Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia endotelial, como por que os vasos sanguíneos têm diferenças regionais no desenvolvimento da aterosclerose? A principal vantagem desta técnica é que permite o estudo simultâneo de múltiplas condições sob estresse de tesoura ou múltiplas condições de estresse de tesoura. As implicações dessa técnica se estendem para a compreensão da regulação genética endotelial nos sistemas arterial e venoso, pois várias taxas de fluxo e padrões podem ser usados.
Bem, aqui, demonstramos um sistema que usa fluxo laminar constante. A configuração pode ser adaptada para outros padrões de fluxo, incluindo fluxo perturbado. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão para manter uma monocamada contínua de células durante toda a duração do experimento e obter resultados consistentes entre experimentos.
24 horas antes da análise, conte as células endoteliais humanas em uma passagem inicial e semente aproximadamente uma vez 10 para a sexta células em um mililitro de médio em um deslizamento de vidro revestido de fibronectina por poço de uma placa de cultura celular de quatro poços. Deixe as células aderirem ao slide por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, cubra cada slide com três mililitros de médio e coloque a placa na incubadora de cultura celular de 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 24 horas.
No dia do experimento, encha a bandeja de água de um ambiente grande, aquecido e embutido com CO2 e calor ajustáveis, ou incubadora de praia, com várias prateleiras, acesso interno à eletricidade e portas de vidro, e confirme que o dióxido de carbono adequado está disponível para o experimento, e que o monitor de CO2 está funcional. Para configurar a câmara de fluxo, insira uma isca feminina de 1/8 polegada em uma extremidade de um tubo macio número 16, e conecte uma torneira de quatro vias à isca. Conecte a extremidade livre do tubo ao lado de entrada da placa superior e insira uma isca masculina de 1/8 polegada em uma extremidade de um segundo tubo macio número 16.
Conecte uma torneira de quatro vias à isca masculina, e conecte a extremidade livre do tubo ao lado de saída da placa superior. Insira uma isca masculina de 1/8 polegada e uma isca feminina de 1/8 polegada em cada extremidade de um terceiro tubo macio número 16, e conecte a tubulação a uma armadilha de bolhas através da isca masculina de 1/8 polegada. Em seguida, anexar uma torneira de quatro vias para o outro lado da tubulação através da isca feminina.
Usando pinças estéreis, transfira uma lâmina de vidro semeada de uma célula para o recesso na placa inferior, lado semeado celular para cima. Use uma seringa de 10 mililitros para adicionar 10 mililitros de média quente à placa inferior dentro da linha de junta vermelha ao redor da placa. Permitindo que o meio flua através do slide e cubra as células.
Coloque suavemente a placa superior sobre a placa inferior, tomando cuidado para alinhar os lados e aparafusar as placas firmemente. Para remover bolhas de ar da armadilha de bolhas, primeiro abra as torneiras de entrada e armadilha de bolhas e feche a torneira de saída. Em seguida, use uma seringa de 30 mililitros para lavar suavemente 20 mililitros de meio quente através da placa.
Para remover bolhas da câmara, feche a torneira da armadilha de bolhas e abra a torneira de saída. Eleve o lado de saída da câmara para um ângulo de 45 graus e use a seringa de 30 mililitros para lavar suavemente 20 mililitros de meio quente do lado de entrada da câmara. É importante lavar a uma taxa apropriada na direção do fluxo e usar microscópio para confirmar que uma monocamada confluente de células permanece antes de expor as células ao fluxo laminar.
Em seguida, feche as torneiras em ambos os lados da câmara e da tampa e confirme que as células ainda estão presas ao slide sob um microscópio leve. Coloque a câmara de fluxo e um sistema de loop de fluxo previamente montado na praia e diminua lentamente a velocidade da bomba do conjunto da alça de fluxo antes de pausar completamente a bomba. Feche as torneiras no sistema de loop de fluxo para evitar vazamentos e conecte o sistema de câmara e loop juntos através de torneiras.
Quando todos os loops tiverem sido conectados, reabra todas as torneiras e aumente lentamente a velocidade da bomba enquanto monitora a configuração para qualquer vazamento ou bloqueio. Coloque o sensor de fluxo na tubulação da ponte de câmara do lado de entrada da câmara com o sensor orientado na direção do fluxo e ajuste a velocidade da bomba para obter a taxa de fluxo para a taxa de estresse de cisalhamento de juros. Em seguida, ligue o tanque de CO2 para alcançar uma concentração de 5%C02.
Uma vez que o período de fluxo experimental esteja completo, diminua lentamente a velocidade da bomba peristáltica para zero e desligue a energia. Feche rapidamente todas as torneiras abertas e transfira a câmara e a tubulação anexada com uma torneira de cada lado para um banco limpo. Desaparafusar cuidadosamente todos os parafusos para remover a placa superior e usar pinças de nariz de agulha para transferir o deslizamento de vidro da placa inferior para um prato de 100 milímetros de diâmetro.
Lave o slide em 10 mililitros de PBS frio e verifique as células sob um microscópio para confirmar a adesão celular e o alinhamento na direção do fluxo. Depois de aspirar o PBS, transfira o slide para um prato limpo de 100 milímetros de diâmetro e adicione 350 microliters de tampão de lise suplementados com 1/100 de Beta-Mercaptoethanol de um kit de extração de RNA ao slide. Use um raspador de células com lâmina de polietileno para raspar as células do slide e inclinar o prato de cultura tecidual para permitir que o tampão se acumule na parte inferior.
Use fórceps para remover o slide e pipeta a célula lysate em um tubo de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, adicione 10 microliters de RNA de luciferase diluída ao lise celular para isolamento e análise de RNA a jusante de acordo com os protocolos padrão. Uma linearização bem sucedida do plasmídeo luciferase usando enzimas de restrição pode ser confirmada executando os produtos digeridos em um gel de agarose e o tamanho do produto linearizado pode ser confirmado com escadas de DNA e em comparação com um plasmídeo não cortado.
Os processos de fabricação podem levar a pequenas variações na altura da câmara, assim, a taxa de fluxo deve ser calculada para que cada câmara atinja o mesmo estresse de cisalhamento. Para experimentos que incorporam o estresse da tesoura laminar em células endoteliais de mamíferos, o RNA da luciferase de vagalume pode ser usado como um pico de RNA exógeno. A normalização do gene de referência endógeno, o gene de referência exógeno, e ambos os genes de referência endógenos e exógenos juntos produzem resultados semelhantes.
Note-se que, nestes experimentos representativos usando duas câmaras de fluxo simultaneamente funcionando com estresse de cisalhamento em um Pascal para cada experimento, Kruppel como o fator dois knockdown via SI-RNA produziu uma eficiência de knockdown semelhante entre as amostras biológicas testadas. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de estabelecer uma monocamada uniforme de células no slide e profuser o sistema de loop de fluxo antes de anexar a câmara de fluxo. Após esse procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de RNA, podem ser usados para avaliar a expressão de RNA de grande variedade de genomas e outras leituras, como DNA e proteína, podem ser usados para análises moleculares posteriores.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia endotelial explorarem a relação entre o estresse da tesoura e o potencial angiogênico nas células endoteliais humanas.
