzielt werden. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um Gewebe-Organisation von Fettgewebe ansässige Zellen untersuchen Abstammung Rückverfolgung Adipocyte Vorläuferzellen und adipösen Morphogenese während der Entwicklung.

<table><tbody><tr><td>1x phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl ether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3628</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>Light sheet microscope</td><td>LaVision BioTec</td><td>Ultramicroscope II</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector software</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy visualization software</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Fettgewebe spielt eine zentrale Rolle im Energie-Homöostase und Thermoregulation. Es besteht aus verschiedenen Arten von Adipozyten sowie Adipocyte Vorstufen, Immunzellen, Fibroblasten, Blutgefäße und Nerven Projektionen. Obwohl die molekularen Steuerung der Zelle Typspezifikation und wie diese Zellen interagieren zunehmend abgegrenzt, ein umfassenderes Verständnis dieser Fettgewebe-Resident-Zellen lässt sich durch die Visualisierung ihrer Verteilung und Architektur durch das ganze Gewebe. Bestehenden Immunohistochemistry und Immunfluoreszenz Ansätze für adipöse Histologie analysieren setzen auf Paraffin-eingebetteten Dünnschliffe. Dünnschliffe erfassen jedoch nur einen kleinen Teil des Gewebes; Infolgedessen können die Schlussfolgerungen voreingenommen sein, durch welchen Teil des Gewebes analysiert wird. Daher haben wir ein Fettgewebe, clearing-Technik, Adipo-Clear, um umfassende dreidimensionale Visualisierung der molekularen und zellulären Muster in ganze Fettgewebe zu ermöglichen. Adipo-Clear wurde von iDISCO / iDISCO +, mit spezifischen Änderungen gemacht, um vollständig zu entfernen die Lipid unter Beibehaltung der nativen Gewebe Morphologie im Gewebe gespeichert. In Kombination mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie zeigen wir hier die Verwendung von der Adipo-Clear-Methode, um hochauflösende volumetrischen Bilder von einer gesamten Fettgewebe zu erhalten.

Adipo-Clear bereit ganze Fett Pads abgebildet werden können, in 3D zu analysieren, wie Gewebe Morphologie und zellulären Interaktionen in den mageren und fettleibigen Staaten betroffen sind. Diese Methode kann leicht angewendet werden, um allgemeine adipösen Struktur zu analysieren, durch das Sammeln von Gewebe Autofluoreszenz Signal in den grünen Kanal. Wir haben bereits gezeigt, dass die Autofluoreszenz Signal in adipösen Überlagerungen günstig mit Perilipin Färbung, eine häufi...

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Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

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27.0K Aufrufe.  The Rockefeller University. Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

Serie: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Forschung

Neurowissenschaften

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Medizin

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

Co Färbung Blutgefäße und Nervenfasern im Fettgewebe

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Immunologie und Infektion

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Biologie

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Untersuchung der Adipose-Gewebestruktur durch Methylsalicylat-Clearing und 3D-Bildgebung

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

<meta charset="utf8"></head><body>SATMVECs beim Menschen: Isolations- und Adipozyten-Crosstalk-Studien

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Einblicke in kardiometabolische Erkrankungen mit subkutanem Fettgewebe Mikrovaskulaturstudien

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic wasting has been proposed to be stimulated by several inflammatory mediators, which may disrupt the integrative physiology of adipose tissues and other tissues such as the brain and muscle. In this scenario, the tumor can survive at the host&#39;s expense. In recent clinical research, the intensity of depletion of the different fat deposits has been negatively correlated with the patient&#39;s survival outcome. Studies have also shown that various metabolic disorders can alter white adipose tissue (WAT) remodeling, especially in the early stages of cachexia development. WAT dysfunction resulting from tissue remodeling is a contributor to overall cachexia, with the main modifications in WAT consisting of morpho-functional changes, increased adipocyte lipolysis, accumulation of immune cells, reduction of adipogenesis, changes in progenitor cell population, and the increase of &#34;niches&#34; containing beige/brite cells.
To study the various facets of cachexia-induced WAT remodeling, particularly the changes&#160;progenitor cells and beige remodeling, two-dimensional (2D) culture has been the first option for in vitro studies. However, this approach does not adequately summarize WAT complexity. Improved assays for the reconstruction of functional AT ex vivo&#160;help the comprehension of physiological interactions between the distinct cell populations. This protocol describes an efficient three-dimensional (3D) printing tissue culture system based on magnetic nanoparticles. The protocol is optimized for investigating WAT remodeling induced by cachexia induced factors (CIFs). The results show that a 3D culture is an appropriate tool for studying WAT modeling ex vivo and may be useful for functional screens to identify bioactive molecules for individual adipose cell populations applications and aid the discovery of WAT-based cell anticachectic therapy.

This protocol describes a three-dimensional (3D) magnetic printing culture system that permits dissection of white adipose tissue (WAT) remodeling induced by a conditioned medium from cancer cells. Using a 3D culture system of UCP1+ adipocytes that express a green fluorescent protein (GFP) allows the study of beige adipocytes contributing to adipose tissue remodeling.

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic ...

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Co Färbung Blutgefäße und Nervenfasern im Fettgewebe

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Untersuchung der Adipose-Gewebestruktur durch Methylsalicylat-Clearing und 3D-Bildgebung

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling