Agradecemos a Christina Pyrgaki, Tao Tong e Alison North do centro de recursos Bioimaging da Universidade Rockefeller, de assistência e apoio. Agradecemos também Xiphias Ge Zhu para edição de filme. Este trabalho foi apoiado pelo humano Frontier ciência programa organização (PC).

Experimentação e cuidados com animais foram realizadas de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê de uso na Universidade Rockefeller e cuidados institucionais do Animal.
1. tecido preparação
<ol><li>Execute padrão perfusão intracardíaca com ~ 20 mL de 1x solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C até que o sangue é completamente removido do tecido.</li>
	<li>Alterne o perfusato para ~ 20 mL da solução de fixador (paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 1x) a 4 ° C até o pescoço e a cauda significativamente foi uma brincadeira. Atenção: O PFA é tóxico. Evite o contacto com a pele, olhos e mucosas. Soluções devem ser feitas dentro de uma coifa.</li>
	<li>Disse as almofadas de gordura de interesse cuidadosamente para retirar o forro de gordura todo sem danificá-lo. Use fórceps sem corte-terminado para evitar comprimir ou apertar o tecido. Evite a contaminação do tecido dissecado com qualquer pele.</li>
	<li>Fixar o tecido em 4% PFA em 1X PBS durante a noite a 4 ° C. Para cada almofada gorda, fixe com ~ 10 mL da solução de fixação em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Lave o tecido 3 vezes (1h cada) com PBS 1x à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Armazenar o tecido para a curto prazo (até 2 semanas) em PBS 1x a 4 ° C e protegido da luz. Para armazenamento a longo prazo (por exemplo, 1-2 anos), alterne o buffer para 1X PBS com 0,05% de azida sódica (como conservante). Atenção: A azida de sódio é altamente tóxica quando ingerido oralmente ou absorvido pela pele. Concentrado de soluções (em 5% ou maior) devem ser tratadas sob uma coifa de azida de sódio.</li>
</ol>2. Delipidation e permeabilização
Tempo: 1-2 dias
<ol><li>Prepare-se 20%, 40%, 60% e 80% gradiente de metanol com B1n buffer (tabela 1) (v/v), por exemplo, para reserva de 20% de metanol/B1n, misture 20 mL de metanol e 80 mL de tampão de B1n. Armazenar todos os buffers a 4 ° C. Cristais de glicina irão precipitar de buffers de metanol/B1n 60% e 80% devido à saturação. Evite remover os cristais; Use a solução líquida para as lavagens seguintes. Atenção: O metanol é volátil, irritantes e inflamáveis. Evite a pele ou olhos.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o cabelo da amostra sob um microscópio de dissecação. Qualquer cabelo, fiapos ou detritos anexado à amostra causará sombras durante a imagem latente. Transferi a amostra limpa para um tubo novo.</li>
	<li>Execute todas as etapas seguintes no gelo ou a 4 ° C a menos que indicado de outra forma. Para pequenas amostras (por exemplo, posteriores almofadas de gordura subcutânea/perigonadal de jovens ratos magras), utilizar 2 mL microcentrifuga tubos com 1,6 mL da solução. Para amostras grandes ou as amostras com alto teor lipídico (por exemplo, almofadas de gordura de ratos obesos), usar tubos de 5 mL com 4 mL de solução.<ol>
<li>Coloque os tubos contendo as amostras horizontalmente em um agitador orbital de ~ 100 rpm. Certifique-se que as amostras podem circular livremente no interior do tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desidrate a amostra em uma série graduada de 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanol/B1n buffer para a hora indicada (tabela 2). Minimize a solução de reporte.</li>
	<li>Delipidate a amostra com o diclorometano (DCM) de 100% (3 vezes), cada um com o tempo de incubação indicado na tabela 2. A amostra deve afundar até o fundo do tubo no final das segunda e terceiros lavagens de DCM. Se não, estender o tempo de incubação para garantir delipidation completo (por exemplo, estender de 30 min a 1-2 h). Cuidado: DCM deve ser tratado dentro de uma coifa. Use recipientes de vidro para armazenamento e microcentrifuga tubos que são feitos de polipropileno para incubação do. Os tubos de microcentrifuga não devem ser utilizados para armazenamento a longo prazo do DCM. Placas de Petri e pipetas que são feitas de poliestireno não são compatíveis com DCM. DCM é altamente volátil. Transferi a amostra para solução fresca rapidamente para evitar a dessecação.</li>
