Bu yöntem endotel biyolojisi alanında önemli soruların cevaplarına yardımcı olabilir, örneğin kan damarlarının ateroskleroz gelişiminde neden bölgesel farklılıklar var? Bu tekniğin en büyük avantajı, kesme stresi veya birden fazla kesme stresi altında birden fazla koşulun aynı anda incelenmesine olanak sağlamasıdır. Çeşitli akış hızları ve desenleri kullanılabilir, çünkü bu tekniğin etkileri arteriyel ve venöz sistemlerde endotel gen regülasyonu anlamak doğru uzanır.
Burada, sabit laminar akışı kullanan bir sistem gösteriyoruz. Kurulum, rahatsız akış da dahil olmak üzere diğer akış desenleri için uyarlanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni gelen bireyler deney süresince sürekli tek hücre katmanını korumak ve deneyler arasında tutarlı sonuçlar elde etmek için mücadele edecektir.
Analizden 24 saat önce, insan endotel hücrelerini erken bir geçitte sayın ve dört kuyulu hücre kültür plakası başına bir mililitrelik orta daki altıncı hücrelere yaklaşık bir kez 10 tohum. Hücrelerin 37 santigrat derecede 15 dakika slayta yapışmasını bekleyin. Daha sonra her slaytı üç mililitre orta ile kaplayın ve plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 CO2'lik hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Deney günü, büyük, ısıtmalı, dahili bir ortamın su tepsisini ayarlanabilir CO2 ve ısı veya plaj kuvözleri ile birden fazla raf, dahili elektrik erişimi ve cam kapılarla doldurun ve deney için yeterli karbondioksitin mevcut olduğunu ve CO2 monitörünün işlevsel olduğunu onaylayın. Akış odası kurmak için, bir sayı 16 yumuşak tüp bir ucuna bir 1 /8 inç kadın cazibesi eklemek ve cazibesine dört yönlü stopcock takın. Tüpün serbest ucunu üst plakanın giriş tarafına takın ve ikinci bir 16 numaralı yumuşak tüpün bir ucuna 1/8 inç lik erkek cazibesi yerleştirin.
Erkek cazibesine dört yönlü bir stopcock takın ve tüpün serbest ucunu üst plakanın çıkış tarafına takın. Üçüncü bir sayı 16 yumuşak tüp her ucuna bir 1/8th inç erkek cazibesi ve 1/8th inç dişi cazibesi ekleyin ve 1/8th inç erkek cazibesi ile bir kabarcık tuzağına tüp ekleyin. Sonra kadın cazibesi ile boru diğer ucuna dört yönlü stopcock takın.
Steril cımbız kullanarak, bir hücre tohumlu cam slayt alt plaka üzerinde girinti, hücre tohumlu tarafı yukarı aktarın. Plaka etrafında kırmızı conta hattı içinde alt plaka ya 10 mililitre sıcak orta eklemek için 10 mililitreşşon kullanın. Ortamın slayttan akmasına ve hücreleri kapsaymasına izin verir.
Yanları hizalamak ve plakaları sıkıca vidalamak için dikkat etmek için alt plaka üzerine yavaşça üst plaka yerleştirin. Kabarcık tuzak hava kabarcıkları kaldırmak için, ilk giriş ve kabarcık tuzak stopcocks açın ve çıkış stopcock kapatın. Sonra yavaşça plaka ile sıcak orta 20 mililitre floş için 30 mililitreşon kullanın.
Odadan kabarcıklar kaldırmak için, kabarcık tuzak stopcock kapatın ve çıkış stopcock açın. Haznenin çıkış tarafını 45 derecelik bir açıya yükseltin ve 30 mililitrelik şırıngayı kullanarak odanın giriş tarafından 20 mililitre sıcak ortamı hafifçe temizle. Akış yönünde uygun bir hızda floş ve hücrelerin laminar akışına maruz kalmadan önce hücrelerin bir confluent monolayer kalır onaylamak için mikroskop kullanmak önemlidir.
