Prostat organoidleri geliştirme ve hastalık eğitimi için heyecan verici bir in vitro sistemdir. Onlar ölümsüzleştirilmiş hücre hatları zorlukları aşmak ve hayvan modelleri için ucuz bir alternatif sunuyoruz. Bu protokolde de gösterdiğimiz gibi insan prostat hücrelerinden ve fare prostat hücrelerinden hastalıkla ilgili bir pre-klinik model sistemi olarak yetiştirilebilirler.
Birçok laboratuvar yararlı kültür yöntemleri ve uç noktaları açıklanmıştır. Ancak bu ayrıntıları tek bir protokolde bir araya getirmeyi ve yeni kullanıcılar için özellikle zorlu adımları göstermeyi umuyoruz. Teknikler geliştikçe, prostat kanseri organoidleri model hastalık ve tedavilere yanıt hassas bir ilaç yaklaşımı olarak hasta örneklerinden yetiştirilebilir.
Kültür koşulları prostat organoidlerine özgüdür, ancak uç noktaların çoğu diğer doku tiplerinden uyarlanmıştır. Bir kullanıcı bu protokolün bazı bölümlerini hücre ilgi türüne uyarlayabilir. Bu deneyi, el yazmasında açıklandığı gibi matris jel kodlu 96 kuyulu plakalarda epitel hücrelerini büyüterek başlatın.
12 gün sonra plakalardan organoidleri toplamak için, matris jeli bozmadan kuyulardan orta yıkın. Sonra hemen nötr proteaz matris jel yaklaşık bir-iki oranı her kuyuya nötr proteaz yaklaşık 200 mikrolitre ekleyin. Plakayı 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra pipet yukarı ve aşağı mekanik karışımı ayrıştırmak için, ve 37 santigrat derece 20 dakika tekrar kuluçka. Kuluçkadan sonra nötr proteaz matris jel hücre karışımını birkaç kuyudan mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 300 kez g 3-5 dakika santrifüj ile hücreleri pelet.
Supernatant çıkarın ve sonraki analizler için organoid pelet kaydedin. Gömme için kalıp oluşturmak için, 50 mikrolitre tutan bir silindir yapmak için 1.000 mikrolitrelik pipet ucu küçük bir bölümünü kesip. Sonra aynı ucun geniş kısmından, ilk kalıp etrafında uygun ikinci bir geniş kalıp yapmak.
Soğuk bir blok oluşturmak için, yapışkan tarafı yukarı bant ile bir buz paketi sarın. Daha sonra kalıpları banta dik olarak yapıştırın. İşleme için bir histoloji jel fiş organoidler gömmek için, ilk Hank's Balanced Salt Solution bir mililitre ile önceden elde edilen organoid pelet yıkayın.
3-5 dakika 300 kez g santrifüj sonra, supernatant çıkarın. Sonra organoid pelet sıvı histoloji jel 30 ila 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pelet resuspend için pipetting tarafından yavaşça karıştırın. Bu karışımı soğuk bloktaki bir kalıba aktarın ve numunenin soğumasını ve bir fişe katılaşmasını bekleyin.
Daha sonra, küçük kalıp fişi dışarı itmek ve büyük kalıp merkezine bir piston kullanın ve fiş etrafında net% 2 agar pipetleme tarafından doldurun. Örneğin üst işaretlemek için, pipet histolojik boya renkli% 2 agar fişin üstüne. Agar soğuduktan sonra, fişi histoloji kasetine aktarmak için bir piston kullanın.
Kaseti bir kalemle etiketleyin ve gece fiksasyonu için %10 nötr tamponlu formalin içine yerleştirin. Ertesi gün, kaseti %10 nötr tamponlu formalinden %70 histolojik sınıf etanobuna aktarın ve daha fazla işleyip parafine gömün. Bloğun tabanını 10 mikrometre kalınlığında kırparak başlayın.
Fiş alanını içeren bir bölüm göründükten sonra, kesmeyi durdurun. Mikrotom rotoru kilitleyin ve soğuması için bloğu buza geri aktarın. Bıçağı yeni, kullanılmayan bir bölüme taşıyın.