	<li>Lave duas vezes com 100% de metanol para a hora indicada (tabela 2).</li>
	<li>Opcional: Se a amostra não é bem perfundida, a cor da hemoglobina das células vermelhas do sangue restantes pode causar forte autofluorescência. Descorar com 5% H2O2 em metanol (1 volume de 30% H2O2 a 5 volumes de metanol) durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Reidratar a amostra em uma série de amortecedor invertido metanol/B1n: 80%, 60%, 40%, 20% metanol/B1n e 100% B1n tampão (2 vezes) para a hora indicada (tabela 2).</li>
	<li>Lavar a amostra com buffer de PTxwH (tabela 1) para 2 h em RT</li>
	<li>Armazenar a amostra de deslipemizado no buffer de PTxwH a 4° C (até 1 ano) ou proceder de imediato à etapa de imunocoloração.</li>
</ol>3. toda montagem imunocoloração
Tempo: 8-10 dias
Nota: Todas as etapas a seguintes devem ser efectuadas em RT salvo indicação em contrário, com a agitação e a proteção da luz. Para pequenas amostras, use 2 mL microcentrifuge tubos com 1,6 mL de solução. Para amostras grandes, use tubos de 5 mL com 4 mL de solução. Recomenda-se primeiro validar os anticorpos em pequenos pedaços de tecido ou secções de tecido Tratado de metanol.
<ol><li>Dilua o anticorpo primário no buffer de PTxwH, na concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpo em ~ 20.000 x g durante 10 minutos evitar a introdução de anticorpo precipitados ou agregações.</li>
	<li>Incube a amostra deslipemizado com a solução de anticorpo primário durante o tempo indicado (tabela 2).</li>
	<li>Lavar a amostra com buffer de PTxwH em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1h, 2h, 4h e durante a noite.</li>
	<li>Dilua o anticorpo secundário no buffer de PTxwH, na concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpo em ~ 20.000 x g durante 10 minutos evitar a introdução de anticorpo precipitados ou agregações. Nota: Para evitar o fundo elevado causado por tecido autofluorescência, anticorpos secundarios conjugados com fluorophores que emitem luz nas regiões do vermelhas e far-red são recomendados. Dependendo do número de linhas de laser disponíveis em um microscópio, até 3-4 marcadores pode ser fotografada simultaneamente em uma amostra.</li>
	<li>Incube a amostra com a solução de anticorpo secundário durante o tempo indicado (tabela 2).</li>
	<li>Amostra de lavagem com buffer de PTxwH em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1h, 2h, 4h e durante a noite.</li>
	<li>Opcional: Para tipos de tecido que são frágeis, fixe o tecido manchado com 4% PFA em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, para ajudar a preservar a morfologia do tecido. Nota: Este passo pode aumentar a imagem de fundo. Não é necessário efectuar este passo para o tecido adiposo.</li>
	<li>Lavar a amostra com PBS 1x em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min e 30 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o fiapo da amostra sob um microscópio de dissecação.</li>
</ol>4. tecido clareira
Tempo: 1-2 dias
<ol><li>Opcional: Incorpore a amostra em agarose para facilitar a montagem de amostra para microscopia de luz-folha. Nota: Este passo é fortemente recomendado para tecido adiposo estabilizar sua forma durante a imagem latente.<ol>
<li>Prepare a solução de encastre com agarose a 1% em 1X PBS (p/v). Esfriar a solução incorporação de ~ 40 ° C para evitar a exposição da amostra ao calor excessivo.</li>
		<li>Colocar a amostra limpa em um molde (por exemplo, placa de Petri ou barco de pesagem) e organizá-lo para a posição desejada. Evite qualquer transição líquida. Delicadamente, despeje a solução de incorporação da amostra. Evite quaisquer bolhas de ar.</li>
		<li>Deixe o agarose totalmente solidificar no RT. corte para fora de um bloco que contém a amostra. Nota: Todas as etapas seguintes, incluindo a incubação do durante a noite devem ser efectuadas RT, com agitação e proteção da luz. Para pequenas amostras, use 2 mL microcentrifuge tubos com 1,6 mL de solução. Para amostras grandes, use tubos de 5 mL com 4 mL de solução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desidrate a amostra em gradiente de metanol com H2O: 25%, 50%, 75% e 100% (3 vezes) para a hora indicada (tabela 2). Nota: Amostra pode ser deixada durante a noite no passo metanol 100%.</li>