Daha sonra odanın ve kapağın her iki tarafındaki stopcocks kapatın ve hücrelerin hala bir ışık mikroskop altında slayt bağlı olduğunu onaylayın. Akış odasını ve daha önce monte edilmiş bir akış döngüsü sistemini sahile yerleştirin ve pompayı tamamen duraklatmadan önce akış döngüsü tertibatının pompa hızını yavaşça düşürün. Sızıntıyı önlemek için akış döngüsü sistemindeki stopcock'ları kapatın ve stopcocks aracılığıyla oda ve döngü sistemini birbirine bağlayın.
Tüm döngüler bağlandığında, tüm stopcock'ları yeniden açın ve herhangi bir sızıntı veya tıkanıklık için kurulum izlerken pompa hızını yavaşça artırın. Akış sensörünü, akış yönüne yönlendirilen sensör ile odanın giriş tarafındaki oda köprüsü borusu üzerine yerleştirin ve pompa hızını ayarlayarak kesme gerilimi faiz oranı için akış hızını ayarlayın. Ardından %5 C02 konsantrasyonu elde etmek için CO2 tankını açın.
Deneysel akış süresi tamamlandıktan sonra, peristaltik pompa hızını yavaşça sıfıra düşürün ve gücü kapatın. Hızlı bir şekilde tüm açık stopcocks kapatın ve temiz bir tezgah üst her tarafta bir stopcock ile oda ve bağlı boru aktarın. Üst plakayı çıkarmak için tüm vidaları dikkatlice sökve cam kaydırağı alt plakadan 100 milimetre çapındaki bir tabağa aktarmak için iğne burun cımbızını kullanın.
Kaydırağı 10 mililitre soğuk PBS ile yıkayın ve hücre yapışmasını ve akış yönünde hizalanmasını onaylamak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. PBS'yi azarladıktan sonra, kaydırağı 100 milimetre çapındaki temiz bir tabağa aktarın ve RNA ekstraksiyon kitinden Beta-Mercaptoetanol'ün 1/100'ü ile tamamlanmış 350 mikrolitre likis tamponunu ekleyin. Hücreleri slayttan kazımak ve tamponun alttabakada birikmesine izin vermek için doku kültür çanasını yatırmak için polietilen bıçaklı hücre kazıyıcı kullanın.
Kaydırağı çıkarmak için forceps kullanın ve pili hücre lisatbuz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüp içine. Daha sonra standart protokollere göre aşağı RNA izolasyonu ve analizi için hücre lysate seyreltilmiş luciferase RNA 10 mikrolitre ekleyin. Luciferase plazmidin inklüzi kullanarak başarılı bir doğrusallaştırma bir agarose jel üzerinde sindirilmiş ürünler çalıştırılarak teyit edilebilir ve doğrusallaştırılmış ürünün boyutu DNA merdivenleri ile teyit edilebilir ve kesilmemiş plazmid ile karşılaştırıldığında.
Üretim süreçleri oda yüksekliğinde küçük farklılıklara yol açabilir, bu nedenle aynı kesme gerilimini elde etmek için her oda için akış hızı hesaplanmalıdır. Memeli endotel hücrelerinde laminar kesme stresi içeren deneyler için, ateş böceği luciferase RNA eksojen RNA spike-in olarak kullanılabilir. Endojen referans geninin normalleştirilmesi, eksojen referans geni ve hem endojen hem de eksojen referans genlerinin birlikte normalleştirilmesi benzer sonuçlar verir.
Not, her deney için bir Pascal'da kesme gerilimi olan aynı anda çalışan iki akış odasını kullanan bu temsili deneylerde, SI-RNA ile ikinci faktör gibi Kruppel, test edilen biyolojik numuneler arasında benzer bir nakavt verimi vermiştir. Bu yordamı denerken slaytta eşit bir hücre katmanı kurmayı ve akış odasını takmadan önce akış döngüsü sistemini bolca kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, RNA dizilemesi gibi diğer yöntemler genom geniş RNA ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılabilir ve DNA ve protein gibi diğer okumalar daha ileri moleküler analiz için kullanılabilir.
Bu teknik, gelişiminden sonra endotel biyolojisi alanında araştırmacıların insan endotel hücrelerinde kesme stresi ve anjiyojenik potansiyel arasındaki ilişkiyi keşfetmelerinin yolunu açmıştır.