Ve bloğu kelepçeye geri aktarın. Makinenin kilidini açın ve bölüm başına beş mikrometre de kırpma başlar. Bölümü 40 derecelik su banyosuna aktarmak ve yayılmasını sağlamak için cımbız kullanın.
Bölümü üzerine aktarmak için bir kaydırağı suya dikey olarak batırın. Daha sonra bir organoid bölümünde mevcut olduğundan emin olmak için parlak bir alan mikroskop altında slayt gözlemleyin. 45 ila 50 santigrat derece gece pişirin ve sonra el yazması açıklandığı gibi boyama ile devam edin.
Organoidler ile 96-iyi matris jel kaplı plaka kullanılmayan kuyular ile deneyin bu bölümü başlatın. Kuyunun yan tarafına doğru boru lar atarak, ortam ve matris jeli arasında boşluk bırakarak, organoid kültürü bozmadan mümkün olduğunca çok ortamı dikkatlice çıkarın. Bir kesilmiş 1, 000 mikrolitrelik pipet ucu kullanın, pbs ile önceden ıslak ilgi organoidler içeren matris jel bir damla çizmek için.
Damlayı bir oda kaydırağının ortasına dağıtın. Çıplak gözle, ince uçlu pipet kullanarak oda slayt fazla ortam ve matris jel aspire. Organoid incamayı cama karşı teşvik etmek ve sonraki yıkama adımlarını takiben numune kaybını önlemek.
Slaytı 37 derecelik bir kuluçka makinesine 30-45 dakika yerleştirin. Çanak kopma önlemek için yavaş yavaş pipetleme, nazik sallayarak oda sıcaklığında beş dakika boyunca organoidler yıkamak için 1X PBS 200 mikrolitre ekleyin. Dikkatle 1X PBS çıkarın ve% 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ekleyin.
Hafif sallayarak oda sıcaklığında 30 dakika düzeltin. PfA'da, bu protokolde açıklandığı gibi sonraki permeabilizasyon ve boyama adımlarını yıkayın ve devam edin. Montaj ve görüntü hemen.
Lekesiz taze kesilmiş slayt açıkça insan birincil prostat organoidleri gösterir, lekesiz kuru slayt ise, organoidler yarı saydam görünür ve parlak bir alan mikroskop altında tespit etmek zordur. Hematoksilin ve eozin boyama, iyi işlenmiş bir organoide kıyasla agresif pipetleme, yanlış işleme protokolü gibi yanlış işlemeden kırılmış bir insan primer prostat organoidini gösterir. İnsan primer prostat organoidi formalin-sabit, parafin gömülü, kesitli, ve bazal sitokeratin 5 ve luminal sitokeratin 8, bazal p63 ve luminal sitokeratin 8 ile boyanmış ve konfokal mikroskop ile görüntülenmiştir.
Bir bütün monte insan birincil prostat organoid bazal sitokeratin ile boyandı 5 veya luminal sitokeratin 8, ve phalloidin ve DAPI ile karşılekeli, ve konfokal mikroskop ile görüntülendi. Bir bütün monte insan birincil prostat hücreli organoid floresan etiketli Edu ile boyanmış ve Hoescht ile counterstained, ve konfokal mikroskop ile görüntülenmiştir. İşlem boyunca organoidlerinizi görselleştirmeniz önemlidir.
Bölümleri topladıktan sonra, slayttaki örnekleri görselleştirdiğinden emin olun ve tüm montaj sırasında organoidleri gözlemledikten emin olun. Matris jel organoidler topladıktan sonra, onları tam monte ve ticari tahliller kullanabilirsiniz, ya da akış sitometri veya tek hücreli sıralama için tek hücrelere ayrıştırmak. 3D kültür bir laboratuvar çanak ayarında doku çalışma için yeni bir yol ile araştırmacılar sağlar.
Organogeneze veya hastanın hastalığının patolojisini anlamak için uygulanabilir. Hasta örnekleri ile çalışırken, her zaman dikkatli olun ve kan yoluyla bulaşan patojen maruzkalma potansiyeli olarak malzemeleri ele.