	<li>Incube a amostra em 100% o DCM para 1 h com agitação (3 vezes). Amostra deve afundar até o fundo do tubo na extremidade de cada lavagem de DCM. Se não, estender o tempo de incubação para assegurar a remoção completa de metanol. Amostra pode ser deixada durante a noite no passo DCM 100%.</li>
	<li>Incube a amostra em éter dibenzyl (DBE) durante a noite com agitação suave para alcançar o índice de refração de correspondência. Nota: Amostra vai eventualmente se tornar transparente à luz visível. Atenção: O DBE é perigosa. Evite qualquer contacto com a pele. Lidar com isso dentro de uma coifa com duas camadas de luvas. Descarte as luvas quando está contaminado com DBE. Use recipientes de vidro para armazenamento e microcentrifuga tubos (polipropileno) para incubação do. Os tubos de microcentrifuga não devem ser utilizados para armazenamento a longo prazo do DBE. Placas de Petri e pipetas que são feitas de poliestireno não são compatíveis com o DBE. Limpe qualquer vazamento com 100% de etanol.</li>
	<li>Incubar a amostra com DBE fresco com leve agitação por 2 h. loja da amostra RT no escuro ou proceder diretamente à imagem. Nota: As amostras são recomendadas para ser fotografada dentro de um mês. Embora certas fluorophores são mais estáveis do que outros, armazenamento a longo prazo das amostras nesta fase não é recomendado.</li>
</ol>5. microscopia
<ol><li>Imagem com um microscópio de luz-folha que é compatível com o DBE. Nota: Apenas os objetivos que são aprovados para geração de imagens baseada em solvente orgânica e combinados com o índice de refração do DBE podem ser usados como mergulhando objectivos em imagiologia DBE-imerso.<ol>
<li>Monte a amostra de agarose-encaixadas em um suporte que pode impedir o movimento durante a imagem latente. Imergir a amostra em uma câmara cheia de DBE.</li>
		<li>Recolha uma z-pilha cobrindo toda a amostra (por exemplo, ampliação de X 1-2) para obter a distribuição de todo tecido/estrutura do marcador de interesse.</li>
		<li>Alternar para um objectivo com maior ampliação (por exemplo, ampliação de 4-12 X) para ampliar as regiões de interesse para estruturas detalhadas da imagem. Nota: O colágeno é dos principais contribuintes para a matriz extracelular do tecido adiposo, que envolve todas as células de gordura13. Colagénio tem um espectro de emissão típico que variam de cerca de 400 nm a 550 nm14. Imagem da amostra com a linha de 488 laser (verde) e recolher a luz emitida em um intervalo de comprimento de onda que se encontra dentro do espectro de emissão de colágeno (por exemplo, 525-550 nm) irão fornecer o sinal de autofluorescência de tecido, que anteriormente foi mostrado para delinear o contorno da célula de gordura e de arquitetura de tecido geral12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geração de imagens com uma invertida confocal ou um microscópio de dois fotões.<ol>
<li>Coloca a amostra de agarose-incorporado em um slide de câmara com um fundo de vidro sem tocar qualquer peças de plástico (ou outra câmara de imagem compatível com o DBE que pode selar). Certifique-se de que DBE não vazar.</li>
		<li>Escolha os objectivos com longas distâncias de trabalho para alcançar penetração mais profunda. Nota: A imagem deve ser feita com um microscópio confocal ou dois fotões invertido através do vidro de fundo do slide câmara. Evite o contato direto entre a amostra e mergulhando objectivos que não são sugeridos para geração de imagens baseada em DBE.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Adipo-Clear é um método simples e robusto para limpar o tecido adiposo, que pode ser facilmente executado em uma configuração de laboratório normal. Em comparação com outros métodos de limpeza à base de solvente como iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear é especialmente otimizado para limpar o tecido adiposo e outros tecidos com alto teor de gordura. A etapa de delipidation remove completamente os lipídios do adiposo...

