この方法は、血管がアテローム性動脈硬化症の発症に地域差を持つ理由など、内皮生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、せん断応力または複数のせん断応力条件下での複数の条件の同時研究を可能にすることです。この技術の意味は、様々な流量およびパターンを使用することができるため、動脈系および静脈系の両方における内皮遺伝子調節の理解にまで及ぶ。
ここでは、安定した層流を使用するシステムを示します。セットアップは乱れた流れを含む他の流れパターンのために合わせることができる。一般に、この方法に新しい個人は、実験の期間中、細胞の連続的な単層を維持し、実験間の一貫した結果を得るために苦労します。
分析の24時間前に、ヒト内皮細胞を早期通過で数え、4ウェル細胞培養プレートのウェル当たりのフィブロネクチンコーティングガラススライド1ミリリットルに約10〜6番目の細胞を播種する。セルを37°Cで15分間スライドに付着させます。その後、各スライドを3ミリリットルの培地で覆い、24時間摂氏37度の細胞培養インキュベーターと5%CO2のプレートを入れます。
実験当日は、大きく加熱されたビルトイン環境の水トレイに、調整可能なCO2と熱、またはビーチインキュベーターを複数の棚、内部電気アクセス、ガラスドアで満たし、実験に十分な二酸化炭素が利用可能であり、CO2モニターが機能していることを確認します。フローチャンバーを設定するには、1/8インチのメスのルアーを16本のソフトチューブの一端に挿入し、4ウェイストップコックをルアーに取り付けます。チューブのフリーエンドをトッププレートの流入側に取り付け、1/8インチの男性ルアーを2番目の番号16のソフトチューブの一端に挿入します。
男性のルアーに4ウェイストップコックを取り付け、チューブのフリーエンドをトッププレートの流出側に取り付けます。1/8インチの男性ルアーと1/8インチの女性のルアーを3番目の番号16ソフトチューブの両端に挿入し、1/8インチの男性ルアーを介してバブルトラップにチューブを取り付けます。その後、女性のルアーを介してチューブの反対側に4ウェイストップコックを取り付けます。
滅菌ピンセットを使用して、1つの細胞播種ガラススライドを底板の凹部に移し、細胞シードサイドを上に置く。10ミリリットルのシリンジを使用して、プレートの周りの赤いガスケットライン内の底板に10ミリリットルの温かい媒体を加えます。媒体がスライドを通って流れ、細胞を覆うことを可能にする。
側面を揃え、プレートをしっかりとねじ込むのに注意して、トッププレートを底板にそっと置きます。気泡トラップから気泡を除去するには、まず流入とバブルトラップストップコックを開き、流出栓を閉じます。その後、30ミリリットルのシリンジを使用して、プレートを通して20ミリリットルの暖かい媒体を静かに洗い流します。
チャンバーから泡を取り除くには、バブルトラップの栓コックを閉じ、流出栓コックを開きます。チャンバーの流出側を45度の角度に引き上げ、30ミリリットルのシリンジを使用して、チャンバーの流入側から20ミリリットルの温かい媒体を静かに洗い流します。流れの方向に適切な速度でフラッシュし、顕微鏡を使用して細胞のコンフルエント単層が層流に曝される前に残っていることを確認することが重要です。
次に、チャンバーとキャップの両側の栓を閉じ、細胞がまだ軽い顕微鏡の下でスライドに取り付けられていることを確認します。フローチャンバーと以前に組み立てられたフローループシステムをビーチに配置し、ポンプを完全に一時停止する前に、流ループアセンブリのポンプ速度をゆっくりと低下させます。フローループシステムのストップコックを閉じて漏れを防ぎ、ストップコックを介してチャンバーとループシステムを接続します。
すべてのループが接続されたら、すべてのストップコックを再び開き、ポンプ速度をゆっくりと向上させ、漏れや閉塞のセットアップを監視します。流れの方向に向いているセンサーとチャンバーの流入側のチャンバーブリッジチューブに流れセンサーを置き、関心のあるせん断応力率のための流量を得るためにポンプ速度を調整する。その後、CO2タンクをオンにして5%C02濃度を達成します。
実験フロー期間が完了したら、蠕動ポンプの速度をゼロにして電力をオフにします。すぐにすべてのオープンストップコックを閉じて、チャンバーと取り付けられたチューブを両側のストップコックでクリーンベンチトップに移します。慎重にすべてのネジを外してトッププレートを取り外し、針の鼻ピンセットを使用して、ガラススライドを底板から直径100ミリメートルの皿に移します。
スライドを冷たいPBSの10ミリリットルで洗い、顕微鏡下で細胞をチェックして、細胞の付着と流れの方向の位置合わせを確認します。PBSを吸引した後、スライドをきれいな直径100ミリメートルの皿に移し、RNA抽出キットからβ-メルカプトエタノールの1/100分を補った350マイクロリットルのリシスバッファーをスライドに加えます。ポリエチレンブレードセルスクレーパーを使用して、スライドから細胞を削り取り、組織培養皿を傾けて、バッファーを底部に溜まらせます。
鉗子を使用してスライドを取り除き、細胞ライセートを氷の上の1.5ミリリットルのチューブにピペットします。次に、希釈したルシメラーゼRNAを10マイクロリットルの細胞ライセートに加え、標準的なプロトコルに従って下流のRNAを単離し、分析します。制限酵素を用いたルシファーゼプラスミドの線形化は、消化された製品をアガロースゲルで実行することで確認でき、また、DNAラダーで、かつノーカットプラスミドと比較して、リニアライズされた製品のサイズを確認することができます。
製造工程はチャンバ高の小さな変動を招く可能性があるため、同じせん断応力を達成するために各チャンバの流量を計算する必要があります。哺乳類の内皮細胞における層のせん断応力を取り入れた実験では、ホタルルシファーゼRNAを外因性RNAスパイクインとして使用することができる。内因性参照遺伝子の正規化は、外因性参照遺伝子、および内因性および外因性参照遺伝子の両方を合わせて、同様の結果をもたらす。
なお、これらの代表的な実験では、各実験に対して1つのパスカルでせん断応力を伴う2つの同時走行流室を使用して、SI-RNAを介した因子2ノックダウンのようなクルッペルは、試験された生物学的サンプル間で同様のノックダウン効率をもたらした。この手順を試みている間、スライド上の細胞の均一な単層を確立し、フローチャンバーを取り付ける前にフローループシステムを多用することを覚えておくことが重要です。この手順に従って、RNAシーケンシングのような他の方法は、ゲノムワイドRNA発現およびDNAおよびタンパク質などの他の読み出しを評価するために使用することができ、さらなる分子分析に使用することができる。
その開発後、この技術は、内皮生物学の分野の研究者がヒト内皮細胞におけるせん断応力と血管新生の可能性との関係を探求する道を開いた。