Até recentemente, tecido adiposo foi concebido como uma coleção amorfa de células de gordura. Ao longo das últimas décadas, nosso entendimento tem crescido mais sofisticado, com gordura agora reconhecida para ser um órgão complexo que contém diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, a vasculatura e projeções de nervo. Interações entre estas células adiposo-residente tem pronunciado efeitos no tecido adiposo e a fisiologia e fisiopatologia1. Embora estudos emergentes têm desvendados importantes mecanismos moleculares subjacentes a certas interações, uma compreensão mais abrangente requer perfil estrutural confiável do tecido inteiro em três dimensões (3D).
Nosso conhecimento atual da morfologia do tecido adiposo é amplamente baseado na análise histológica de seções finas (5 μm), com imagens relativamente alta ampliação (mais de 10 X)2,3. No entanto, esta abordagem tem várias limitações significativas. Primeiras, intricadas estruturas filamentosas como nervos simpáticos e a vascularização, que são conhecidas por desempenhar um papel importante na função do tecido adiposo4,5,6,7, são difíceis de avaliar através de seções finas. Em segundo lugar, devido à sua forma aparentemente amorfa e a falta de unidades estruturais representativas para focar, é difícil apreciar o tecido adiposo estruturas baseadas apenas na coloração de seção. Em terceiro lugar, o tecido adiposo tem um muito alto teor lipídico, criando desafios na obtenção de secções seriais consistentes que são adequadas para a reconstrução anatômica 3D, um método convencional usado para estudar o cérebro inteiro morfologia8. Tendo em conta estes factores, há uma grande necessidade de uma abordagem de conjunto de montagem que pode fornecer a visualização 3D de um depósito de tecido adiposo inteira e ainda alcançar a resolução do celular.
Imagem em 3D volumétrica de um órgão inteiro é um desafio devido aos efeitos obscuring de dispersão de luz. Uma importante fonte de dispersão de luz no tecido biológico vem de interfaces lipid-aquosa. Apesar dos esforços para eliminar a dispersão através da remoção de lipídios foram em curso para mais de um século, tem havido um grande número de recentes inovações9. Um tal método de limpeza de tecidos recém-desenvolvido é uma imagem de 3D habilitado para immunolabeling de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO / iDISCO +)10,11. No entanto, o tecido adiposo apresenta um desafio particular, dado o seu alto nível de lipídios e portanto, modificações adicionais para o iDISCO / iDISCO + protocolo são necessário para extrair totalmente os lipídios, protegendo o tecido de entrar em colapso. O protocolo modificado que desenvolvemos, agora chamado Adipo-Clear, emprega baseada em metanol/diclorometano delipidation do tecido adiposo para alcançar a transparência ideal apropriada para imagiologia volumétrica de alta resolução12. Porque o delipidation passo largamente sacia endogenamente expressas proteínas fluorescentes como GFP e RFP, visualização de tais proteínas deve ser alcançada por immunolabeling. Em geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização nível de tecido adiposo-residente células, rastreamento de linhagem de células progenitoras de adipócitos e tecido adiposo morfogênese durante o desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>1x phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl ether</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3628</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>Final concentration of 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>Final concentration of 5-10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Imaging chamber</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>Light sheet microscope</td><td>LaVision BioTec</td><td>Ultramicroscope II</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector software</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy visualization software</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

Tecido adiposo desempenha um papel central na homeostase de energia e termorregulação. Ele é composto de diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, vasos sanguíneos e projeções de nervo. Embora o controle molecular da especificação do tipo de célula e como interagem estas células foram delineados cada vez mais, uma compreensão mais abrangente destas células adiposo-residente pode ser alcançada através da visualização de sua distribuição e arquitetura em todo o tecido todo. As abordagens existentes de imuno-histoquímica e imunofluorescência para analisar histologia tecido adiposa dependem de seções finas de parafina. No entanto, seções finas captura apenas uma pequena porção de tecido; Como resultado, as conclusões podem ser influenciadas por qual parte do tecido é analisada. Portanto, nós desenvolvemos um tecido adiposo, limpeza técnica, Adipo-Clear, para permitir a completa visualização tridimensional de padrões moleculares e celulares nos tecidos adiposos. Adipo-Clear foi adaptado de iDISCO / iDISCO +, com modificações específicas feitas para remover completamente os lipídios armazenados no tecido, preservando a morfologia do tecido nativo. Em combinação com microscopia de fluorescência de luz-folha, vamos mostrar aqui o uso de Adipo-Clear método para obter imagens de alta resolução volumétricas, de um tecido adiposo inteira.

Adipo-Clear preparado toda gordura almofadas podem ser fotografadas em 3D para analisar como interações de morfologia e celular do tecido são afetadas nos Estados magros e obesos. Esse método pode ser facilmente aplicado para analisar a estrutura geral do tecido adiposa, recolhendo o sinal de autofluorescência de tecido no canal verde. Anteriormente mostramos que a autofluorescência sinal em sobreposições de tecido adiposas favoravelmente com perilipin de coloração, um marcador ...

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Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Devido ao alto teor lipídico, o tecido adiposo tem sido desafiador para visualizar usando métodos histológicos de tradicionais. Adipo-Clear é um tecido de limpeza técnica que permite que a rotulagem robusto e alta resolução imagem fluorescente volumétrica do tecido adiposo. Aqui, descrevemos os métodos para a preparação da amostra, pré-tratamento, coloração, limpeza e montagem para a imagem latente.

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

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Biology

27.0K visualizações.  The Rockefeller University. Devido ao alto teor lipídico, o tecido adiposo tem sido desafiador para visualizar usando métodos histológicos de tradicionais. Adipo-Clear é um tecido de limpeza técnica que permite que a rotulagem robusto e alta resolução imagem fluorescente volumétrica do tecido adiposo. Aqui, descrevemos os métodos para a preparação da amostra, pré-tratamento, coloração, limpeza e montagem para a imagem latente.

Vídeo: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

Neurociência

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Medicina

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

Co a coloração dos vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Imunologia e Infecção

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Biologia

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity is characterized by an increase in adipose tissue (AT) mass due to adipocyte hyperplasia and/or hypertrophia, leading to profound remodeling of its three-dimensional structure. Indeed, the maximal capacity of AT to expand during obesity is pivotal to the development of obesity-associated pathologies. This AT expansion is an important homeostatic mechanism to enable adaptation to an excess of energy intake and to avoid deleterious lipid spillover to other metabolic organs, such as muscle and liver. Therefore, understanding the structural remodeling that leads to the failure of AT expansion is a fundamental question with high clinical applicability. In this article, we describe a simple and fast clearing method that is routinely used in our laboratory to explore the morphology of mouse and human white adipose tissue by fluorescent imaging. This optimized AT clearing method is easily performed in any standard laboratory equipped with a chemical hood, a temperature-controlled orbital shaker and a fluorescent microscope. Moreover, the chemical compounds used are readily available. Importantly, this method allows one to resolve the 3D AT structure by staining various markers to specifically visualize the adipocytes, the neuronal and vascular networks, and the innate and adaptive immune cells distribution.

Here, we describe a simple, inexpensive and fast clearing method to resolve the 3D structure of both mouse and human white adipose tissue using a combination of markers to visualize vasculature, nuclei, immune cells, neurons, and lipid-droplet coat proteins by fluorescent imaging.

Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

<meta charset="utf8"></head><body>SATMVECs humanos: estudos de isolamento e diafonia de adipócitos

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. Significant heterogeneity in endothelial cell (EC) genotype and phenotype depends on their vascular bed and host disease state. The ability to isolate MVECs from tissue-specific vascular beds and individual patient groups offers the opportunity to directly compare MVEC function in different disease states. Here, using subcutaneous adipose tissue (SAT) taken at the time of insertion of cardiac implantable electronic devices (CIED), we describe a method for the isolation of a pure population of functional human subcutaneous adipose tissue MVEC (hSATMVEC) and an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.
hSATMVEC were isolated following enzymatic digestion of SAT by incubation with anti-CD31 antibody-coated magnetic beads and passage through magnetic columns. hSATMVEC were grown and passaged on gelatin-coated plates. Experiments used cells at passages 2-4. Cells maintained classic features of EC morphology until at least passage 5. Flow cytometric assessment showed 99.5% purity of isolated hSATMVEC, defined as CD31+/CD144+/CD45-. Isolated hSATMVEC from controls had a population doubling time of approximately 57 h, and active proliferation was confirmed using a cell proliferation imaging kit. Isolated hSATMVEC function was assessed using their response to insulin stimulation and angiogenic tube-forming potential. We then established an hSATMVEC-subcutaneous adipocyte co-culture model to study cellular cross-talk and demonstrated a downstream effect of hSATMVEC on adipocyte function.
hSATMVEC can be isolated from SAT taken at the time of CIED insertion and are of sufficient purity to both experimentally phenotype and study hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Insights sobre doenças cardiometabólicas com estudos de microvasculatura do tecido adiposo subcutâneo

Here, we describe a protocol for isolating, culturing, and phenotyping microvascular endothelial cells from human subcutaneous adipose tissue (hSATMVECs). Additionally, we describe an experimental model of hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic wasting has been proposed to be stimulated by several inflammatory mediators, which may disrupt the integrative physiology of adipose tissues and other tissues such as the brain and muscle. In this scenario, the tumor can survive at the host&#39;s expense. In recent clinical research, the intensity of depletion of the different fat deposits has been negatively correlated with the patient&#39;s survival outcome. Studies have also shown that various metabolic disorders can alter white adipose tissue (WAT) remodeling, especially in the early stages of cachexia development. WAT dysfunction resulting from tissue remodeling is a contributor to overall cachexia, with the main modifications in WAT consisting of morpho-functional changes, increased adipocyte lipolysis, accumulation of immune cells, reduction of adipogenesis, changes in progenitor cell population, and the increase of &#34;niches&#34; containing beige/brite cells.
To study the various facets of cachexia-induced WAT remodeling, particularly the changes&#160;progenitor cells and beige remodeling, two-dimensional (2D) culture has been the first option for in vitro studies. However, this approach does not adequately summarize WAT complexity. Improved assays for the reconstruction of functional AT ex vivo&#160;help the comprehension of physiological interactions between the distinct cell populations. This protocol describes an efficient three-dimensional (3D) printing tissue culture system based on magnetic nanoparticles. The protocol is optimized for investigating WAT remodeling induced by cachexia induced factors (CIFs). The results show that a 3D culture is an appropriate tool for studying WAT modeling ex vivo and may be useful for functional screens to identify bioactive molecules for individual adipose cell populations applications and aid the discovery of WAT-based cell anticachectic therapy.

This protocol describes a three-dimensional (3D) magnetic printing culture system that permits dissection of white adipose tissue (WAT) remodeling induced by a conditioned medium from cancer cells. Using a 3D culture system of UCP1+ adipocytes that express a green fluorescent protein (GFP) allows the study of beige adipocytes contributing to adipose tissue remodeling.

Cancer cachexia (CC) presents itself as a syndrome with multiple manifestations, causing a marked multi-organ metabolic imbalance. Recently, cachectic ...

Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Resumo

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Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

Co a coloração dos vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

Three-Dimensional Adipocyte Culture as a Model to Study Cachexia-Induced White Adipose Tissue Remodeling